大補(bǔ)陰丸治療2型糖尿病合并骨關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究

吳鑫宇，關(guān)子赫，張婷婷，周雪明

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

2型糖尿病合并骨關(guān)節(jié)炎是一種特殊類型骨關(guān)節(jié)炎，由于2型糖尿病患者血糖異常升高，機(jī)體會出現(xiàn)一系列炎癥表現(xiàn)，伴隨關(guān)節(jié)軟骨的退行性病變[1]。同時(shí)，骨關(guān)節(jié)炎會嚴(yán)重影響患者的運(yùn)動(dòng)生活能力，長期低運(yùn)動(dòng)量攝入體內(nèi)糖分無法通過能量消耗的渠道分解，患者對血糖的調(diào)控能力明顯減弱。2型糖尿病與骨關(guān)節(jié)炎互為因果惡性循環(huán)[2]，治療難度大，引起了廣大學(xué)者及醫(yī)務(wù)工作者重視。

臨床常用的2型糖尿病西醫(yī)用藥治療方案主要為降糖藥和胰島素治療[3]，骨關(guān)節(jié)炎西醫(yī)治療方案主要有消炎止痛、營養(yǎng)軟骨以及關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物。然而針對2型糖尿病合并骨關(guān)節(jié)炎目前西醫(yī)并沒有公認(rèn)推薦的治療方案[4]。臨床中治療該病可采取中醫(yī)藥進(jìn)行干預(yù)，并收到了良好的療效[5]，大補(bǔ)陰丸作為治陰虛火旺的主方，臨床中可用以治療2型糖尿病合并骨關(guān)節(jié)炎，但目前尚缺少作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)配合化學(xué)損傷法獲得2型糖尿病合并骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型。以二甲雙胍作為陽性對照藥，二甲雙胍是一線口服降糖藥，廣泛應(yīng)用于2型糖尿病臨床治療中[6]，二甲雙胍能夠降低軟骨細(xì)胞增殖分化活性，有治療骨關(guān)節(jié)炎的作用[7]。以大補(bǔ)陰丸為實(shí)驗(yàn)藥物，大補(bǔ)陰丸可滋腎陰，降相火，從腎論治本病，以減輕患者臨床癥狀。比較用藥前后大鼠隨機(jī)血糖、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的變化，為大補(bǔ)陰丸治療2型糖尿病合并骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量(200±20)g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號：SYXK(黑)2013-012，飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境濕度(45±5)%，溫度(23±2)℃，在實(shí)驗(yàn)前普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，給予大鼠12 h晝夜交替照明，自由攝食及飲水。

1.2 藥物及制備

大補(bǔ)陰丸中藥物購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，大補(bǔ)陰丸由熟地黃18 g，炙龜板18 g，黃柏12 g，知母12 g組成，上述生藥加6倍量水浸泡2 h，炙龜板先煎20 min，再納入其余藥物，武火加熱煮沸后，文火煎煮30 min，用紗布濾出藥液，藥渣再加3倍水，煎煮30 min，過濾，2次藥液合并，濃縮得到所需濃度的水煎劑，置于4 ℃冰箱中保存待用。高脂高糖飼料制備：豬油、雞蛋黃粉、膽固醇、膽酸鹽及基礎(chǔ)飼料，分別按15%、10%、2%、0.4%、72.6%的配比制得高脂高糖飼料。鹽酸二甲雙胍片(萬全萬特制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H35020664)，以蒸餾水溶解鹽酸二甲雙胍片并配制成所需濃度，置于4 ℃冰箱中保存待用。

1.3 主要試劑及儀器

羅氏血糖儀、血糖試紙(批號：07124112，羅氏)；全自動(dòng)生化分析儀(7180)；顯微攝影成像系統(tǒng)(moticam 3000)；德國萊卡切片機(jī)(LEICARM 2135)；鏈脲佐菌(購于美國Sigma公司)；單碘乙酸(上海源葉生物科技有限公司)；基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)(Bioss公司)。

1.4 方法

1.4.1 造模、分組及給藥

將50只大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為空白組、模型組、陽性藥組(二甲雙胍)、大補(bǔ)陰丸高劑量組及大補(bǔ)陰丸低劑量組?？瞻捉M大鼠腹腔注射生理鹽水70 mg/kg，以普通飼料喂養(yǎng)。其余各組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)70 mg/kg，以高脂高糖飼料喂養(yǎng)3 d，空腹8 h，尾靜脈采血，連續(xù)采血2 d，隨機(jī)血糖均≥11.1 mmol/L視為2型糖尿病模型成功。采用化學(xué)損傷法造關(guān)節(jié)炎模型[8]，配制40 mg/mL單碘乙酸溶液，彎曲大鼠左膝關(guān)節(jié)，使關(guān)節(jié)間隙充分顯露，除空白組外其余各組大鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射50 μL單碘乙酸溶液誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎，空白組大鼠左膝關(guān)節(jié)注射等量生理鹽水。造模成功后，于次日進(jìn)行給藥，其中空白組和模型組給予生理鹽水灌胃，依據(jù)人-大鼠體表面積公式折算，陽性藥大鼠給藥量為0.14 g/(kg·d)，大補(bǔ)陰丸成人每日服藥量作為大鼠低劑量，大補(bǔ)陰丸低劑量組大鼠給藥量為1.62 g/(kg·d)，高劑量給藥量為低劑量的2倍，大補(bǔ)陰丸高劑量組大鼠給藥量為3.24 g/(kg·d)。每日上午灌胃1次，連續(xù)灌胃6周。

1.4.2 樣本采集

分別于用藥前及藥物治療2周、4周及6周后采血。末次給藥24 h后，用10%的水合氯醛于大鼠腹腔內(nèi)注射給藥麻醉，注射劑量為4 mL/kg，頸總動(dòng)脈取血，于4 ℃靜置1 h后，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，-20 ℃保存，以備血清學(xué)檢測。每只大鼠左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入生理鹽水500 μL，將生理鹽水與關(guān)節(jié)液混勻，然后再抽取關(guān)節(jié)液，3 000 r/min離心10 min，取上清液，置于-20 ℃待檢測，剝離大鼠左膝關(guān)節(jié)置于4%多聚甲醛內(nèi)固定。

1.4.3 血糖儀檢測大鼠血糖

大鼠尾靜脈取血，用血糖儀分別檢測第0周、第2周、第4周及第6周隨機(jī)血糖值。

1.4.4 免疫組化檢測大鼠骨關(guān)節(jié)中MMP-3含量

將已固定的關(guān)節(jié)標(biāo)本取出，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋待用。進(jìn)行免疫組化兩步法，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片、切片，顯微鏡下觀察。

1.4.5 qRT-PCR檢測大鼠關(guān)節(jié)液中IL-6、TNF-α及TGF-β1 mRNA表達(dá)水平

以Trizol法提取總RNA，然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。以qRT-PCR技術(shù)檢測IL-6、TNF-α及TGF-β1 mRNA表達(dá)水平情況。反應(yīng)結(jié)束后，得出CT值，并計(jì)算基因相對表達(dá)量。引物序列信息如表1。

表1 PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠治療前后血糖數(shù)值

空白組大鼠血糖數(shù)值在正常值范圍，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程血糖基本保持穩(wěn)定，其余各組大鼠第0周隨機(jī)血糖數(shù)值符合糖尿病大鼠標(biāo)準(zhǔn)(≥11.1 mmol/L)，此動(dòng)物模型可靠。空白組與其余各組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各給藥組自第2周起與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。隨著給藥過程持續(xù)進(jìn)行，各給藥組大鼠血糖均趨于或恢復(fù)正常數(shù)值,見表2。

表2 各組大鼠治療前后血糖的比較

2.2 各組大鼠治療后骨關(guān)節(jié)中MMP-3含量

比較各組大鼠治療后骨關(guān)節(jié)中MMP-3含量，空白組MMP-3表達(dá)量最低，其余各組與空白組相比均有所升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中模型組升高最為顯著，其余各給藥組與模型組相比均有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，見表3。MMP-3表達(dá)陽性的細(xì)胞質(zhì)顏色呈棕黃色，由圖1可見，空白組大鼠骨關(guān)節(jié)中有極其少量的陽性細(xì)胞，而模型組棕黃色染色較多，各用藥組與模型組相比棕染細(xì)胞減少。

圖1 各組大鼠治療后骨關(guān)節(jié)MMP-3檢測情況(×400)

表3 各組大鼠治療后骨關(guān)節(jié)中MMP-3含量

2.3 各組大鼠治療后關(guān)節(jié)液中IL-6、TNF-α及TGF-β1 mRNA表達(dá)量

比較各組大鼠治療后關(guān)節(jié)液中IL-6、TNF-α及TGF-β1 mRNA表達(dá)量，空白組以上3組指標(biāo)表達(dá)量最低，與其余各組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。模型組表達(dá)量最高，給藥組與模型組比較均有所降低，其中各給藥組與模型組相比IL-6 mRNA表達(dá)量下降更為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各給藥組TNF-α mRNA表達(dá)量與模型組相比有所下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。各給藥組TGF-β1 mRNA表達(dá)量與模型組相比有所下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)液中IL-6、TNF-α及TGF-β1 mRNA表達(dá)結(jié)果

3 討論

通過分析2型糖尿病合并骨關(guān)節(jié)炎的病因病機(jī)及證候表現(xiàn)，中醫(yī)可將其歸屬于“骨痹”“骨痿”的范疇。糖尿病總的病機(jī)是陰虛燥熱[9]，病本在腎，腎精虛衰，無以生髓，骨失滋養(yǎng)，骨枯髓減，則可見骨關(guān)節(jié)病變[10]。大補(bǔ)陰丸出自《丹溪心法》該方由元代著名醫(yī)學(xué)家朱丹溪?jiǎng)?chuàng)立，以熟地黃、炙龜板為君藥，熟地黃滋補(bǔ)真陰，益精填髓；炙龜板滋陰潛陽，補(bǔ)腎健骨，兩藥相合，共奏補(bǔ)陰固本，滋水制火之效。知母、黃柏為臣藥，可清降陰虛之火，清熱消炎。全方滋陰補(bǔ)腎為主，降火清源為輔，為補(bǔ)瀉并施之方。2型糖尿病合并骨關(guān)節(jié)炎患者可見口干體瘦，骨蒸肉爍，關(guān)節(jié)部位活動(dòng)不利，疼痛等癥狀表現(xiàn)[11]。中醫(yī)認(rèn)為治病必求于本，故治宜以補(bǔ)陰清熱之法，針對本病的病因病機(jī)大補(bǔ)陰丸可起到治療作用。

糖尿病患者持續(xù)在高糖狀態(tài)下會出現(xiàn)不同程度的炎癥反應(yīng)，而骨關(guān)節(jié)炎作為一種常見的無菌性炎癥，可由糖尿病誘發(fā)。臨床診療案例顯示，合并糖尿病的骨關(guān)節(jié)炎臨床治愈難度更大[12]。高糖環(huán)境刺激下軟骨細(xì)胞會產(chǎn)生過量MMPs，導(dǎo)致關(guān)節(jié)液中MMPs及其他破壞性酶含量和活性顯著增加，MMPs增加會引起膠原降解和蛋白多糖丟失，破壞膠原網(wǎng)架結(jié)構(gòu)及軟骨基質(zhì)的穩(wěn)定。其中MMP-3是MMPs家族中促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解的重要因子，可以促進(jìn)軟骨基質(zhì)中蛋白多糖的降解，并激活膠原蛋白酶，從而促進(jìn)Ⅱ型膠原降解[13]，并且MMP-3是關(guān)節(jié)液中可以反映關(guān)節(jié)軟骨代謝的特定物質(zhì)，臨床常以MMP-3含量判斷骨關(guān)節(jié)炎軟骨病變的程度[14]。高糖可通過多種途徑誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)增加，主要表現(xiàn)為TNF-α、IL-6等炎癥因子水平異常升高[15]。TNF-α是一種重要的炎癥反應(yīng)感受調(diào)節(jié)器，參與細(xì)胞的傳遞與合成。TNF-α還可以促進(jìn)破骨細(xì)胞的骨吸收，誘導(dǎo)骨母細(xì)胞釋放破骨細(xì)胞因子，同時(shí)促進(jìn)軟骨細(xì)胞釋放膠原酶，破壞骨細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境[16]。在TNF-α的作用下，關(guān)節(jié)組織局部的血管內(nèi)皮細(xì)胞被激活，血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)TNF-α刺激后，通透性增高，部分炎性細(xì)胞游出，導(dǎo)致局部組織炎性反應(yīng)加重，增加其他炎性細(xì)胞因子及骨與軟骨破壞酶的表達(dá)，同時(shí)TNF-α刺激血管擴(kuò)張，局部血流增加，也促使局部炎癥反應(yīng)表現(xiàn)增強(qiáng)[17]。IL-6活性與關(guān)節(jié)炎程度相關(guān)，關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液、血清和滑膜細(xì)胞培養(yǎng)液中可均檢測出具有非常高活性的IL-6[18]?；罨腎L-6可增強(qiáng)TNF-α活性，與TNF-α共同作用促進(jìn)炎癥進(jìn)展。TGF-β1既參與炎癥反應(yīng)，又可以促進(jìn)組織修復(fù)[19]。TGF-β1可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，增強(qiáng)血管通透性，使血漿滲出增多，局部腫脹表現(xiàn)嚴(yán)重，并刺激單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)。當(dāng)炎癥反應(yīng)進(jìn)行一段時(shí)間后，TGF-β1表現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)作用，即調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化，抑制炎癥反應(yīng)，抑制膠原、胞外基質(zhì)和蛋白多糖細(xì)的降解，參與關(guān)節(jié)修復(fù)和重建[20]。

研究結(jié)果顯示，大補(bǔ)陰丸可有效平穩(wěn)地降低糖尿病大鼠血糖，減低實(shí)驗(yàn)大鼠骨關(guān)節(jié)中MMP-3含量，減少關(guān)節(jié)液中IL-6、TNF-α及TGF-β1 mRNA表達(dá)量。即在控制血糖的同時(shí)降低了炎癥因子表達(dá)，減輕骨關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)。因此，筆者推測大補(bǔ)陰丸在臨床中發(fā)揮治療2型糖尿病合并骨關(guān)節(jié)炎的作用是通過影響MMP-3、IL-6、TNF-α及TGF-β1等相關(guān)因子實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)雖在一定程度上說明了大補(bǔ)陰丸治療2型糖尿病合并骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)理，但實(shí)驗(yàn)中并未表現(xiàn)出本藥與陽性藥相比的優(yōu)勢。后續(xù)研究欲觀察大補(bǔ)陰丸對大鼠其他生理指標(biāo)改善情況，尋找中藥治療的優(yōu)點(diǎn)，并進(jìn)一步驗(yàn)證該藥對炎癥相關(guān)通路的作用機(jī)制。加入中西藥聯(lián)合應(yīng)用實(shí)驗(yàn)組，觀察聯(lián)合用藥是否可起到增效并降低副作用的效果。