不同三萜類中藥成分藥聯(lián)合阿莫西林對呼吸道感染幼鼠的作用及免疫學(xué)機制

蘇圓， 雍海月， 王勤

(江蘇省腫瘤醫(yī)院 藥學(xué)部， 江蘇 南京 210009； 江蘇省腫瘤防治研究所 藥學(xué)部， 江蘇 南京 210009； 南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 藥學(xué)部， 江蘇 南京 210009)

小兒呼吸道細菌感染(infantile respiratory infection，IRI)是臨床上常見的一種感染性疾病，感染可直接或繼發(fā)于病毒感染之后，病原菌調(diào)查顯示常見的細菌有肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌等[1]。小兒呼吸系統(tǒng)發(fā)育不完全，免疫系統(tǒng)不完善，感染后較難自愈，且病情反復(fù)遷延，影響兒童的生長發(fā)育[2]。近5年治療小兒呼吸道感染臨床數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，阿莫西林(amoxicillin，Amo)聯(lián)合清熱型中成藥如小兒豉翹清熱顆粒、小兒清肺化痰顆粒等，治療小兒呼吸道感染效果優(yōu)于單藥治療，目前的聯(lián)用機制研究多從炎癥通路的角度闡釋[3]，但免疫學(xué)角度的分析尚處于實驗現(xiàn)象解釋階段。中藥三萜類成分諸如靈芝三萜、熊果酸及雷公藤三萜等具有明確的干預(yù)體內(nèi)巨噬細胞極化的作用，此類性質(zhì)與抗炎、抗腫瘤等活性有密切的關(guān)聯(lián)[4]，然而其介導(dǎo)的巨噬細胞極化作用協(xié)同Amo治療呼吸道感染的可行性及潛在機制研究尚不多見。因此，本研究擬以巨噬細胞極化作用為切入點，通過幼鼠開喉滴入克雷伯菌混懸液法構(gòu)建呼吸道感染模型，以病理切片、炎癥因子、各類免疫細胞數(shù)量及巨噬細胞特征標志物為考察指標，評價靈芝三萜、熊果酸兩類中藥三萜成分單獨或與阿莫西林聯(lián)合使用治療幼鼠呼吸道感染的可行性，以及2種中藥成分介導(dǎo)的不同巨噬細胞極化過程對Amo治療幼鼠呼吸道感染作用的影響和潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物和菌株來源 40～50 d的Sprague Dawley(SD)幼鼠42只，雌雄各半，體質(zhì)量130～150 g，由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供[實驗動物許可證號SCXK(蘇)2017-0007]；動物于室溫(23±2)℃，相對濕度為60%～80%的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后實驗；肺炎克雷伯菌購自中科院微生物所，實驗前配制成終濃度為1.5×109CFU備用。

1.1.2主要藥物和試劑 Amo(先聲藥業(yè))；靈芝酸B(純度>98%)和熊果酸(純度>99%，南京阿仙奴)，水合氯醛(使用時配制成10%溶液，北京北化精細化學(xué))，白細胞介素-2(interleukin 2, IL-2)、IL-6、IL-10及IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗盒(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA；上海源葉生物)，鼠抗別藻青蛋白耦聯(lián)的CD206(allophycocyanin-conjugated CD206, APC-CD206)和藻紅蛋白耦聯(lián)的CD86(phycoerythrin-conjugated CD86, PE-CD86)單克隆抗體(美國Biolegend)，多色T細胞標志物組合[異硫氰基熒光素標記的CD3(fluorescein isothiocyanate-conjugated CD3，F(xiàn)ITC-CD3)、藻紅蛋白耦聯(lián)的CD4(phycoerythrin-conjugated CD4，PE-CD4)、別藻青蛋白耦聯(lián)的CD8(allophycocyanin-conjugated CD8, CD8-APC)抗體及異硫氰基別藻青蛋白耦聯(lián)的CD19B(isothiocyanate allophycocyanin-conjugated CD19B, IAPC-CD19B)細胞標志物抗體(美國Abcam)]，其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3主要儀器 酶標儀(Thermo MK3)和CELL-DYNl600全自動血液分析儀(雅培)，DG3090洗板機(南京華東電子)，X-15R離心機(美國BECKMAN ALLEGRA )，XW-80A漩渦混合器(江蘇海門麒麟)，移液器(美國Eppendorf)，DHG9030A電熱恒溫箱(上海般諾生物)，CytoFLEX流式細胞儀(英國BECKMAN COULTER)。

1.2 研究方法

1.2.1造模[5]和分組 42只SD幼鼠隨機均分為正常(Normal)組、模型(Model)組、Amo組、熊果酸(ursolic acid，UA)組、靈芝酸B(ganoderic acid B，GA-B)組、Amo+UA組及Amo+GA-B組，Normal組幼鼠不作任何灌注手術(shù)處理，其余6組幼鼠按下述方式灌注造模：10%水合氯醛4 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)板，使手術(shù)板(幼鼠頭部)與水平面保持約30 °，開口器撐開幼鼠口腔暴露咽喉部，用一接注射器的鈍圓針頭經(jīng)口插入氣管，滴入含1×107CFU對數(shù)生長期的肺炎克雷伯菌混懸液0.2 mL，手術(shù)板垂直豎起并保持1 min，保證氣管內(nèi)菌懸液由于重力作用流入幼鼠的支氣管和肺泡內(nèi)；以后續(xù)肺組織病理切片、炎癥因子和血常規(guī)等結(jié)果驗證造模是否成功。各組灌胃給藥方案為：Amo組 1 mg/kg，UA組和GA-B組為5、3 mg/kg，1次/d，連續(xù)給藥7 d；Amo+UA組和Amo+GA-B組幼鼠均為同時給藥、劑量同給單藥組；Normal組和Model組幼鼠為同體積的生理鹽水灌胃處理。治療期間各組幼鼠自由飲水及進食。給藥前和給藥7 d結(jié)束時，麻醉狀態(tài)下取各組幼鼠眼眶血分別用于后續(xù)的血常規(guī)、炎癥因子及免疫細胞測定；取眼眶血后斷頸處死各組幼鼠取肺臟后續(xù)實驗使用。

1.2.2蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin，HE)[6]觀察幼鼠肺組織學(xué)特征 取“1.2.1”項下各組幼鼠部分肺組織，制備石蠟塊，切成厚度10 μm組織切片，梯度乙醇溶液脫蠟后，HE染色，光學(xué)顯微鏡下(100×)觀察組織病變情況。

1.2.3血常規(guī)分析 取“1.2.1”項下給藥前和給藥7 d結(jié)束時各組幼鼠眼眶血0.8 mL肝素抗凝，采用全自動血液分析儀檢測白細胞(white blood cells，WBC)、血紅蛋白(hemoglobin，HGB)、紅細胞(red blood cells，RBC)及超敏反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CPR)。

1.2.4炎癥因子測定 取“1.2.1”項下給藥7 d結(jié)束時各組幼鼠眼眶血0.8 mL，置于EP管靜止30 min，3 000 r/min離心10 min，檢測血清IL-2、IL-6、IL-10及IL-1β水平。

1.2.5巨噬細胞提取和表型測定[7]采用肺泡灌洗法提取幼鼠肺組織周圍的巨噬細胞。對部分肺行支氣管肺泡灌洗，支氣管插管灌入無菌生理鹽水，8 mL/次、5次；收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)于EP管中，3 000 r/min離心10 min，上清液-80 ℃保存待檢，沉淀用RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮，計數(shù)細胞，調(diào)整細胞濃度為1×109個/L，置6孔細胞培養(yǎng)板中，于37 ℃、5%CO2中培養(yǎng)3 h；待細胞貼壁后，用RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗3次，棄非貼壁細胞，含0.5%EDTA胰酶消化下貼壁細胞，3 000 r/min離心10 min，制備得到高純度的肺泡巨噬細胞；取1×105個肺泡巨噬細胞，4%多聚甲醛0.1 mL室溫固定15 min，3 000 r/min離心2 min；取細胞沉淀，0.1%Triton X-100 PBS溶液和1%BSA PBS溶液分別通透和封閉30 min，APC-CD206 抗體和PE-CD86 抗體4 ℃孵育過夜，流式細胞儀檢測相應(yīng)通道的熒光強度；CD206和CD86 陽性細胞分別代表M2型和M1型巨噬細胞。

1.2.6T淋巴(T lymphocyte，T)和B淋巴(B lymphocyte，B)細胞分型測定[8-9]取“1.2.1”項下各組幼鼠眼眶血0.5 mL，置于含肝素鈉的試管，3 000 r/min離心10 min，制備得到血細胞樣本；室溫用裂解緩沖液(含NH4Cl 41.45 g、NaHCO35 g及0.5 mmol/L EDTA 1 mL)5 mL溶解RBC 20 min；PBS 1 mL洗滌2次，所制得的細胞分別用多色T細胞標志物組合抗體10 μL和APC-CD19 B細胞標志物5 μL抗體染色，避光反應(yīng)20 min，3%流式標準(flow cytometry standard，F(xiàn)CS)細胞分選緩沖液洗滌2次，懸浮后用流式細胞儀檢測相應(yīng)熒光通道的細胞比例；其中，CD3+代表總T細胞，CD4+代表T輔助細胞，CD8+代表T效應(yīng)細胞，CD19+代表B細胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肺組織學(xué)特征

Normal組幼鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無明顯炎癥細胞浸潤及充血現(xiàn)象；Model組幼鼠肺組織以小支氣管為中心呈灶狀分布，支氣管壁多處充血，管腔內(nèi)大量炎癥細胞浸潤，以中性粒細胞為主，肺泡腔變圓，輕度擴張；Amo組幼鼠肺組織支氣管壁充血明顯減輕，但管腔內(nèi)仍見少量炎癥細胞浸潤；GA-B組幼鼠肺組織支氣管壁充血有不同程度的減輕，但炎癥細胞浸潤程度高于Amo組；UA組和Amo+UA組幼鼠肺組織支氣管壁仍見充血；Amo+GA-B組幼鼠肺組織支氣管腔形態(tài)基本正常，未見明顯的炎癥細胞浸潤或充血現(xiàn)象。

圖1 各組幼鼠治療7 d時肺組織學(xué)特征(HE，×100)Fig.1 The lung pathological section of rat pups after 7 days of treatment (HE，×100)

2.2 血常規(guī)

血常規(guī)主要指標比較結(jié)果表明，與同組治療前比較，Amo組、GA-B組、Amo+GA-B組幼鼠治療后WBC數(shù)量和CPR水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與治療前Normal組相比，Model組、Amo組、GA-B組、UA組、Amo+GA-B組、Amo+UA組幼鼠治療前WBC數(shù)量和CPR水平均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與治療后Normal組相比，Model組、UA組、Amo+UA組幼鼠治療后WBC數(shù)量和CPR水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與治療后Model組相比，Amo組、GA-B組、Amo+GA-B組幼鼠治療后WBC數(shù)量和CPR水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與治療后Amo組相比，UA組、Amo+UA組幼鼠治療后WBC數(shù)量和CPR水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；各治療組幼鼠治療前、后RBC與HGB水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組幼鼠治療前、后的血常規(guī)主要指標Tab.1 Blood test of rat pups before and after treatment

2.3 血清炎癥因子IL-2、IL-6、IL-10及IL-1β水平

結(jié)果表明，與Normal組相比，Model組、Amo組、GA-B組、UA組及Amo+UA組幼鼠血清炎癥因子IL-2水平升高，Model組和UA組幼鼠血清炎癥因子IL-6水平升高，Model組、Amo組、GA-B組及UA組幼鼠血清炎癥因子IL-10和IL-1β水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與Model組相比，除UA組IL-2外(P>0.05)，各組幼鼠血清炎癥因子IL-2、IL-6、IL-10及IL-1β等水平均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與Amo組相比，Amo+GA-B組幼鼠血清炎癥因子IL-2、IL-10及IL-1β水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組幼鼠治療后血清炎癥因子IL-2、IL-6、IL-10及IL-1β水平Tab.2 Level of serum IL-2,IL-6,IL-10, and IL-1β of rat pups after

2.4 巨噬細胞表型

結(jié)果表明，與Normal組比較，Model組、Amo組、UA組及Amo+UA組幼鼠BALF中PE-CD86熒光值升高、APC-CD206熒光值降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與Model組比較， GA-B組及Amo+GA-B組幼鼠BALF中PE-CD86熒光值降低、APC-CD206熒光值升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：A、B分別為各組PE-CD86和APC-CD206的熒光信號；(1)與Normal組比較，P<0.05；(2)與Model組比較，P<0.05。圖2 各組幼鼠治療后BALF中PE-CD86和APC-CD206熒光值Fig.2 Fluorescence values of PE-CD86 and APC-CD206 of BALF in each group of rat pups after treatment

2.5 血清CD3+、CD4+及CD8+水平

結(jié)果表明，與治療前相比，GA-B組、UA組、Amo+GA-B組和Amo+UA組幼鼠治療后 血清CD3+、CD4+及CD8+水平均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與Normal組、Model組及Amo組比較，GA-B組、UA組、Amo+GA-B組和Amo+UA組幼鼠治療后血清CD3+、CD4+及CD8+水平均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組幼鼠治療前、后血清CD3+、CD4+及CD8+的水平Tab.3 The level of CD3+,CD4+, and CD8+ in the plasma of rat pups before and after

2.6 血清B細胞水平

結(jié)果表明，同組幼鼠治療前、后血清CD19+(B細胞)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療前各組幼鼠血清CD19+(B細胞)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后各組幼鼠血清CD19+(B細胞)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組幼鼠前、后血清CD19+水平Tab.4 The level of CD19+ in the plasma of rat pups before and after

3 討論

小兒上呼吸道感染是臨床小兒常見病癥，其發(fā)病反復(fù)，治療周期長，目前臨床上首選藥物為Amo顆粒，但臨床療效不甚理想[10-11]。Amo是一種臨床上常用的半合成青霉素類抗生素，對大多數(shù)致病的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有強大的抑菌和殺菌作用，其機制是穿過細菌的細胞壁，內(nèi)酰胺鍵隨即水解并與胞內(nèi)轉(zhuǎn)肽酶共價連接，使細菌的細胞壁合成途徑受阻，細菌因滲透壓失衡無法存活[11-12]。這種以直接干預(yù)細菌生理活性為基礎(chǔ)的抗菌藥物，一般對機體的免疫功能無直接影響[10，12]。眾所周知，免疫系統(tǒng)對于細菌的侵入、炎癥的產(chǎn)生和恢復(fù)具有及其重要的影響[11]。巨噬細胞是免疫系統(tǒng)中一種重要的免疫細胞，在機體損傷初期，M1型巨噬細胞會大量募集于病灶部位，激活一系列復(fù)雜的炎癥通路；在機體損傷恢復(fù)階段，M2型巨噬細胞則會抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展，參與組織修復(fù)[13-15]。因此，本研究提出假想：提高M2型巨噬細胞的水平有助于Amo治療小兒上呼吸道感染。

為驗證這一假想，本研究選用2種不同的三萜類中藥成分GA-B和UA作為免疫干預(yù)組分。前期研究表明，這2種成分可分別提高M2型和M1型巨噬細胞的比例[4]。本研究首先在動物水平上建立幼鼠呼吸道炎癥模型，經(jīng)過3種單獨治療和2種聯(lián)合給藥方案治療后，觀察幼鼠肺部HE染色的病理切片；結(jié)合病理組織切片結(jié)果分析，Model組幼鼠肺組織小支氣管呈灶狀分布、氣管壁充血，管腔內(nèi)見炎癥細胞浸潤、肺泡腔變圓、有擴張，表明該方法可以成功造模[10]；Amo組幼鼠給藥后支氣管壁充血有明顯好轉(zhuǎn)，管腔僅見少量炎癥細胞浸潤；GA-B組幼鼠支氣管壁充血現(xiàn)象稍有減輕，但炎癥細胞浸潤高于Amo組；UA組幼鼠治療效果不如GA-B組。3種單獨治療組中Amo和GA-B可以一定程度上改善幼鼠肺部組織細菌感染癥狀，UA與模型組相比未見明顯改善；Amo+GA-B組幼鼠肺組織支氣管腔形態(tài)與Normal組類似，提示Amo和GA-B具有潛在的聯(lián)用增效效應(yīng)；Amo+UA組幼鼠肺部組織仍有明顯炎癥感染區(qū)域，提示該組合無上述聯(lián)合增效效應(yīng)。

血常規(guī)結(jié)果提示，模型組幼鼠WBC和CPR水平高于Normal組，提示模型建立成功；治療后Amo和GA-B組幼鼠WBC數(shù)量與Model組相比均有降低，但是UA組幼鼠WBC未見明顯下降；相應(yīng)各組幼鼠CPR也表現(xiàn)出的明顯降低，這些結(jié)果和趨勢與病理切片結(jié)果趨勢相一致。

巨噬細胞極化過程對Amo治療幼鼠肺部細菌感染方面有重要影響，降低M1極化，提高M2細胞表型比例可能促進抗生素的抗菌消炎療效發(fā)揮[16-17]。炎癥因子表達升高是細菌性呼吸道感染的重要標志[18]。炎癥因子ELISA結(jié)果表明，Model組幼鼠血清炎癥因子IL-2、IL-6、IL-10及IL-1β等水平升高，進一步提示模型構(gòu)建成功；Amo組和GA-B組幼鼠4種血清炎癥因子水平均有下降，從炎癥因子角度提示2組單獨治療可以緩解幼鼠炎癥程度；UA組幼鼠血清炎癥因子僅在IL-6和IL-10上有差異；當(dāng)Amo與GA-B聯(lián)用后，幼鼠血清IL-2、IL-10及IL-1β水平較Amo組降低，提示該聯(lián)用方案有聯(lián)合治療的潛力；但是Amo與UA聯(lián)用后的各炎癥指標與Amo單獨治療組相比無變化，提示該聯(lián)用方案無聯(lián)合增效效應(yīng)；定量分析來看，Amo+GA-B組幼鼠較Amo組在IL-2、IL-10及IL-1β上分別降低43.7%、27.1%及32.2%；巨噬細胞極化結(jié)果表明，經(jīng)過GA-B治療后，幼鼠BALF中的M2型巨噬細胞熒光信號相比Model組大幅提升，但M1型巨噬細胞比例顯著降低；而使用另一種中藥三萜UA治療后，M2型巨噬熒光信號相比Model組明顯降低，但M1表型升高明顯。相同的趨勢在各自聯(lián)合治療組中也被觀察到。結(jié)合前部分藥效學(xué)和血常規(guī)等結(jié)果分析，提示肺泡中的M2型巨噬細胞提升、M1型巨噬細胞降低，可能有助于協(xié)助Amo進行抗呼吸道感染的治療[19]。

通過組合T細胞抗體標記法，本研究定量分析了治療前、后T細胞總量、T輔助細胞和T效應(yīng)細胞。T細胞是體內(nèi)一類協(xié)助體液免疫和細胞免疫的重要免疫細胞[20-22]，根據(jù)其表面標志物分為CD3+/CD4+的T輔助細胞和CD3+/CD8+的T效應(yīng)細胞[23]；T輔助細胞可以增殖擴散來激活其它類型的產(chǎn)生直接免疫反應(yīng)的免疫細胞，通過調(diào)控或“輔助”其它淋巴細胞發(fā)揮功能[24]；T效應(yīng)細胞的功能就像一個“殺手”或細胞毒素，因其可對產(chǎn)生特殊抗原反應(yīng)的目標細胞進行殺滅[25]。因此，2種細胞比例的升高是體內(nèi)免疫功能提高的重要體現(xiàn)，也是殺傷致病菌，減輕炎癥的免疫保障。對于T細胞作用的評價，Amo組與Model組相比，無論是總T細胞數(shù)量，還是T輔助細胞、T效應(yīng)細胞數(shù)量均未發(fā)生改變。聯(lián)合治療組總T細胞的比例升高趨勢類似于三萜類單獨治療組，提示2種三萜類成分在提升T細胞數(shù)量和各亞型T細胞數(shù)量方面無差異。B細胞來源于骨髓造血干細胞，在體內(nèi)受抗原刺激后，分化增殖為漿細胞，合成抗體，發(fā)揮體液免疫的功能，與T細胞一樣屬于體內(nèi)重要的免疫細胞[26]。但是，本研究發(fā)現(xiàn)各治療組均不能提高血液中B細胞的比例。

綜上所述，GA-B與UA對巨噬細胞、T細胞和B細胞等主要免疫細胞的作用差異主要體現(xiàn)在對巨噬細胞極化作用的干預(yù)上；Amo+GA-B與Amo+UA兩種聯(lián)合治療的療效差異與三萜類化合物對巨噬細胞表型干預(yù)密切有關(guān)。本研究從巨噬細胞極化的角度出發(fā)，結(jié)果表明M2型巨噬細胞含量的提高有助于Amo治療幼鼠細菌性呼吸道感染，從而為誘導(dǎo)M2型巨噬細胞的免疫干預(yù)成分與抗生素聯(lián)合治療呼吸道感染提供更多可參考的用藥依據(jù)。