基于尿液代謝組學(xué)研究青蒿琥酯對慶大霉素誘導(dǎo)犬急性腎功能衰竭的保護(hù)機制

朱道仙 陸江 郝福星 吳植

摘要：為觀察青蒿琥酯對慶大霉素誘導(dǎo)犬急性腎功能衰竭尿液代謝物的調(diào)節(jié)作用及其機制。將24只泰迪型貴賓犬，隨機等分為3組：對照組（control組）、腎衰組（CRF組）和青蒿琥酯組（ART組）。除對照組，其他組犬采用注射慶大霉素建立急性腎功能衰竭模型。然后，ART組給予青蒿琥酯，對照組和CRF組給予相同體積生理鹽水。用生化分析儀測定肌酐（Cr）和尿素氮含量，用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）測定尿液中的代謝物水平。結(jié)果顯示，與CRF組比較，ART組血清Cr和尿素氮含量極顯著降低（P<0.01）;共有14種代謝物水平發(fā)生改變，其中，α-酮戊二酸、色氨酸、酪氨酸、琥珀酸、花生四烯酸、蘋果酸、檸檬酸及棕櫚酸等含量降低;葡萄糖酸、?；撬?、甘氨酸、肌酐、絲氨酸及甘油等含量升高。代謝通路分析發(fā)現(xiàn)共涉及三羧酸循環(huán)、甘氨酸代謝、酪氨酸代謝、色氨酸生物合成、谷胱甘肽代謝、甘油磷脂代謝及不飽和脂肪酸生物合成等7條代謝途徑。以上結(jié)果表明，青蒿琥酯可有效改善慶大霉素誘導(dǎo)犬急性腎功能衰竭，可能與調(diào)節(jié)脂代謝、氨基酸代謝和能量代謝等通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：青蒿琥酯;慶大霉素;犬;急性腎功能衰竭;尿液代謝組學(xué);代謝通路

中圖分類號：S858.292 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）02-0137-05

收稿日期：2021-05-07

基金項目：江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目（編號：JATS[2018]238）;江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院校級課題（編號：NSF201706）。

作者簡介：朱道仙（1978—），女，安徽壽縣人，碩士，講師，主要從事動物臨床營養(yǎng)及代謝病研究。E-mail：331802901@qq.com。

通信作者：陸 江，碩士，副教授，主要從事動物臨床營養(yǎng)及代謝病研究。E-mail：vetlj@163.com。

犬的急性腎功能衰竭是由多種病因引起的腎功能快速下降而出現(xiàn)的以氮質(zhì)血癥為特征的一種臨床綜合征，近年發(fā)病率逐漸升高。目前，常采取對癥治療、糾正酸堿平衡紊亂、維持殘腎功能等方法進(jìn)行治療，效果不一，部分動物病情惡化甚至死亡，尚無有效的治療方法。研究報道，對急性腎功能衰竭進(jìn)行早期干預(yù)可降低腎功能進(jìn)一步惡化的風(fēng)險[1-2]。青蒿琥酯（artesunate，ART）具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等作用[3]。大量研究表明，ART對多種原因引起的腎損傷具有保護(hù)作用[4-5]，然而其作用機制尚不明確。代謝組學(xué)是研究細(xì)胞、組織、器官或整個生命有機體代謝物（相對分子質(zhì)量在1 000以下）的組成及這些代謝產(chǎn)物在內(nèi)外因素刺激下動態(tài)變化的一門科學(xué)[6]。由于代謝組學(xué)側(cè)重于反映生物體內(nèi)真實的病理生理變化狀態(tài)，對藥物干預(yù)后的作用趨勢具有指導(dǎo)意義，目前代謝組學(xué)技術(shù)已在各系統(tǒng)疾病的研究中廣泛應(yīng)用[7]。因此，本研究擬采用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）的尿液代謝組學(xué)檢測方法，探討青蒿琥酯對慶大霉素誘導(dǎo)急性腎功能衰竭模型犬的干預(yù)作用，以期闡明青蒿琥酯防治犬急性腎衰竭的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

泰迪型貴賓犬，約4歲，體質(zhì)量（7±1） kg，雄性，江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院寵物美容犬房提供。

1.2 試驗設(shè)計

于2020年5月，選取24只泰迪型貴賓犬飼養(yǎng)于江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院實驗動物房，隨機等分為3組：對照組（control組）、腎衰組（CRF組）和青蒿琥酯組（ART組）。所有犬均以商品化成年犬糧（冠能成年犬犬糧，規(guī)格12 kg/袋，雀巢普瑞納寵物食品有限公司）進(jìn)行7 d適應(yīng)性飼喂后，除對照組，其他各組犬參考張萍等的方法[8]，每天09：00按照 40 mg/kg 體質(zhì)量肌肉注射硫酸慶大霉素注射液（購于天津藥業(yè)焦作有限公司），連續(xù)注射5 d，若血清肌酐（Cr）含量及臨床癥狀無明顯變化，則按 40 mg/kg 體質(zhì)量間隔12 h重復(fù)給藥，直至Cr含量>270 μmol/L，尿素氮含量升高，停止用藥，犬急性腎衰模型建立成功。對照組給予等量生理鹽水作為對照。然后，ART組犬按1 mg/kg體質(zhì)量肌肉注射青蒿琥酯注射液（購于哈爾濱市宏達(dá)動物藥品廠），CRF組和Control組給予等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)5 d。

1.3 血液腎功能指標(biāo)測定

分別于慢性腎衰造模前（0 d）、造模后（7 d）和試驗結(jié)束（12 d）時的08：00，空腹經(jīng)頭靜脈采集各組試驗犬的血液并制備血清，用M149928-全自動干式生化分析儀測定血清肌酐和尿素氮含量。

1.4 GC-MS法檢測尿液代謝物

1.4.1 尿液采集 試驗結(jié)束時，經(jīng)膀胱穿刺收集新鮮尿液后迅速置于-80? ℃保存，待測。

1.4.2 尿樣處理 參考孟欣等的方法[9]，將“1.4.1”節(jié)保存的尿液室溫下融化后，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min后取上清液。取上清液200 μL，加入20 μL脲酶，混合均勻于37 ℃培養(yǎng)箱中孵化反應(yīng) 20 min，加入 800 μL 冰冷色譜級乙醇，4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min，吸取200 μL上清液轉(zhuǎn)入高回收率玻璃衍生小瓶中，采用溫和氮氣吹干提取液。向干燥物中加入30 μL 20 mg/mL鹽酸甲氧胺吡啶溶液，37 ℃肟化反應(yīng)90 min。取出后繼續(xù)加入30 μL N，O-雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺（含1%三甲基一氯硅烷）的衍生試劑，密閉并于 70 ℃ 反應(yīng)60 min。取出樣本，室溫放置30 min，進(jìn)行GC-MS代謝組學(xué)分析。

1.4.3 GC-MS反應(yīng)條件 GC-MS試驗的儀器分析平臺為安捷倫7890A/5975C GC-MS系統(tǒng)，毛細(xì)管色譜柱為Agilent J&W Scientific公司的 HP-5 ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。程序升溫條件：初始柱溫60 ℃，保留1 min，以20 ℃/min升溫至320 ℃，保留4 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃，四極桿溫度150 ℃，高純氦氣作為載氣，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0 μL。質(zhì)譜條件：電離方式EI，碰撞能量為70 eV，離子源溫度280 ℃，離子傳輸線溫度250 ℃，溶劑延遲時間為4 min，掃描方式為全掃描，質(zhì)譜檢測范圍為50～600質(zhì)荷比（m/z）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

計量資料采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件ANOVA程序單因素方差分析（one-way ANOVA），并進(jìn)行多重比較（LSD）組間兩兩比較，同組不同時間點數(shù)據(jù)用重復(fù)測量數(shù)據(jù)資料方差分析比較。GC-MS所得的樣品數(shù)據(jù)通過m/z識別、匹配和歸一化等計算過程，得到矩陣，將其導(dǎo)入SIMCA-P 12.0軟件中進(jìn)行主成分分析（PCA），及偏最小二乘判別分析（PLS-DA），采用MetaboAnalyst網(wǎng)站（http：//www.metaboanalyst.ca/）進(jìn)行代謝物的代謝通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 腎功能指標(biāo)的變化

由圖1-a可知，7 d，CRF組和ART血中Cr濃度升高，超出生理閾值（紅色虛線），約為對照組的2.5倍;12 d，與CRF組比較，ART組Cr含量極顯著降低（P<0.01），與對照組比較，CRF組Cr含量極顯著升高（P<0.01）。由圖1-b可知，7 d，CRF組和ART血中尿素氮濃度升高，約為對照組的4倍;12 d，與CRF組比較，ART組尿素氮濃度極顯著降低（P<0.01）;與對照組比較，CRF組尿素氮濃度極顯著升高（P<0.01）。提示ART處理可以改善CRF模型犬的腎功能。

2.2 尿液代謝物的GC-MS總離子流圖的變化

對所有樣本的總離子流色譜圖進(jìn)行可視化檢查，顯示所有樣本的儀器分析具有信號強、峰容量大且保留時間重現(xiàn)性好等特點。各組以其中1個樣本的總離子流色譜圖為代表，由圖2可知，不同組間的總離子流色譜圖有較大差異。

2.3 多元分析組間差異

在Simca-P 11.0軟件中，采用默認(rèn)的UV格式化（unit variance scaling）和平均中心（mean-centered）處理，對各組代謝物進(jìn)行主成分分析（PCA），PCA得分圖（scores plot）見圖3-a，橫坐標(biāo)為第1主成分得分，用t[1]表示;縱坐標(biāo)為第2主成分得分，用t[2]表示，所有樣本處于95%置信區(qū)間（hotelling T2 ellipse）外，無異常樣本，PCA第1主成分（R2X1）與第2主成分（R2X2）總累積解釋率47.04%，為各組間的樣本點完全分離，各組內(nèi)樣本點聚集較好。與CRF組比較，ART有向?qū)φ战M回調(diào)趨勢。采用PLS-DA的多維統(tǒng)計分析方法分別對3組樣本進(jìn)行模型分析，由圖3-b可知，累積解釋率為75.53%，說明3組樣本間具有顯著代謝差異。對PLS-DA分析模式隨機置換200次，進(jìn)行置換檢測， R2=0.512， Q2=-0.056 8，提示本模型均有較好的穩(wěn)定性及可預(yù)測性且不存在過擬合現(xiàn)象，模型建立成功，見圖3-c。

2.4 差異代謝物篩選

由圖4-a可知，采用PLS-DA模型第1主成分得到VIP（variable importance in the projection）值（VIP>1）、t檢驗P值（P<0.05），并結(jié)合變化倍數(shù)log2（差異倍數(shù)）>4來尋找差異性代謝物。將潛在差異代謝物的二級譜圖與Metlin、HMDB及KEGG等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。與對照組比較，CRF組有16種差異代謝物，其中甘油、甘氨酸、肌酐、絲氨酸、3-吲哚硫酸及牛磺酸等含量下降;α-酮戊二酸、肌醇、色氨酸、酪氨酸、琥珀酸、蘋果酸、花生四烯酸、蘋果酸、檸檬酸及棕櫚酸等含量升高。由圖4-b可知，與CRF組比較，ART組有14種差異代謝物，其中，α-酮戊二酸、色氨酸、酪氨酸、琥珀酸、花生四烯酸、蘋果酸、檸檬酸及棕櫚酸等含量降低;葡萄糖酸、?；撬帷⒏拾彼帷⒓◆?、絲氨酸及甘油等含量升高。

2.5 差異代謝物代謝途徑富集分析

由圖5可知，共有7條潛在代謝靶標(biāo)途徑可能參與CRF發(fā)生和ART干預(yù)，分別為三羧酸循環(huán)、甘氨酸代謝、酪氨酸代謝、色氨酸生物合成、谷胱甘肽代謝、甘油磷脂代謝及不飽和脂肪酸生物合成。說明CRF組犬體內(nèi)代謝紊亂主要與脂代謝、氨基酸代謝和能量代謝等通路有關(guān)，經(jīng)ART干預(yù)后部分代謝物出現(xiàn)回調(diào)趨勢，提示代謝通路的紊亂得到相應(yīng)調(diào)節(jié)。

3 討論與結(jié)論

本試驗使用硫酸慶大霉素誘導(dǎo)犬急性腎衰竭模型，以血液Cr濃度增加至參考值上限的50%為犬急性腎功能衰竭模型建造成功的標(biāo)準(zhǔn)[8]，成功誘導(dǎo)犬急性腎衰竭模型，試驗犬無死亡且易于觀察。造模7 d，血清Cr濃度約為對照組2.5倍，尿素氮濃度約為對照組4倍，證明了犬急性腎衰竭模型復(fù)制成功。給予ART治療后，血清Cr和尿素氮濃度等指標(biāo)均有所改善，說明ART對犬急性腎衰竭具有良好的治療作用。

代謝組學(xué)技術(shù)是用于考察生物體受到刺激（藥物或環(huán)境等）后，其代謝產(chǎn)物發(fā)生的動態(tài)變化，從而分析生物體生理病理狀態(tài)，從整體上反映生物體的變化狀態(tài)，避免了以往單一或少數(shù)指標(biāo)研究病理生理變化[10]。GC-MS技術(shù)具有分離效果好、分辨度和檢測靈敏度較高，有參考比較的標(biāo)準(zhǔn)圖譜等優(yōu)點，且尿液樣本容易采集，對動物無損傷[11-13]。因此，本研究采用尿液進(jìn)行GC-MS分析。

對尿液中代謝物進(jìn)行差異分析發(fā)現(xiàn)，CRF組甘氨酸、肌酐及牛磺酸等含量低于對照組。徐婷婷等[14]在商陸致大鼠腎損傷的代謝組學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)尿液肌酐含量降低，與本結(jié)果研究一致。尿中肌酐含量降低，結(jié)合血清肌酐含量及尿素氮含量升高，進(jìn)一步提示CRF的發(fā)生。在線粒體中進(jìn)行的三羧酸循環(huán)是機體提供能量的主要方式，α-酮戊二酸、琥珀酸、蘋果酸及檸檬酸等物質(zhì)是其重要的中間產(chǎn)物。本研究結(jié)果顯示，CRF組尿中這些物質(zhì)含量高于對照組，提示急性腎衰竭時三羧酸循環(huán)發(fā)生異常，也間接反映線粒體功能的失調(diào)，而線粒體損傷是導(dǎo)致氧化應(yīng)激的重要因素。給予青蒿琥酯（ART組）后可使α-酮戊二酸、琥珀酸、蘋果酸及檸檬酸等含量回調(diào)，說明ART組改善了CRF組患犬三羧酸循環(huán)的狀態(tài)。甘氨酸作為一種抗氧化劑，可調(diào)控脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）和氧化亞氮水平[15]。?；撬峋哂锌寡趸?、抗細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、促線粒體蛋白質(zhì)合成、維持滲透平衡等功能從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞膜的目的[16-17]。CRF組甘氨酸和牛磺酸含量降低，說明機體抗氧化能力減弱，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。連續(xù)給予青蒿琥酯后甘氨酸、牛磺酸及肌酐含量均顯著回調(diào)，而且谷胱甘肽代謝通路改善顯著，表明青蒿琥酯可提高抗氧化物質(zhì)含量，改善機體氧化應(yīng)激。提示抑制氧化應(yīng)激可能是青蒿琥酯對慶大霉素誘導(dǎo)犬腎衰發(fā)揮保護(hù)作用的主要機制之一。此外，與炎癥有關(guān)的代謝物花生四烯酸和棕櫚酸[18-19]，在慶大霉素誘導(dǎo)腎衰竭犬的尿液中含量升高，而給予青蒿琥酯治療后降低，這說明青蒿琥酯可以改善慶大霉素誘導(dǎo)腎衰竭時發(fā)生的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，慶大霉素誘導(dǎo)犬腎衰竭后體內(nèi)一系列代謝途徑發(fā)生紊亂和代謝物發(fā)生改變，而給予青蒿琥酯干預(yù)后，腎衰竭犬的腎功能得到改善，可能與青蒿琥酯調(diào)節(jié)體內(nèi)脂代謝、氨基酸代謝和能量代謝等通路有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Meersch M，Schmidt C，Hoffmeier A，et al. Prevention of cardiac surgery associated AKI by implementing the KDIGO guidelines in high risk patients identified by biomarkers：the PrevAKI randomized controlled trial[J]. Intensive Care Med，2017，43（11）：1551-1561.

[2]Balasubramanian G，Al-Aly Z，Moiz A，et al. Early nephrologist involvement in hospital-acquired acute kidney injury：a pilot study[J]. Am J Kidney Dis，2011，57（2）：228-234.

[3]岑彥艷，趙祎博，李 攀，等. 青蒿琥酯的藥代動力學(xué)以及相關(guān)藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國中藥雜志，2018，43（19）：3970-3978.

[4]陶 磊，李婷婷，馬旖旎，等. 青蒿琥酯對阿霉素致大鼠腎損傷的保護(hù)作用[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2020，30（11）：47-51.

[5]梁 晨，李 維，陳 怡，等. 青蒿琥酯對糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用及機制[J]. 山東醫(yī)藥，2020，60（14）：9-12.

[6]張 丹，王 麗，韓 梅. 代謝組學(xué)在腎臟疾病中的研究進(jìn)展[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生，2020，58（30）：189-192.

[7]徐文麗，胡瑞雪，梁元昊，等. 中醫(yī)中藥代謝組學(xué)生物標(biāo)記物的研究進(jìn)展[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2019，30（6）：756-760.

[8]張 萍，杜 娟，沙 聰，等. 慶大霉素誘導(dǎo)的犬腎衰竭模型治療期間的NGAL和Cys-C變化[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2020，41（2）：74-79.

[9]孟 欣，汪受傳，謝 彤，等. 基于GC-MS代謝組學(xué)的RSV肺炎小鼠尿液和糞便生物標(biāo)記物研究[J]. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，33（2）：198-206.

[10]Kalim S，Rhee E P.An overview of renal metabolomics[J]. Kidney Int，2017，91（1）：61-69.

[11]吳惠勤，張春華，黃曉蘭，等. 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測尿液中15種有毒生物堿[J]. 分析測試學(xué)報，2013，32（9）：1031-1037.

[12]吳 堅，仝淑花，錢舒怡，等. 基于GC-MS技術(shù)研究八角楓對大鼠血漿與尿液代謝的影響[J]. 新中醫(yī)，2020，52（16）：12-15.

[13]湯柳英，高燕紅，王 晶，等. 不同儲存條件下人尿中小分子代謝物表征差異的初步研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2014，24（5）：612-617.

[14]徐婷婷，甄瀅瀅，金若敏，等. 商陸致大鼠腎損傷的代謝組學(xué)研究[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（11）：4120-4123.

[15]Wang Z W，Zhang J Q，Chen L，et al. Glycine suppresses AGE/RAGE signaling pathway and subsequent oxidative stress by restoring? Glo1 function in the aorta of diabetic rats and in HUVECs[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2019（4）：1-14.

[16]Yang X H，F(xiàn)u J J，Wan H F，et al. Protective roles and mechanisms of taurine on myocardial hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis[J]. Acta Cardiol Sin，2019，35（4）：415-424.

[17]Bian Y Q，Wang H，Sun S. Taurine alleviates endoplasmic reticulum stress in the chondrocytes from patients with osteoarthritis[J]. Redox Rep，2018，23（1）：118-124.

[18]李倜宇，閆素梅，史彬林，等. 殼聚糖對泌乳中期奶牛花生四烯酸免疫調(diào)節(jié)途徑的影響[J]. 動物營養(yǎng)學(xué)報，2019，31（9）：4218-4225.

[19]李樹森，楊曉燕，李 瑩，等. 體外棕櫚酸誘導(dǎo)自噬調(diào)節(jié)奶牛淋巴細(xì)胞炎癥通路[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2021，26（1）：43-50.