獨(dú)蒜蘭種子快速萌發(fā)培養(yǎng)研究

王躍華 陳芳 覃順旺 曾心語 文俊壹 袁杰

摘要 [目的]以獨(dú)蒜蘭種子為試驗(yàn)材料，探索其種子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)條件。[方法]通過用不同濃度的次氯酸鈣進(jìn)行浸種處理，采用NAA、6-BA和活性炭3因素3水平的正交試驗(yàn)探討其對獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)的影響，并觀察獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)生長過程。[結(jié)果]采用0.05 mol/L的次氯酸鈣浸種處理獨(dú)蒜蘭種子10 min后，將其接入B5+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.3 mg/L+活性炭1.0 g/L+20.0 g/L蔗糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率為100%。[結(jié)論]該研究為獨(dú)蒜蘭植物大規(guī)模栽種生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 獨(dú)蒜蘭;種子;萌發(fā);培養(yǎng)條件

中圖分類號 S 682.31? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）01-0187-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.050

Study on the Rapid Germination and Cultivation of Pleione bulbocodioides Seeds

WANG Yue-hua， CHEN Fang， QIN Shun-wang et al

（School of Food and Bioengineering，Chengdu University， Chengdu，Sichuan 610106）

Abstract [Objective]Taking Pleione bulbocodioides seeds as experimental materials， the best culture conditions of seed germination were explored. [Method]The effects of different concentrations of calcium hypochlorite on Pleione bulbocodioides seeds germination，and the growth process of Pleione bulbocodioides seeds germination were studied by orthogonal test of NAA，6-BA and activated carbon. [Result]After soaking seeds with 0.05 mol/L calcium hypochlorite for 10 min， the germination rate was 100.00% after 50 days in B5 + NAA 0.5 mg/L+ 6-BA 0.3 mg/L+ activated carbon 1.0 g/L + 20.0 g/L sucrose medium. [Conclusion] This study provides a scientific basis for large-scale planting and production of Pleione bulbocodioides plant.

Key words Pleione bulbocodioides;Seed;Germination;Culture condition

基金項(xiàng)目 四川省科技廳重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2020YFS0496）。

作者簡介 王躍華（1963—），女，山東青島人，教授，碩士，從事藥用植物生物技術(shù)研究。

收稿日期 2021-04-30

獨(dú)蒜蘭（Pleione bulbocodioides（Franch.）Rolfe）是蘭科獨(dú)蒜蘭屬多年生半耐寒附生或地生珍稀植物[1]，主要分布于我國的貴州、四川和云南等地，其假鱗莖半埋于苔蘚或枯枝落葉分解的有機(jī)質(zhì)層中[2]。2020年《中國藥典》（一部）中記載，獨(dú)蒜蘭植物的干燥假鱗莖為藥材山慈菇[3]。山慈菇藥材具有清熱解毒、消腫散瘀的功效[4];內(nèi)服可治肝癌、乳腺癌和子宮癌等，外用可治瘡毒、蛇蟲咬傷、皮膚燙傷和燒傷等。另外，獨(dú)蒜蘭作為蘭科植物，以其花形奇異、花色多樣而具有極高的觀賞價值[5]，已列入《中國珍稀瀕危保護(hù)植物名錄》中，是我國特有的Ⅱ級珍稀瀕危保護(hù)植物。獨(dú)蒜蘭植物種子細(xì)小、無胚乳結(jié)構(gòu)，其種皮的透氣和透水性也不太好，因此導(dǎo)致獨(dú)蒜蘭種子在自然界中萌發(fā)率極低。筆者主要利用生物技術(shù)，從多個方面開展了提高獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)條件的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

獨(dú)蒜蘭植物蒴果采于四川省都江堰市龍池鎮(zhèn)，經(jīng)四川師范大學(xué)生命科學(xué)院馬丹煒教授鑒定為蘭科獨(dú)蒜蘭屬獨(dú)蒜蘭（Pleione bulbocodioides（Franch）Rolfe）植物。

1.2 方法

1.2.1 獨(dú)蒜蘭種子消毒處理。

選取未開裂的獨(dú)蒜蘭植物蒴果，經(jīng)清洗陰干后，放在超凈工作臺上用75%乙醇消毒1 min，無菌水沖洗2次，再用0.1%氯化汞消毒10 min，無菌水沖洗3次后，吸干蒴果表面的水分，用手術(shù)刀縱向?qū)Π肭虚_蒴果后將種子抖落到無菌瓶中待用。

1.2.2 不同濃度次氯酸鈣浸種處理。

將上述消毒后的獨(dú)蒜蘭種子浸泡在次氯酸鈣濃度為0、0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mol/L中處理10 min后，再用無菌水洗2次后接入MS+20.0 g/L蔗糖培養(yǎng)基中，50 d后統(tǒng)計(jì)獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)率。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

以B5+20.0 g/L蔗糖為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加NAA、6-BA和活性炭3因素，各因素設(shè)3個水平，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。50 d后統(tǒng)計(jì)獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)率，確定種子萌發(fā)的最佳條件。

1.2.4 培養(yǎng)條件。

培養(yǎng)溫度（20±2）℃，光照強(qiáng)度為500～800 lx，光照時間24 h/d，培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率（以種子突破種皮為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)）：萌發(fā)率=（突破種皮的種子數(shù)/接入培養(yǎng)基中的種子總數(shù)）×100%，并觀察記錄獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)生長過程。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Office Excel 2016和 SPSS 23.0軟件里的Duncan分析數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 獨(dú)蒜蘭種子的萌發(fā)過程

獨(dú)蒜蘭植物種子呈一端稍尖的紡錘形、體積較小，種子長0.5～1.0 mm，中部膨大處有一橢圓狀褐色的胚，直徑為0.5～0.6 mm;獨(dú)蒜蘭果實(shí)成熟后，其內(nèi)的種子胚尚處于原胚階段，為一團(tuán)還未分化的胚性細(xì)胞組成，種子無胚乳結(jié)構(gòu)（圖1a）。將消毒后的獨(dú)蒜蘭種子接入培養(yǎng)基后，種子快速吸水膨脹，隨著胚的不斷長大，其胚柄逐漸退化，在依靠珠孔端的大細(xì)胞為營養(yǎng)物質(zhì)的滲透提供了一個切入口[6]。

通過試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，獨(dú)蒜蘭種子突破種皮萌發(fā)形成原球莖通常有2種不同方式;第一種方式是獨(dú)蒜蘭種子在培養(yǎng)10 d后，種胚體積明顯長大且顏色開始變成黃色（圖1b），隨著培養(yǎng)時間增長到15 d后，黃色膨大的種胚從種子的一側(cè)開始漲破種皮（圖1c），培養(yǎng)20 d后觀察發(fā)現(xiàn)大部分種皮已出現(xiàn)脫落（圖1d），培養(yǎng)30 d后可見形成原球莖（圖1e）。第2種方式是獨(dú)蒜蘭種子在培養(yǎng)15 d后，種胚明顯吸水膨大后顏色逐漸變成綠色（圖1f），培養(yǎng)20 d后可見膨大的綠色種胚已開始漲破種皮（圖1g），培養(yǎng)30 d后可見綠色的原球莖形成（圖1h）。

2.2 不同濃度的次氯酸鈣浸種處理對種子萌發(fā)的影響

用不同濃度次氯酸鈣浸種處理種子10 min后，接入MS+20.0 g/L蔗糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)率結(jié)果見表2。如表2所示，A1作為對照組，不用次氯酸鈣進(jìn)行浸種處理，50 d后統(tǒng)計(jì)獨(dú)蒜蘭種子的萌發(fā)率最低，僅為53.00%，由此可見，采用適宜濃度的次氯酸鈣浸種處理獨(dú)蒜蘭種子，對種子的萌發(fā)具有明顯的促進(jìn)作用。在A2～A3處理組中，當(dāng)次氯酸鈣濃度由0.01 mol/L升高到0.05 mol/L時，獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)率也呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢;當(dāng)采用濃度為0.05 mol/L的次氯酸鈣處理種子時，其種子萌發(fā)率最高，為82.67%;但當(dāng)使用的次氯酸鈣濃度再進(jìn)一步升高時，種子的萌發(fā)率也呈現(xiàn)出一定的下降，如A6組中，當(dāng)次氯酸鈣濃度升高到0.20 mol/L時，獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)率下降為68.00%。

分析其原因，主要是因?yàn)楠?dú)蒜蘭植物種子的種皮透氣性和透水性不太好，不利于種子萌發(fā)前期的吸水和呼吸代謝;該試驗(yàn)通過采用適宜濃度的次氯酸鈣進(jìn)行浸種處理，不僅能消除獨(dú)蒜蘭種子表面的病菌和其他對種子萌發(fā)有抑制的物質(zhì)[7]，還能改善種皮的透水性和透氣性，并激發(fā)種子內(nèi)部酶活性，進(jìn)一步增強(qiáng)種胚的呼吸作用[8];另有報(bào)道，采用適宜濃度的次氯酸鈣處理種子，還能使種子從休眠狀態(tài)轉(zhuǎn)為萌發(fā)狀態(tài)[9]。但是，次氯酸鈣具有較強(qiáng)的氧化性，所以在處理獨(dú)蒜蘭種子時，選擇適宜濃度是非常重要的。如果采用過高濃度的次氯酸鈣處理獨(dú)蒜蘭種子，會傷到獨(dú)蒜蘭種子種胚，從而也會影響到種子的萌發(fā)效果。

2.3 多因素處理對獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)的影響

根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究了NAA、6-BA和活性炭3個因素對獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)的影響，試驗(yàn)結(jié)果見表3和表4。從表3可以看出，編號4即采用NAA濃度0.5 mg/L、6-BA濃度0 mg/L、活性炭濃度1.0 g/L時，獨(dú)蒜蘭種子的萌發(fā)率最高，為97.84%。通過觀察發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)形成原球莖的過程：種胚體積變大、顏色變?yōu)榈S色后突破種皮形成原球莖。通過極差分析，3個因素對獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)的影響從大到小依次為A>B>C，即NAA的影響最大，6-BA次之，活性炭影響最小。

進(jìn)一步根據(jù)各水平的均值大小，篩選出了獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)的最佳組合為A2B2C2，即NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.3 mg/L+活性炭1.0 g/L;經(jīng)過對獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)試驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證，培養(yǎng)50 d后其種子的萌發(fā)率可達(dá)到100%。

由表4可知，因素A具有極顯著性，因素B具有顯著性。通過方差分析（表4）可以看出，影響?yīng)毸馓m種子萌發(fā)的主要影響因素為NAA，其次是6-BA，活性炭對其影響最小，此結(jié)果與極差分析的結(jié)果一致。

3 小結(jié)

獨(dú)蒜蘭是蘭科植物中重要的藥用植物，其種子體積小、無胚乳結(jié)構(gòu)，種皮的透氣性和透水性不好，所以獨(dú)蒜蘭種子在自然條件下極難萌發(fā)。隨著人們對其化學(xué)成分和藥理作用的不斷深入了解，其需求量也與日俱增;但由于獨(dú)蒜蘭植物本身的繁殖能力和對栽種環(huán)境的苛刻要求，使得其野生資源極其稀少;因此，提高獨(dú)蒜蘭種子的萌發(fā)率也是解決獨(dú)蒜蘭植物大規(guī)模栽種生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

該研究通過在培養(yǎng)基中添加適量的NAA和6-BA有利于提高種子的萌發(fā)率，這與郭艷芳[10]、曾武清等[11]的研究結(jié)果相似。說明適宜濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA和NAA可以顯著提高獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)率和促進(jìn)原球莖的快速生長。

參考文獻(xiàn)

[1] 李春華，李柯澄.獨(dú)蒜蘭溫室生產(chǎn)[J].中國花卉園藝，2017（6）：23-27.

[2] 張燕，李思鋒，黎斌.獨(dú)蒜蘭的生物學(xué)特性及栽培技術(shù)[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，56（1）：267-268.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2020年版一部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2020：34.

[4] 劉婷婷，于棟華，劉樹民.山慈菇的本草考證及現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].中國藥房，2020，31（24）：3055-3059.

[5] 郎楷永.四川省蘭科植物資源[J].植物雜志，1988（6）：6-8.

[6] LI Y Y，MENG Z X，ZHANG Y，et al.Embryology of Anoectochilus roxburghii：Seed and embryo development[J].Botanical studies，2019，60（1）：1-9.

[7] 趙榮梅，劉麗，郭巧生.外源物質(zhì)對桔梗種子發(fā)芽影響的研究[J].中國中藥雜志，2006，31（12）：966-968.

[8] 戎聰敏.不同條件下藥劑浸種對油菜發(fā)芽率及幼苗長勢的影響[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[9] 譚玲玲，胡正海.不同浸種處理對桔梗種子萌發(fā)和幼苗生長的影響[J].中草藥，2013，44（4）：468-472.

[10] 郭艷芳.巧克力文心蘭離體培養(yǎng)優(yōu)化及抗病基因克隆與表達(dá)分析[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2018.

[11] 曾武清，陳柳嬋，曾瑞珍，等.麗影和紅韻蝴蝶蘭快速繁殖試驗(yàn)[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（8）：55-60.