金剛鸚鵡性別的快速分子生物學鑒定

朱向蕾 王瑛瑩 周立晨

摘要 應用引物2550F/2718R對上海動物園內(nèi)藍黃金剛鸚鵡和紅綠金剛鸚鵡的CHD基因進行PCR擴增，進行性別鑒定。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)：雄性個體擴增出1條片段，大小647 bp;雌性個體擴增出2條片段，大小分別為630和411 bp。藍黃金剛鸚鵡群體的雌雄比為10∶17，紅綠金剛鸚鵡群體的雌雄比為5∶4。該方法能準確、快速、有效地進行2種金剛鸚鵡的性別鑒定，為該鳥類種群飼養(yǎng)繁育提供基礎性別信息。

關鍵詞 金剛鸚鵡;性別鑒定;CHD基因

中圖分類號 S 865.3+5? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）01-0099-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.025

Rapid Molecular Biology Identification of the Sex of Macaw

ZHU Xiang-lei， WANG Ying-ying， ZHOU Li-chen

（Shanghai Zoo， Shanghai 200335）

Abstract Primers 2550F/2718R were used to amplify CHD gene of Ara ararauna and Ara chloropterus in Shanghai Zoo by PCR. Agarose gel electrophoresis results showed that the male individuals amplified one band with the length of 647 bp， while the female individuals amplified two bands with the length of 630 and 411 bp respectively. The male-female ratio of A. ararauna was 10∶17. The male-female ratio of A. chloropterus was 5∶4. This method could accurately， quickly and effectively identify the sex of two species of macaw， and provide the basic sex information for the feeding and breeding of macaw population.

Key words Macaw;Sex identification;CHD gene

基金項目 上海市綠化和市容管理局科研專項（GZ180409）;上海動物園科技攻關項目（SZ170305）。

作者簡介 朱向蕾（1985—），女，河北冀州人，工程師，碩士，從事野生動物科學研究工作。通信作者，工程師，博士，從事野生動物科學研究工作。

收稿日期 2021-04-19

金剛鸚鵡隸屬鸚形目鸚鵡科，原產(chǎn)于美洲熱帶地區(qū)，屬于大型攀禽，已列入《世界自然保護聯(lián)盟》（IUCN）瀕危物種紅色名錄。目前國內(nèi)多家動物園引入飼養(yǎng)金剛鸚鵡，但其繁殖率較低，種群質(zhì)量堪憂。影響金剛鸚鵡繁殖的因素很多，包括營養(yǎng)、激素水平、氣候、溫濕度、群體密度以及性別比例等。

性別作為基礎信息，是鳥類主要的生物學特征。鳥類性別不僅會影響繁殖配對和育種，而且會對飼養(yǎng)管理、遺傳疾病防治、生態(tài)學、種群遺傳分析以及瀕危珍稀鳥類的保護研究等方面具有重要影響[1-2]。然而，世界上超過50%的鳥類屬于單態(tài)性鳥類，雌雄同型，該類型鳥類無論成鳥還是幼鳥均很難從外觀形態(tài)上進行性別判定[3]，金剛鸚鵡亦是如此。鸚鵡性別鑒定的方法有很多。吳建民等[4]總結了目前鸚鵡性別鑒定的常用技術方法，包括形態(tài)學方法（行為判定、翻肛判定、外科手術判定、排泄物類固醇判定、叫聲判定、體尺測量判定、羽色伴性遺傳判定等）、細胞生物學方法、分子生物學方法（隨機多態(tài)性DNA、微衛(wèi)星、小衛(wèi)星）等方法。然而，這些方法的成功與否取決于實驗室基礎設施和研究人員的專業(yè)知識及經(jīng)驗積累，有的過程煩瑣，耗時較長，因此探索快速、準確、有效的鑒定方法對于珍稀鳥類飼養(yǎng)管理與繁育工作十分必要。

以CHD基因（chromobox-helicase-DNA binding gene）為基礎的分子生物學方法已經(jīng)被廣泛應用于非平胸目鳥類的性別鑒定中[5]。CHD基因全稱為染色體螺旋蛋白基因，屬于功能性基因，非平胸目鳥類有2個同源拷貝CHD-W和CHD-Z，雄性個體只有1個拷貝CHD-Z;瓊脂糖凝膠電泳結果只顯示1條條帶，雌性個體有2個拷貝CHD-Z和CHD-W，可顯示出2條條帶，雙陽性的帶型特征排除了假陰性的可能，結果準確可靠[6]，可作為鳥類性別鑒定的有效方法。

目前，尚未見到國內(nèi)有針對金剛鸚鵡的性別鑒定相關報道。筆者通過分子生物學手段在已有研究的基礎上，采用非損傷性取樣的方式快速、準確地鑒定藍黃金剛鸚鵡（Ara ararauna）和紅綠金剛鸚鵡（Ara chloropterus）的性別，以期為今后動物園進一步開展金剛鸚鵡的飼養(yǎng)管理、繁殖育種及物種保護奠定理論和技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集。

采集上海動物園內(nèi)正常飼養(yǎng)的36只金剛鸚鵡的羽毛，其中藍黃金剛鸚鵡27只，紅綠金剛鸚鵡9只。采集樣品均為鳥類胸部羽毛，確保羽根完整，常溫干燥保存或-80 ℃下長期冷凍保存。

1.1.2 主要試驗設備與試劑。

主要試驗設備有凝膠成像系統(tǒng)（Tanon 1600）、PCR儀（Jena Biometra TRIO）、電泳儀（Tanon EPS 300）、電泳槽、移液槍（Eppendorf）等。

主要試劑：MightyAmpTM DNA Polymerase Ver.3 Kit、50 bp DNA Ladder Marker、6× Loading Buffer均購自寶生物工程（大連）有限公司。引物2550 F（5′-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3′）和 2718R（5′-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3′）[7]由英濰捷基公司合成。

1.2 PCR反應

應用引物2550F和2817R對CHD基因進行擴增，PCR反應體系為20 μL，各組分濃度按試劑盒推薦體系設置，其中樣本DNA剪取1 mm長2～3段羽根，補充ddH2O至20 μL。退火溫度為48 ℃，PCR反應在PCR儀上進行。

1.3 瓊脂糖凝膠電泳

1.3.1 瓊脂糖凝膠的制備。

瓊脂糖凝膠濃度為1.5%，用電子天平稱取瓊脂糖4.5 g，加入錐形瓶中，添加30 mL 1×TAE后將錐形瓶置于微波爐中加熱，沸騰直至瓊脂糖完全溶解。用流水將錐形瓶中液體冷卻至50～60 ℃，加入EB染料4 μL，混勻，倒入凝膠模具中，室溫放置30 min以上，備用。

1.3.2 瓊脂糖凝膠電泳。

PCR擴增產(chǎn)物中添加6×Loading Buffer 2～3 μL，混勻后取10 μL上樣，在1.5%的瓊脂糖凝膠上120 V穩(wěn)壓，電泳35 min，電泳完畢后，通過凝膠成像系統(tǒng)進行拍照并記錄結果。產(chǎn)物為1條條帶的為雄性個體，產(chǎn)物為2條條帶的為雌性個體，電泳產(chǎn)物由寶生物工程（大連）有限公司進行測序。

2 結果與分析

2.1 羽根樣品PCR檢測及方法的有效性驗證

以已知性別的藍黃金剛鸚鵡和紅綠金剛鸚鵡為例，分別以血液抽提的DNA和羽根樣品為模板，利用2550F/2718R引物擴增金剛鸚鵡的CHD基因片段，驗證以羽根為樣品直接進行PCR檢測的有效性和可靠性。

如圖1所示，2種金剛鸚鵡的雄性個體均擴增出1條條帶，經(jīng)克隆測序與GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄序列比對，大小為647 bp;雌性個體均擴增出2條條帶，一條為630 bp，另一條為411 bp。2種金剛鸚鵡血液組DNA與羽根樣品PCR擴增結果相一致，且與已知性別結果相吻合。從電泳結果來看，以未經(jīng)核酸提取純化的羽根為模板擴增得到的PCR產(chǎn)物條帶清晰度和產(chǎn)物濃度與血液組DNA相比無明顯差異，也無明顯非特異性擴增，可用于該種金剛鸚鵡的性別鑒定。

2.2 金剛鸚鵡的性別鑒定

利用引物2550F /2718R對金剛鸚鵡種群中未知性別的個體進行性別鑒定，結果如圖2所示。從圖2可以看出，條帶大小與已知性別條帶大小相同，準確率達100%。紅綠金剛鸚鵡群體中雌性5只、雄性4只，

雌雄比為5∶4;藍黃金剛鸚鵡群體中雌性10只、雄性17只，雌雄比為10∶17。

3 討論

世界上鳥類資源豐富，且大多為單態(tài)性鳥類。金剛鸚鵡羽毛色彩鮮麗，深受人們的喜愛，但是其性別無論是幼鳥還是成鳥均很難從外觀判別，種群中性別結構難以判定，給繁殖配對造成了一定的困擾，也給鳥類管理和保護、鳥類生態(tài)學、行為學研究等方面帶來不便，因此鳥類的性別鑒定對于金剛鸚鵡這種珍稀鳥類的繁殖育種、保護研究具有重要意義。

隨著分子生物學技術的發(fā)展，利用PCR方法進行鳥類的性別鑒定已取得突破性進展，基于性染色體上特定基因CHD同源拷貝的大小差異，應用PCR技術進行鳥類性別鑒定的方法已經(jīng)被應用于多種動物保護繁育的研究中。

Griffiths等[8]從小藍金剛鸚鵡的羽毛中提取DNA，并利用引物（P1、P2、P3）進行PCR擴增，結合限制性內(nèi)切酶DdeI對其進行性別鑒定，但其花費時間較長。Cerit等[9]利用引物P2/P8對雞尾鸚鵡進行了性別鑒定，結果發(fā)現(xiàn)P2/P8引物對于一些目的片段相近的條帶難以區(qū)分，亦需要通過限制性內(nèi)切酶來分離目的條帶，過程比較煩瑣。胡銳穎等[10]、田秀華等[11]應用引物2550F /2718R對大多數(shù)鶴形目、鸛形目鳥類進行了性別鑒定，目前尚未見到將該引物應用于鸚形目鳥類金剛鸚鵡的相關報道。

該研究應用2550F /2718R引物對金剛鸚鵡羽毛樣本的CHD-W基因進行PCR擴增，采集樣本為非侵入性且不需麻醉即可獲得的羽毛，尤其針對金剛鸚鵡這種珍稀鳥類更應避免和減少對鳥類的損傷和應激，且羽毛樣本采集、保存和運輸?shù)榷际址奖?，結合分子生物學快速、準確的特點，簡化了DNA提取的步驟，使得性別鑒定用時更少，鑒定結果更準確可靠，效率更高，有很好的可靠性，為該物種在分子水平上進行性別鑒定奠定了基礎[12-13]。

該研究檢測了上海動物園藍黃金剛鸚鵡和紅綠金剛鸚鵡的群體性別結構，其雌雄比分別為10∶17和5∶4，藍黃金剛鸚鵡中雄性較多，繁殖配對難以均衡，種群中雄性過多也容易引發(fā)打斗，尤其是繁殖季節(jié)容易造成外傷、應激等不利影響，在一定程度上不利于種群發(fā)展，建議優(yōu)化雌雄比，因為較高的雌性比例更有利于提高種群的繁殖潛力。

參考文獻

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