吉蘭-巴雷綜合征患者調(diào)節(jié)性B細(xì)胞與抑炎性細(xì)胞因子的水平分析

韓 雪，江 波，郭術(shù)俊，華夢(mèng)晴，尹梅花，宋傳旺，桑道乾

(蚌埠醫(yī)學(xué)院 1.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室；2.第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3.感染與免疫安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4.慢性疾病免疫學(xué)基礎(chǔ)與臨床安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；5.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233030)

吉蘭-巴雷綜合征(GBS)是急性多神經(jīng)根病變的自身免疫病[1]，以進(jìn)行性肌無(wú)力為特征，最終導(dǎo)致呼吸衰竭[2]。調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Regulatory B cells，Bregs)是機(jī)體調(diào)節(jié)炎癥等免疫學(xué)反應(yīng)[3]的重要免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，人外周血中Bregs具有CD19+CD24hiCD38hi的表型[4]。Bregs是免疫抑制細(xì)胞，抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)[5]，通過(guò)產(chǎn)生IL-10、IL-35和TGF-β1等抑炎性細(xì)胞因子發(fā)揮作用[6-7]。

在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫病中，Bregs在數(shù)量和功能上均受損[8]。然而，Bregs和血清抑炎性細(xì)胞因子在GBS發(fā)病中的作用有待進(jìn)一步明確。因此，本研究比較了40例新診斷的GBS患者與40例健康對(duì)照組的外周血Bregs、記憶性B細(xì)胞、漿細(xì)胞的數(shù)量和血清抑炎性細(xì)胞因子IL-10、IL-35、TGF-β1的水平。

1 材料和方法

1.1 病人和健康對(duì)照組本研究在蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院進(jìn)行GBS患者標(biāo)本采集，標(biāo)本采集時(shí)間為2019年11月至2021年1月。根據(jù)2019年中國(guó)GBS診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行GBS診斷。診斷標(biāo)準(zhǔn)如下:(1)多有前期感染史，起病急，進(jìn)行性加重，多在4周內(nèi)達(dá)到高峰；(2)嚴(yán)重GBS患者的四肢對(duì)稱、延髓支配肌肉、面肌無(wú)力、呼吸肌無(wú)力；(3)可伴有感覺異常和自主神經(jīng)功能障礙；(4)腦脊液中的蛋白質(zhì)-細(xì)胞分離；(5)電生理檢查提示周圍神經(jīng)脫髓鞘，如潛伏期延長(zhǎng)、F波異常、傳導(dǎo)阻滯、波形彌散異常等。

GBS患者和健康成年志愿者的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)如下:(1)為了避免因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)發(fā)育不成熟影響研究結(jié)果，本研究均選取年齡≥18歲的成年人為研究對(duì)象；(2)研究對(duì)象的性別根據(jù)臨床患者性別情況及知情同意情況進(jìn)行選取，健康對(duì)照組性別與GBS患者性別一致；(3)根據(jù)GBS起病急，進(jìn)行性加重，多在4周內(nèi)達(dá)到高峰的診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有患者均為新確診，參與研究時(shí)均處于GBS急性期；(4)由于藥物治療會(huì)影響研究結(jié)果，所有參與研究的GBS患者及健康對(duì)照組均未接受靜脈注射免疫球蛋白治療。

本研究對(duì)40名GBS患者(26名男性和14名女性)進(jìn)行研究，同時(shí)以40名健康成年志愿者(26名男性和14名女性)作為健康對(duì)照組。兩組研究對(duì)象均按照上述納入和排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選擇。本研究經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有GBS患者都簽署了知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集每名GBS患者和健康對(duì)照組人員采集5 mL外周靜脈血，肝素抗凝。吸取1 mL外周靜脈血用于流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)(詳見1.3)。剩余4 mL外周靜脈血低速離心(1 847×g)10 min，分離血清用于檢測(cè)IL-10、IL-35和TGF-β1含量。

1.3 B細(xì)胞亞型的數(shù)量檢測(cè)全血與熒光抗體在4 ℃孵育30 min。所用熒光抗體分別為異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗CD24抗體、藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗CD19抗體、PEcy5標(biāo)記的抗CD27抗體和APC標(biāo)記的抗CD38抗體(抗體均來(lái)自eBioscience， San Diego， CA， USA)。 然后用3 mL 0.83%氯化銨在22 ℃恒溫水浴中裂解紅細(xì)胞10 min，低速(1 847×g)離心5 min。棄上清液，用2 mL PBS 重懸細(xì)胞，再次低速(1 847×g)離心5 min，棄上清液后加入400 μLPBS。用流式細(xì)胞儀(BD FACSVerse； BD Biosciences， San Jose， CA， USA)檢測(cè)CD19+B淋巴細(xì)胞，具體檢測(cè)CD19+CD24hiCD38hiBregs、CD19+CD27+CD24hi記憶性B細(xì)胞和CD19+CD27hiCD38hi漿細(xì)胞的數(shù)量。

1.4 血清IL-10、IL-35和TGF-β1檢測(cè)從GBS患者和健康對(duì)照組人員外周靜脈血中分離的血清以500 μL/管進(jìn)行分裝，使用商品試劑盒(CUSABIO，中國(guó)湖北武漢)按照說(shuō)明書進(jìn)行IL-10、IL-35和TGF-β1的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)采用定量酶免疫分析技術(shù)。所用商品試劑盒已將IL-10、IL-35和TGF-β1特異性抗體預(yù)包被于微孔板上。將標(biāo)準(zhǔn)品和血清樣品移加入各孔中，包被的特異性固相化抗體結(jié)合血清標(biāo)本中的IL-10、IL-35和TGF-β1。洗去所有未結(jié)合物質(zhì)后，向孔中加入抗IL-10、IL-35和TGF-β1的生物素標(biāo)記抗體。洗滌后，將親和素結(jié)合的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)加入各孔中。洗滌去除任何未結(jié)合的親和素酶試劑后，向孔中加入底物溶液，顯色顏色深淺與初始步驟中所結(jié)合的IL-10、IL-35和TGF-β1的量成正比。終止顯色后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm處的吸光度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)量數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。組間結(jié)果采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 GBS患者外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs占總B細(xì)胞的比例降低流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，GBS患者外周血中CD19+CD24hiCD38hiBregs占總B細(xì)胞的比例顯著降低(P<0.01，見圖1)。GBS患者和健康對(duì)照組相比較，外周血CD19+CD27+CD24hi記憶性B細(xì)胞和CD19+CD27hiCD38hi漿細(xì)胞占外周血總B細(xì)胞的比例無(wú)顯著差異(見圖2和圖3)。

圖1 GBS患者外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs占總B細(xì)胞比例

圖2 GBS患者外周血CD19+CD27+CD24hi記憶性B細(xì)胞占總B細(xì)胞比例

圖3 GBS患者外周血CD19+CD27hiCD38hi漿細(xì)胞占總B細(xì)胞比例

2.2 GBS患者血清中IL-10、IL-35和TGF-β1水平升高與健康對(duì)照組相比，GBS患者血清中IL-10、IL-35和TGF-β1水平均升高(圖4)。

圖4 GBS患者血清IL-10、IL-35和TGF-β1的ELISA結(jié)果

3 討論

在全球范圍內(nèi)，GBS是非脊髓灰質(zhì)炎病毒急性弛緩性麻痹最常見的病因[9]。預(yù)先感染病原體通常是GBS的觸發(fā)因素[10]。GBS的發(fā)病機(jī)制涉及分子模擬，一些病原體有類似于周圍神經(jīng)髓鞘和/或軸突表位的抗原?？漳c彎曲桿菌、巨細(xì)胞病毒、Epstein-Barr病毒、肺炎支原體、流感嗜血桿菌、乙型肝炎病毒[11]、戊型肝炎病毒、SARS-CoV和MERS-CoV與GBS的發(fā)生有關(guān)。目前，在Zika病毒大流行和COVID-19大流行期間，GBS發(fā)病率有所上升[12]。

Bregs是實(shí)現(xiàn)自身免疫的關(guān)鍵參與者，是負(fù)向調(diào)節(jié)免疫的細(xì)胞。在自身免疫性疾病中，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、免疫性血小板減少癥和Graves病，CD19+CD24hiCD38hiBregs數(shù)量減少[8]。GBS是外周神經(jīng)自身免疫性疾病，我們研究發(fā)現(xiàn)GBS患者外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs占總B細(xì)胞的比例降低，這與上述研究[8]一致。

考慮到有研究表明記憶性B細(xì)胞和漿細(xì)胞在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[13]，我們同時(shí)也檢測(cè)了外周血CD19+CD27+CD24hi記憶性B細(xì)胞和CD19+CD27hiCD38hi漿細(xì)胞占總B細(xì)胞的比例。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于首次對(duì)GBS患者外周血CD19+CD27+CD24hi記憶性B細(xì)胞數(shù)量和CD19+CD27hiCD38hi漿細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行了分析，為闡明GBS疾病進(jìn)展及發(fā)病機(jī)制提供部分依據(jù)。記憶性B細(xì)胞迅速分化為效應(yīng)細(xì)胞，因此它們?cè)谧陨砻庖咝约膊≈械淖饔貌蝗莺鲆暋Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)GBS患者外周血CD19+CD27+CD24hi記憶性B細(xì)胞數(shù)量與健康對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。缺乏差異可以反映GBS患者疾病處于早期階段。如果抗體在疾病的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，那么外周血的CD19+CD27hiCD38hi漿細(xì)胞的數(shù)量將與健康對(duì)照組不同。然而，我們發(fā)現(xiàn)在GBS患者和健康對(duì)照組中CD19+CD27hiCD38hi漿細(xì)胞的比例并沒(méi)有顯著差異，這表明抗體的功能可能在GBS發(fā)病機(jī)制中不占主導(dǎo)地位。

免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜，包括Bregs分泌的抑炎性細(xì)胞因子IL-10、IL-35和TGF-β1。因此，檢測(cè)GBS患者血清中IL-10、IL-35和TGF-β1的水平對(duì)闡明GBS的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。IL-10的分泌促進(jìn)Bregs對(duì)自身抗原的耐受及其抗炎活性和對(duì)自身免疫反應(yīng)的抑制[4，6]，研究認(rèn)為IL-35和TGF-β1也是免疫抑制/抗炎性細(xì)胞因子[7]。與這些觀點(diǎn)不一致的是，我們發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比，新發(fā)GBS患者血清中IL-10、IL-35和TGF-β1的表達(dá)卻均升高。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)抑制B細(xì)胞的活化、增殖和分化[13]。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中，漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoi dsdendritic cells，pDCs)和Bregs之間存在異常反饋調(diào)節(jié)。狼瘡動(dòng)物模型中，骨髓源性抑制細(xì)胞(myeloids-derived suppressorc ells，MDSCs)作為一種免疫抑制細(xì)胞，通過(guò)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(nitric oxide synase，iNOS)發(fā)揮Bregs效應(yīng)，從而抑制自身免疫反應(yīng)。綜上所述，Tregs、pDCs和MDSCs也可能參與了自身免疫性疾病GBS的發(fā)病。在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中，T細(xì)胞和單核細(xì)胞也可能產(chǎn)生和釋放IL-10、IL-35和TGF-β1[14]。據(jù)此分析，在自身免疫性疾病患者中，Bregs來(lái)源的抑炎性細(xì)胞因子可能僅占體內(nèi)IL-10、IL-35和TGF-β1的一部分。本研究中，GBS患者外周血Bregs減少，而血清中IL-10、IL-35和TGF-β1的表達(dá)均增加。根據(jù)上述研究基礎(chǔ)，我們推測(cè)可能是其他免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞(如Tregs、pDCs和MDSCs)對(duì)GBS患者血清中這些抑炎性細(xì)胞因子的分泌進(jìn)行了代償。因此，GBS患者外周血Bregs與其他免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，GBS患者外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs占總B細(xì)胞的比例降低，而外周血CD19+CD27+CD24hi記憶性B細(xì)胞和CD19+CD27hiCD38hi漿細(xì)胞占總B細(xì)胞的比例無(wú)顯著差異。與健康對(duì)照組相比，GBS患者血清IL-10、IL-35和TGF-β1水平顯著上調(diào)。

綜上所述，Bregs在GBS中是重要的負(fù)性自身免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，這增加了我們對(duì)GBS發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。本研究的重要意義在于，聯(lián)合檢測(cè)分析外周血中CD19+CD24hiCD38hiBregs占總B細(xì)胞比例以及血清中抑炎性細(xì)胞因子IL-10、IL-35和TGF-β1水平，可以作為揭示GBS臨床特征及探討發(fā)病機(jī)制的重要方法。