AMPK/mTOR 信號通路介導(dǎo)的自噬在血根堿抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖中的作用研究①

蘇俐丹 何迎春 黃立中 劉 潔

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙410208）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤，發(fā)病率為頭頸部惡性腫瘤之首，目前治療以放療為主輔以化療和手術(shù)治療，但存在手術(shù)難度大、術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、放療后不良反應(yīng)嚴(yán)重等問題，因此，需尋找更有效且毒副作用小的藥物用于NPC 治療［1-2］。血根堿（san?guinarine，SAN）是來源于白屈菜及博落回等罌粟科植物的苯并菲啶類生物堿，有抗菌、消炎、殺蟲等多種藥理作用，并具有抗腫瘤作用［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，SAN 可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬，但尚無關(guān)于SAN 對NPC細(xì)胞增殖及自噬影響的文獻(xiàn)。SAN 可抑制NPC 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，本研究觀察了SAN 對NPC細(xì)胞增殖及自噬的影響，探討增殖與自噬的關(guān)系，并從AMPK 信號通路研究其作用機(jī)制，為SAN 治療NPC提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人NPC 細(xì)胞株5-8F 購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司（批號：BNCC341932）；SAN（純度≥98%）購自上海源葉科技生物有限公司（批號：2447-54-3），稱取SAN 粉末20 mg，二甲基亞砜溶解，制成200 mmol/L 母液，-20 ℃避光保存，臨用前用RPMI1640 完全培養(yǎng)液稀釋；順鉑（cisplatin，上海源葉生物科技有限公司，批號：B24462）；RPMI1640 培養(yǎng)基（美國HyClone 公司，批號：SH30809.01B）；2.5 g/L 胰蛋白酶-EDTA 消化液（北京索萊寶公司，批號：T1320）；胎牛血清（美國Gibco 公司，批號：10099-141）；MTT（碧云天生物科技有限公司，批號：ST316）；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）、雷帕霉素（rapamycin）、AMPK抑制劑Compound C（MCE公 司，批 號：HY-19312-57232、HY-10219-61925、HY-13418-40374）；單丹磺酰戊二胺（MDC，北京索萊寶公司，批號：G0170）；BCA 蛋白定量試劑盒、凝膠配制試劑盒（康為世紀(jì)公司，批號：CW0014S-500T、CW0022S）；anti-β-actin、anti-PCNA、LC3、Beclin-1、p62、AMPK、p-AMPK、mTOR（CST，批 號：4970、13110、4108、3495、23214、5831、2535、2983，1：1 000稀釋）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔（CST，批號：75952）；賀利氏HERA cell 150i CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾公司）；全自動酶標(biāo)分析儀（ELX800，Bio Tek 公司）；實(shí)時無標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù)（real time cellular analysis，RTCA，DP3*16，艾森生物科技公司）；Odys?sey多功能熒光成像系統(tǒng)（Olympus公司）；CytationTM5細(xì)胞成像多功能檢測系統(tǒng)（Bio Tek 公司）；HT7700 透射電鏡（日本日立公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NPC 細(xì)胞5-8F 培養(yǎng)瓶中加入6 ml 完全培養(yǎng)液后，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)80%時進(jìn)行傳代。

1.2.2 MTT 法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期5-8F細(xì)胞，制成5×104個/ml 單細(xì)胞懸液，接種于96 孔板（100 μl/孔）。細(xì)胞貼壁后，棄舊培養(yǎng)液，分組，順鉑（0.004 g/L）為陽性對照組，每組5個復(fù)孔，藥液體積為200 μl/孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h、36 h、48 h，棄培養(yǎng)液，100 μl/孔加入現(xiàn)配的MTT 溶液孵育3～4 h，全自動酶標(biāo)分析儀檢測492 nm 處吸光度（OD），計算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率（%）=1-（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白孔）/（OD對照組-OD空白孔）×100%。

1.2.3 RTCA 檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期5-8F細(xì)胞消化，制成5×104個/ml單細(xì)胞懸液，接種于RTCA細(xì)胞增殖檢測培養(yǎng)板，參考胡晶等［5］方法，100 μl/孔加入細(xì)胞懸液，細(xì)胞生長到達(dá)平臺期前加入不同濃度藥物后繼續(xù)檢測72 h以上。

1.2.4 MDC 法檢測細(xì)胞自噬 取對數(shù)生長期5-8F細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/ml，接種至6孔板，細(xì)胞完全貼壁后棄舊培養(yǎng)液，按實(shí)驗(yàn)分組分別處理24 h，參考藺婷等［6］方法，PBS 沖洗3 次，加入50 μmol/L MDC 溶液孵育40 min，棄MDC 溶液，PBS 洗滌3 次，熒光顯微鏡拍照，Image Prox Plus軟件計算熒光強(qiáng)度。

1.2.5 透射電鏡觀察自噬形成情況 取對數(shù)生長期5-8F細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/ml，接種于培養(yǎng)瓶，細(xì)胞貼壁后根據(jù)分組處理24 h，參考藺婷等［6］方法制成單細(xì)胞懸液，裝入1.5 ml離心管，2 000 r/min離心6 min，棄上清，1 ml PBS 重懸2 次，離心，棄上清，各離心管中加入1 ml 2.5%戊二醛，4 ℃固定4～6 h，1%鋨酸固定液固定2 h，梯度丙酮脫水，浸透，包埋，固化，超薄切片，3%醋酸鈾和硝酸鉛染色，透射電鏡下觀察拍照。

1.2.6 Western blot 檢測蛋白表達(dá) 各組5-8F 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后冰上裂解30 min，離心，取上清，BCA 法定量，按80 μg 配樣，上樣后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，含50 g/L脫脂牛奶的TBST中封閉1 h，加入一抗4 ℃搖床孵育過夜，洗膜，室溫孵育二抗2 h，Odyssey多功能熒光成像儀掃膜，Image studio軟件框選條帶信號值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS23.0 及Gragh Pad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和制圖，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。本研究為單因素方差設(shè)計，計量資料如服從正態(tài)分布，采用單因素方差分析，多重比較滿足方差齊性，則采用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnet T3 檢驗(yàn)。不服從正態(tài)分布則采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.1 SAN抑制5-8F細(xì)胞增殖

2.1.1 MTT 檢測SAN 對5-8F 細(xì)胞增殖的影響5-8F 細(xì)胞經(jīng)不同濃度SAN 處理24 h、36 h、48 h，與Control 組相比，SAN 可顯著抑制5-8F 細(xì)胞增殖，且呈劑量依賴性（P＜0.01，圖1）。

圖1 MTT法檢測SAN對5-8F細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Inhibition of SAN on proliferation of 5-8F cells by MTT

2.1.2 RTCA 檢測SAN 對5-8F 細(xì)胞增殖的影響不同濃度SAN均可抑制5-8F細(xì)胞增殖（圖2）。RTCA、MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。根據(jù)增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇有顯著抑制作用的較低濃度的SAN（2.5、5 μmol/L）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，處理時間為24 h。

圖2 RTCA檢測SAN對5-8F細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Inhibition of SAN on proliferation of 5-8F cells by RTCA

2.1.3 Western blot 檢測SAN 對5-8F 細(xì)胞PCNA 蛋白表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果顯示，SAN（2.5、5 μmol/L）處理5-8F 細(xì)胞24 h 后，與Control 組相比，SAN降低了PCNA表達(dá)（P＜0.01，圖3）。

圖3 SAN對5-8F細(xì)胞PCNA蛋白的影響Fig.3 Effect of SAN on expression of PCNA protein in 5-8F cells

2.2 SAN對5-8F細(xì)胞自噬的影響

2.2.1 MDC 檢測SAN 對5-8F 細(xì)胞自噬的影響MDC 結(jié)果顯示，與Control 組相比，SAN 處理5-8F 細(xì)胞24 h 后，SAN 2.5、5 μmol/L 組平均熒光強(qiáng)度均增強(qiáng)（P＜0.01，圖4），表明細(xì)胞自噬效應(yīng)增強(qiáng)。

圖4 MDC檢測SAN對5-8F細(xì)胞自噬的影響（×20）Fig.4 Effect of SAN on autophagy of 5-8F cells by MDC（×20）

2.2.2 透射電鏡觀察SAN 對5-8F 細(xì)胞自噬的影響 Control 組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無自噬小體形成；與Control 組比較，SAN 組及自噬激活劑Rapamycin 組（陽性對照）細(xì)胞內(nèi)形成大量自噬小體（箭頭所示，圖5），表明SAN誘導(dǎo)了NPC細(xì)胞自噬。

圖5 透射電鏡觀察細(xì)胞自噬體形成情況（×20 000）Fig.5 Observation of autophagosome formation by TEM（×20 000）

2.2.3 SAN 對5-8F 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果顯示，與Control 組比較，SAN組LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01，P＜0.05），p62蛋白表達(dá)降低（P＜0.01，圖6）。提示SAN可誘導(dǎo)NPC細(xì)胞自噬。

圖6 SAN對5-8F細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of SAN on expressions of autophagy-related proteins in 5-8F cells

2.3 自噬在SAN抑制5-8F細(xì)胞增殖中的作用

2.3.1 MDC 檢測3-MA 預(yù)處理對SAN 誘導(dǎo)5-8F 細(xì)胞自噬的影響 MDC結(jié)果顯示，與SAN組相比，3-MA（自噬抑制劑）預(yù)處理后，SAN 誘導(dǎo)的熒光強(qiáng)度降低（P＜0.01，圖7），提示抑制自噬后，SAN 誘導(dǎo)NPC 細(xì)胞自噬的作用減弱。

圖7 MDC 檢測3-MA 對SAN 誘導(dǎo)5-8F 細(xì)胞自噬的影響（×20）Fig.7 Effect of SAN combined with 3-MA on autophagy of 5-8F cells by MDC（×20）

2.3.2 透射電鏡觀察細(xì)胞自噬體 透射電鏡結(jié)果顯示，與SAN組比較，3-MA預(yù)處理后，SAN誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬小體明顯減少（圖8）。提示抑制自噬后，SAN誘導(dǎo)NPC細(xì)胞自噬的作用減弱。

圖8 透射電鏡觀察3-MA 對SAN 誘導(dǎo)細(xì)胞自噬體形成的影響（×5 000）Fig.8 Observation of effect of SAN on autophagosome formation induced by 3-MA by TEM（×5 000）

2.3.3 3-MA 對SAN 抑制5-8F 細(xì)胞增殖的影響MTT 和RTCA 結(jié)果一致：與SAN 組比較，3-MA 預(yù)處理后，SAN 對細(xì)胞增殖的抑制作用減弱。提示抑制自噬后，SAN抑制NPC細(xì)胞增殖的作用減弱（圖9）。

圖9 3-MA聯(lián)合SAN對5-8F細(xì)胞增殖的影響Fig.9 Effect of 3-MA combined with SAN on proliferation of 5-8F cells

2.3.4 Western blot 檢測3-MA 預(yù)處理對SAN 調(diào)控5-8F 細(xì)胞增殖和自噬蛋白表達(dá)的影響 與SAN 組相比，3-MA 預(yù)處理后，SAN 上調(diào)LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白表達(dá)、下調(diào)p62、PCNA蛋白表達(dá)的作用減弱（P＜0.01，圖10）。提示抑制自噬后，SAN 抑制增殖蛋白表達(dá)的作用降低。

圖10 3-MA 聯(lián)合SAN 對5-8F 細(xì)胞增殖和自噬蛋白表達(dá)的影響Fig.10 Effect of 3-MA combined with SAN on proliferation and autophagy protein expression of 5-8F cells

2.4 SAN 通過AMPK/mTOR 通路誘導(dǎo)5-8F 細(xì)胞自噬抑制細(xì)胞增殖

2.4.1 SAN 對AMPK/mTOR 信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響 SAN 處理24 h 后，與Control 組相比，AMPK/mTOR 信號通路關(guān)鍵蛋白AMPK、p-AMPK 表達(dá)上調(diào)，mTOR 表達(dá)下調(diào)（P＜0.01，圖11），表明SAN能激活A(yù)MPK/mTOR信號通路。

圖11 SAN對AMPK/mTOR信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響Fig.11 Effect of SAN on expressions of key proteins in AMPK/mTOR signaling pathway

2.4.2 AMPK/mTOR 通路在SAN 誘導(dǎo)5-8F 細(xì)胞自噬抑制細(xì)胞增殖中的作用 Western blot 結(jié)果顯示，與Control 組相比，AMPK/mTOR 信號通路抑制劑Compound C 可 降 低AMPK、p-AMPK 表 達(dá)，升 高mTOR 表達(dá)（P＜0.01）；而AMPK 激活劑Rapamycin可升高AMPK、p-AMPK 表達(dá)，降低mTOR 表達(dá)（P＜0.01）；與SAN 組比較，Compound C 預(yù)處理后，SAN上調(diào)AMPK、p-AMPK 表達(dá)、抑制mTOR 表達(dá)的作用減弱（P＜0.01，圖12A），提示抑制AMPK/mTOR 信號通路后，SAN 激活A(yù)MPK/mTOR 信號通路的作用降低。MDC 結(jié)果顯示，與SAN 組相比，AMPK 抑制劑Compound C 預(yù)處理后，SAN 誘導(dǎo)自噬效應(yīng)明顯減弱（P＜0.01，圖12B），表明抑制AMPK/mTOR 信號通路后，SAN 誘導(dǎo)自噬效應(yīng)降低。與SAN 組比較，Com?pound C 預(yù)處理后，SAN 上調(diào)LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1 蛋白 表 達(dá)、下 調(diào)p62 表 達(dá) 的 作 用 減 弱（P＜0.01，圖12C），表明抑制AMPK/mTOR 信號通路后，SAN正調(diào)控自噬相關(guān)蛋白的作用降低。與SAN 組比較，Compound C 預(yù)處理后，SAN 組細(xì)胞增殖抑制作用減弱，下調(diào)PCNA 蛋白表達(dá)的作用也減弱（圖12D、E），表明抑制AMPK/mTOR 信號通路后，SAN 抑制細(xì)胞增殖的作用降低。

圖12 AMPK/mTOR 通路在SAN 誘導(dǎo)5-8F 細(xì)胞自噬抑制細(xì)胞增殖中的作用Fig.12 Role of AMPK/mTOR pathway in SAN induced autophagy and inhibition of cell proliferation in 5-8F cells

3 討論

NPC 發(fā)病率占頭頸部惡性腫瘤首位，且易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［7］。腫瘤細(xì)胞無限分裂增殖是腫瘤生長過程中的一種常見生物學(xué)行為，抑制腫瘤細(xì)胞增殖可抑制腫瘤細(xì)胞生長和浸潤轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，SAN 可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，包括肺癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌等［8］，SAN 與NPC 細(xì)胞的關(guān)系研究尚未見報道。MTT 和RTCA 結(jié)果顯示，SAN 處理細(xì)胞后，5-8F 細(xì)胞增殖率降低，PCNA 蛋白表達(dá)下降，即SAN可抑制NPC細(xì)胞增殖。

自噬被稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，是一種廣泛存在于真核生物細(xì)胞、進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞降解過程［9］。自噬具有雙重性，正常范圍的自噬對細(xì)胞生長有保護(hù)和修復(fù)作用，而過度自噬通過破壞細(xì)胞內(nèi)正常蛋白和細(xì)胞器導(dǎo)致不可逆損傷和死亡，誘發(fā)細(xì)胞凋亡與壞死［10］。近年以自噬為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物誘發(fā)NPC 細(xì)胞過度自噬，繼而引起細(xì)胞死亡成為研究熱點(diǎn)。微管相關(guān)蛋白（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）參與自噬過程，自噬發(fā)生時，自噬小體吞噬胞質(zhì)成分，包括胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞器，同時將胞質(zhì)形式LC3（LC3Ⅰ）與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)，形成LC3-磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)物（LC3 Ⅱ），將其募集至自噬體膜［11］。LC3Ⅱ作為自噬的標(biāo)志分子，其表達(dá)與自噬活性呈正相關(guān)［12-14］。Beclin-1 是自噬相關(guān)蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，Beclin-1 過表達(dá)通過人類滑膜肉瘤細(xì)胞的自噬依賴性途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖和存活，同時，LC3Ⅱ表達(dá)升高，而p62 表達(dá)降低，Beclin-1 過表達(dá)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)多個自噬體，表明其自噬活性增強(qiáng)［15］。泛素化結(jié)合蛋白（sequestosome 1，SQSTM1/p62）是一種磷酸化蛋白，作用域?qū)挿?，與腫瘤細(xì)胞活性呈正相關(guān)［16］。目前對SAN 抗腫瘤作用機(jī)制的研究主要涉及抑制增殖、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)凋亡、抗腫瘤血管生成、抑制侵襲轉(zhuǎn)移等，近期研究發(fā)現(xiàn)，SAN 可通過抑制ROS，激活ERK1/2 誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬［17］。徐加英［18］發(fā)現(xiàn)，SAN 可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞自噬，自噬抑制劑可削弱SAN 抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞和Siha細(xì)胞增殖的作用，自噬相關(guān)蛋白LC3 和Beclin-1 參與這一過程。AMPK 是細(xì)胞的能量傳感器和營養(yǎng)通路激活的主要成分，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長和自噬。姚宗花等［19］通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，吉馬酮通過激活A(yù)MPK 信號通路，抑制宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，提高LC3 含量而促進(jìn)自噬。李沫等［20］發(fā)現(xiàn)，CCAT1 過表達(dá)可能通過激活PI3K/Akt/mTOR 信號通路抑制宮頸癌HeLa 細(xì)胞自噬。

本研究顯示，SAN 處理NPC 細(xì)胞后，LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白表達(dá)上調(diào)，p62表達(dá)下調(diào)。同時MDC染色法和透射電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SAN 作用5-8F 細(xì)胞24 h后，與溶劑組比較，5-8F 細(xì)胞呈明顯自噬，說明SAN具有誘導(dǎo)NPC 細(xì)胞自噬的作用。3-MA 是一種自噬抑制劑，3-MA 預(yù)處理后，SAN 誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬效應(yīng)減弱，表明SAN 能夠誘導(dǎo)5-8F 細(xì)胞自噬，而抑制自噬后，SAN 誘導(dǎo)5-8F 細(xì)胞自噬的作用減弱。同時，SAN 對5-8F 細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)被削弱。為進(jìn)一步探究SAN 誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的分子機(jī)制，檢測AMPK/mTOR 信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SAN 可激活A(yù)MPK/mTOR 通路，抑制AMPK 后，SAN 誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的作用減弱，同時，SAN 對細(xì)胞增殖的抑制作用降低。

綜上，SAN 可通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬抑制NPC 細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與激活A(yù)MPK/mTOR 信號通路有關(guān)。