機(jī)體抗病毒過程中細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展①

李 武 劉占有 王健宏 （寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川750021）

細(xì)胞死亡和存活的潛在機(jī)制對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要影響，其失調(diào)可能導(dǎo)致多種疾病發(fā)生、發(fā)展，而細(xì)胞死亡方式分類主要依賴于單個(gè)細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)等改變，分為細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死、細(xì)胞自噬和細(xì)胞焦亡［1］。細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主有序性死亡，與細(xì)胞壞死不同，其是一個(gè)主動(dòng)過程，涉及一系列基因激活、表達(dá)和調(diào)控，主要特征為核膜皺縮，并形成凋亡小體。病毒是地球上最豐富的微生物之一，是由1 個(gè)核酸分子和蛋白構(gòu)成的一種非細(xì)胞形態(tài)，專營(yíng)寄生生活從而獲取生命活動(dòng)所需物質(zhì)和能量的有機(jī)物種，和其他生物一樣，均具有遺傳、變異及進(jìn)化能力，可感染所有類型細(xì)胞生命形式［2］。近年新發(fā)或再發(fā)病毒性流行病經(jīng)常成為全球性公共衛(wèi)生問題［3］。

當(dāng)病毒進(jìn)入機(jī)體感染細(xì)胞后會(huì)引起3種不同形式細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD），即細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死和細(xì)胞焦亡［4-5］。其中，凋亡是病毒感染期間研究最為廣泛的PCD。但病毒感染引起的細(xì)胞凋亡對(duì)病毒復(fù)制既有正面影響，也有負(fù)面影響。一方面，宿主細(xì)胞可通過凋亡消除病毒感染細(xì)胞，從而中止病毒感染，當(dāng)病毒感染誘發(fā)細(xì)胞凋亡后，機(jī)體通過免疫細(xì)胞進(jìn)行吞噬。另一方面，某些病毒利用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡釋放和傳播子代病毒［6］。這兩種情況下，均需要病毒產(chǎn)生某些產(chǎn)物阻斷或延遲細(xì)胞凋亡，進(jìn)而使病毒復(fù)制得以成功并產(chǎn)生足夠后代［7-8］。

1 細(xì)胞凋亡概述

細(xì)胞凋亡受多基因控制，是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，不僅在多細(xì)胞生物中去除不需要以及異常的細(xì)胞中起必要作用，還在生物體進(jìn)化和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。目前普遍認(rèn)為細(xì)胞凋亡由兩條不同信號(hào)途徑觸發(fā)，即死亡受體介導(dǎo)的胞外途徑和胞內(nèi)應(yīng)激引起的內(nèi)源途徑。

1.1 內(nèi)源性凋亡途徑 內(nèi)源性凋亡途徑又稱線粒體/細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cytc）介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，由多種細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激條件引起，包括細(xì)胞因子剝奪、DNA 損傷、氧化應(yīng)激、胞質(zhì)Ca2+過多和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等。這些異質(zhì)性凋亡信號(hào)匯集使線粒體外膜通透性（mitochondrial outer membrane permeablisa?tion，MOMP）增加，從而促進(jìn)Cytc和其他線粒體因子向細(xì)胞質(zhì)釋放，釋放到胞漿的Cytc 在dATP 存在條件下可與凋亡蛋白酶活化因子1（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）結(jié)合形成多聚體，并進(jìn)一步通過Caspase 激活和募集結(jié)構(gòu)域（caspase activa?tion and recruitment domain，CARD）募集pro-caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體，從而激活caspase-9，并進(jìn)一步激活caspase-3，-6，-7 等［9-10］。而caspase-3 最具代表性，可裂解聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［Poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］，終止DNA 修復(fù)，還能活化核酸內(nèi)切酶，使DNA 片段化，破壞細(xì)胞骨架，使正常細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

1.2 外源性凋亡途徑 引發(fā)凋亡的外源途徑由與死亡受體結(jié)合的死亡配體觸發(fā)，由胞外TNF 超家族的死亡配體如TNF-α、FasL、CD95L 等引發(fā)，這些配體和相關(guān)細(xì)胞表面死亡受體（分別為TNFR、Fas、CD95）結(jié)合，使受體三聚化并激活，三聚化的死亡受體通過死亡結(jié)構(gòu)域募集銜接蛋白，如TNFR1 相關(guān)死亡域蛋白（TNFR1-associated death domain，TRADD）［11］。銜接蛋白通過死亡效應(yīng)域（death effecter domain，DED）與Pro-caspase-8形成復(fù)合物，稱為死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（death-inducing signaling complex，DISC）［12-13］。Pro-caspase-8 具有弱的催化活性，可發(fā)生自我剪切并活化，并直接誘導(dǎo)caspase-3 和caspase-7 激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［14］。其中死亡受體是Ⅰ型跨膜蛋白，其特征為細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)含1～5個(gè)富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和60～80 個(gè)氨基酸的胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域［15］。激活的caspase-8 還能使胞質(zhì)中的促凋亡因子Bid（binding interface database）斷裂成tBid，tBid轉(zhuǎn)移到線粒體后會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)Cytc 從線粒體釋放進(jìn)入胞質(zhì)，從而將死亡受體通路和線粒體通路聯(lián)系起來，有效擴(kuò)大了凋亡信號(hào)［16-17］。

2 細(xì)胞凋亡與病毒感染

2.1 病毒感染促進(jìn)細(xì)胞凋亡 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可幫助病毒在感染后期殺死細(xì)胞釋放的未成熟病毒粒子，可能是病毒刺激機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答間接誘導(dǎo)的。如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lym?phocyte，CTL）和NK 細(xì)胞可通過穿孔蛋白/顆粒酶途徑殺傷病毒感染的靶細(xì)胞，激活成功后，這些細(xì)胞通過主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ（major histocompati?bility complexⅠ，MHCⅠ）/肽/T 細(xì)胞抗原受體（T cell receptor，TCR）與共刺激的分子相互作用，從免疫突觸處的細(xì)胞毒顆粒釋放穿孔素和顆粒酶A和B［18-19］。穿孔素在靶細(xì)胞膜中寡聚為高分子結(jié)構(gòu)，并在靶細(xì)胞膜上形成多聚穿孔素管狀通道，允許顆粒酶A和B進(jìn)入，而顆粒酶B 可直接激活caspase-3 引發(fā)細(xì)胞凋亡，或觸發(fā)促凋亡因子Bax或Bak使MOMP增加［19-20］。病毒還可通過上調(diào)FasL/Fas 和TNF-α/TNFR-1 表達(dá)間接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。文獻(xiàn)記載，流感病毒感染的淋巴細(xì)胞亞群中，CD4+、CD8+均會(huì)發(fā)生細(xì)胞凋亡，且在凋亡細(xì)胞表面Fas 發(fā)生高表達(dá)［21］。除間接誘導(dǎo)外，病毒還可直接激活caspase途徑，一些病毒可通過活化caspase 啟動(dòng)因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。如風(fēng)疹病毒（nubellavirus，RV）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡依賴于caspase通路，細(xì)胞凋亡程度與caspase-3 活性有關(guān)［22］。抑癌基因p53 可誘導(dǎo)促凋亡蛋白Noxa 和Puma 轉(zhuǎn)錄，有助于受損細(xì)胞消除，表明p53 不僅對(duì)預(yù)防癌癥至關(guān)重要，對(duì)誘導(dǎo)某些感染宿主細(xì)胞凋亡也至關(guān)重要（圖1）［23］。一些病毒還可改變細(xì)胞周期誘導(dǎo)細(xì)胞在分裂期發(fā)生阻滯，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

2.2 病毒產(chǎn)物抑制細(xì)胞凋亡 盡管宿主可通過防御機(jī)制限制病毒復(fù)制使感染的細(xì)胞盡早凋亡，從而釋放不具抵抗力的未成熟病毒粒子，使其在宿主蛋白酶及溶酶體作用下被消滅。但一些病毒為順利繁殖，已進(jìn)化出在病毒感染早期的產(chǎn)物抑制細(xì)胞凋亡?？紤]到多種刺激物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡內(nèi)在線粒體途徑的重要性，病毒已獲得了抑凋亡蛋白Bcl-2同型異構(gòu)體vBcl-2s，從而在宿主細(xì)胞中有效抑制MOMP，存在于痘病毒、皰疹病毒、腺病毒（E1B-19K）等病毒家族［24-26］。如腺病毒的EIB-19K 缺失株可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而EIB-19K 含有Bc1-2 家族的BH1 保守結(jié)構(gòu)域，可同凋亡蛋白Bc1-2 家族成員Bax、Bak、Bik 反應(yīng)，抑制其活性，從而抑制凋亡（圖1）［23］。表明EIB-19K編碼的產(chǎn)物具有與Bc1-2相似的功能。

圖1 內(nèi)源性細(xì)胞凋亡及病毒產(chǎn)物抑制細(xì)胞凋亡過程［23］Fig.1 Endogenous apoptosis and inhibition of apoptosis by viral gene products［23］

其他病毒產(chǎn)物還可通過在轉(zhuǎn)錄水平或通過翻譯后修飾調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員，從而抑制內(nèi)在線粒體信號(hào)傳導(dǎo)途徑。如病毒已演變出能夠使p53失活的策略，猿猴空泡病毒40（simian vacuolating virus 40，SV40）大T 抗原可與p53 結(jié)合并將其螯合在無活性復(fù)合物中［27］；人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）E6 蛋白和腺病毒（adenovirus，AV）E1B-55K 蛋白誘導(dǎo)p53泛素化和蛋白酶體降解［28-29］。此外，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBx）的X 蛋白與p53 相互作用能夠阻止其靶基因轉(zhuǎn)錄激活，從而抑制細(xì)胞凋亡（圖1）［30］；麻疹病毒（measles virus，MV）V 蛋白也采用了類似策略，通過隔離p53 同源蛋白p73 阻止細(xì)胞凋亡［31］。

此外，病毒可通過轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 有效阻斷內(nèi)在線粒體和外在死亡受體信號(hào)傳導(dǎo)［32］。NF-κB誘導(dǎo)抑凋亡蛋白Bcl-xL、caspase-8抑制劑FLIP、或凋亡蛋白抑制劑（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）等轉(zhuǎn)錄，后者通常直接或間接充當(dāng)caspase 抑制劑［33］。如Ⅰ型單純皰疹病毒（herpes simplex virus-Ⅰ，HSV-Ⅰ）通過其包膜糖蛋白D（glycoprotein-D，GP-D）利用TNFR 家族成員進(jìn)入宿主細(xì)胞，從而觸發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致NF-κB 激活并抑制細(xì)胞凋亡［34］；病毒產(chǎn)物還可通過抑制caspase 合成有效抑制細(xì)胞凋亡。內(nèi)在線粒體途徑中的caspase-3/-7/-9 均可被IAPS 抑制（圖1）［35］。

3 病毒感染的細(xì)胞與吞噬作用

3.1 病毒感染的凋亡細(xì)胞清除 被病毒感染的細(xì)胞凋亡后之所以能夠完全消失，原因?yàn)槠浔幻庖呒?xì)胞吞噬和消化。吞噬細(xì)胞消除凋亡過程非常迅速，以致在組織和器官中很少檢測(cè)到凋亡細(xì)胞。經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞保持質(zhì)膜通透性完整，直到被吞噬細(xì)胞吞噬為止，細(xì)胞中的未成熟病毒粒子無法泄漏，不會(huì)破壞周圍組織。因此，凋亡被認(rèn)為是細(xì)胞死亡的一種生理沉默模式［36］。被病毒感染的細(xì)胞發(fā)生凋亡后，釋放一些物質(zhì)，進(jìn)而招募吞噬細(xì)胞，許多分子可充當(dāng)此類信號(hào)，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核苷酸等。雖然caspase 介導(dǎo)的典型凋亡在病毒感染的細(xì)胞中很明顯，但這些細(xì)胞中的病毒復(fù)制似乎并未受到損傷，可能因?yàn)檫@類病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后會(huì)迅速產(chǎn)生后代。文獻(xiàn)報(bào)道，為確定被病毒感染后凋亡的作用，以及感染了病毒的細(xì)胞是否被吞噬細(xì)胞吞噬，采用小鼠巨噬細(xì)胞作為吞噬細(xì)胞進(jìn)行體外吞噬作用檢測(cè)結(jié)果表明，被病毒感染的細(xì)胞易于吞噬，病毒繁殖受到抑制［37］；小鼠體內(nèi)感染模型進(jìn)一步研究表明，巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞參與了被甲型流感病毒感染的細(xì)胞吞噬作用，有助于減輕小鼠流感病理［38］。但負(fù)責(zé)將這些吞噬細(xì)胞募集至病毒感染細(xì)胞部位的信號(hào)尚不清楚。病毒感染細(xì)胞凋亡使其更易被吞噬，而這種直接消除病毒的機(jī)制可作為一種抗病毒免疫應(yīng)答。

3.2 凋亡依賴的吞噬作用對(duì)免疫系統(tǒng)的貢獻(xiàn) 近年對(duì)細(xì)胞凋亡依賴吞噬作用的機(jī)制和作用研究表明，這種吞噬作用不僅能清除不需要的細(xì)胞，且具有維持組織穩(wěn)態(tài)的附加作用，以便直接清除病毒感染細(xì)胞，從而提高機(jī)體對(duì)病毒的免疫力。主要體現(xiàn)在以下方面：①炎癥消退，當(dāng)病毒感染宿主后，會(huì)引起中性粒細(xì)胞凋亡，而巨噬細(xì)胞會(huì)很快將其吞噬，去除產(chǎn)生和分泌促炎細(xì)胞因子的細(xì)胞，因此吞噬細(xì)胞吞入病毒感染的細(xì)胞除可清除病毒外，還能夠改變細(xì)胞因子種類，使炎癥消退［36，39］；②抗原呈遞，當(dāng)病毒感染宿主細(xì)胞后，抗原呈遞細(xì)胞吞噬被病毒感染的凋亡細(xì)胞，通過對(duì)病毒蛋白進(jìn)行處理，并將病毒抗原呈遞給CTL 使其活化，活化的CTL 可誘導(dǎo)同一病毒感染細(xì)胞并使其凋亡［40］；③形成免疫記憶，具有先天和適應(yīng)性免疫的動(dòng)物，第一次接觸病毒時(shí)，會(huì)使宿主機(jī)體為第二次接觸相同病毒做好相應(yīng)準(zhǔn)備（圖2）［41］。

圖2 病毒感染后凋亡細(xì)胞清除［41］Fig.2 Elimination of apoptotic cells after virus infection［41］

4 結(jié)語

多數(shù)生物體均易受到病毒感染，因此機(jī)體已獲得了獨(dú)特的機(jī)制防止病毒入侵、擴(kuò)散和釋放。如病毒感染的細(xì)胞凋亡后，通過吞噬作用直接從體內(nèi)清除病毒。但在病毒感染后，細(xì)胞被誘導(dǎo)發(fā)生凋亡，這一過程使細(xì)胞基因表達(dá)和增殖機(jī)制失活，從而使入侵病毒在感染細(xì)胞中產(chǎn)生后代。細(xì)胞凋亡仍是去除機(jī)體不需要或異常細(xì)胞的主要生物學(xué)過程，是唯一維持細(xì)胞膜通透性的細(xì)胞死亡方式。另一個(gè)問題是，某些類型病毒產(chǎn)物中，通過拮抗caspase 從而抑制細(xì)胞凋亡，因此抑制病毒蛋白產(chǎn)生可能是一種有效治療方法［41］。病毒感染細(xì)胞的凋亡依賴吞噬作用可能隨著針對(duì)病毒誘導(dǎo)疾病新療法發(fā)展而成為靶標(biāo)，因此增強(qiáng)病毒感染細(xì)胞的凋亡也可能是一種治療方法。還可給患者使用攜帶病毒抗原的凋亡細(xì)胞，有望獲得抗病毒適應(yīng)性免疫。為實(shí)現(xiàn)以上這些假設(shè)，需要更詳細(xì)地研究病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡潛在機(jī)制。病毒感染抑制細(xì)胞凋亡與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是并行的，且對(duì)病毒存活均有有利影響，因此，研究病毒感染與細(xì)胞凋亡的關(guān)系及凋亡機(jī)制，將有助于認(rèn)識(shí)病毒感染發(fā)生發(fā)展，為病毒病防治提供新的思路。