探討地西他濱短時刺激對RAK細胞免疫表型及抗癌活性的影響①

李潔羽 周智鋒 林萬松 陳淑萍 葉韻斌 （福建醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，福建省腫瘤醫(yī)院腫瘤免疫學研究室，福建省腫瘤轉化醫(yī)學重點實驗室，福州350014）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國最常見的惡性腫瘤之一，由于HCC 患者免疫功能低下，術后復發(fā)率高，對放化療不敏感，導致總體治療效果不理想［1］。近年來，越來越多的證據表明，過繼免疫治療（adoptive immunotherapy，ACI）可有效降低腫瘤的復發(fā)和轉移，且不良反應低，相對安全，逐漸成為治療腫瘤的新型輔助或替代療法［2-3］。重組人纖維連接蛋白（RetroNectin，RN）主要來源于大腸桿菌中表達RN 的基因片段，是擴增的人纖維連接蛋白的一種嵌合體，廣泛應用于基因轉染領域［4-5］。相關基礎研究證實，RN 能抵抗細胞高度活化誘發(fā)的細胞凋亡，使細胞保持高分裂狀態(tài)從而促進增殖，因此RN 與抗CD3 單抗相結合可高效地刺激細胞的附著、伸展、分化和增殖，從而獲得增殖率和活力更高的免疫活性細胞，即RAK細胞，其是臨床上細胞免疫治療常用的廣譜而有效的免疫效應細胞。

地西他濱（5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷，Decitabine，DAC）是一種胞嘧啶類似物，能夠競爭性地抑制DNA 甲基轉移酶活性，使DNA 去甲基化，再次激活表觀遺傳沉默基因，誘導細胞分化［6-7］。既往研究證實，體外誘導的NK 細胞經DAC 刺激后，殺傷作用和因子分泌功能增強［8］。DAC 處理的嵌合抗原受體T（dCAR-T）細胞的增殖、抗腫瘤活性和細胞因子產生均得到增強［9］。本研究將探討不同濃度的DAC短時刺激對RAK 細胞增殖、免疫表型及抗肝癌效應的影響。體外藥物的加入可能是誘導培養(yǎng)具有更佳抗腫瘤特性的效應細胞的一種策略，為過繼細胞免疫治療腫瘤提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細胞株HepG2 為本實驗室保存。KBM-581培養(yǎng)基購自美國Corning公司；細胞培養(yǎng)基DMEM 購 自 美 國Hyclone 公 司；CD3 單 克 隆 抗 體（CD3McAb）、重組人白細胞介素2（recombinant hu?man interleukin-2，rhIL-2）購自PeproTech 公司；Ficoll-Paque 分離液購自GE 公司；鼠抗人淋巴細胞亞群試劑盒MultitestTMKit、Annexin Ⅴ-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒、CD3-PerCP/CD8-APC/CD45RA-FITC/CD62L-PE Kit、IFN-γ-PE、顆粒酶-B（Granzyme B，GrB）-PE、穿孔素（perforin）-FITC、CD107a-PE、Intra?SureTM試劑盒、GolgiStopTM蛋白質轉運抑制劑購自BD公司；二辛5，6-羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯（5，6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，

CFSE）細胞增殖檢測試劑盒購自Invitrogen 公司；佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）、離子霉素購自Sigma-Aldrich 公司；TC-20 自動細胞計數儀、凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司；FACS CantoⅡ流式細胞儀購自BD 公司；Leica AF 活細胞工作站購自德國徠卡公司。

1.2 方法

1.2.1 RAK 細胞培養(yǎng) RN（12.5 μg/ml）和抗CD3 McAb（5 μg/ml）提前24 h 包被6 孔板，4 ℃冰箱放置過夜，使用前用培養(yǎng)基沖洗1 次。抽取3 例健康供者（已簽署知情同意書）外周血30 ml，淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononu?clear cell，PBMC），生理鹽水洗滌。以含0.5%自體血漿的KBM-581培養(yǎng)基調整細胞濃度為1×106個/ml，接種于6 孔板，加入IL-2（500 U/ml），37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。后續(xù)培養(yǎng)根據情況每3 d 添加IL-2 及新鮮培養(yǎng)液。顯微鏡觀察細胞活力（活細胞應＞80%），鏡下動態(tài)觀察RAK細胞增殖情況。

1.2.2 RAK 細胞分組及增殖實驗 RN 結合CD3McAb 包被6 孔板，將RAK 細胞分為6組接種于6孔板，3孔/組。初始細胞數3×106個/孔，其中以不加藥物的RAK 細胞為對照組，其他組為不同濃度的DAC（50、500、1 000、2 000、3 000 nmol/L）刺激組，藥物作用RAK 細胞24 h 后，全量更換新培養(yǎng)液，并加入IL-2 繼續(xù)培養(yǎng)，分別于4 d、7 d、10 d 和12 d 進行細胞計數，觀察不同濃度DAC 對細胞增殖的影響。CFSE是標記活細胞的熒光染料，在細胞分裂增殖過程中，染料可平均分配到子代細胞中，以CFSE 為細胞增殖示蹤物，調節(jié)RAK 細胞密度為1×106個/ml，每毫升細胞中加入2 μl CFSE 儲存液，終濃度為10 μmol/L，37 ℃孵育10 min，加入5倍體積的冷培養(yǎng)基終止染色，冰上孵育5 min，300 g 離心5 min，沉淀細胞用新鮮培養(yǎng)基洗滌3 次后加IL-2 常規(guī)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)第3、4、5 天收集細胞，流式細胞儀488 nmol/L激發(fā)光檢測CFSE細胞增殖。

1.2.3 流式細胞術細胞免疫表型分析 收集第4、7、10、12天的RAK細胞，調整各濃度組細胞數為5×105～10×105個，采用Multitest CD3-FITC/CD8-PE/CD45-Per?CP/CD4-APC、CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC、CD3-PerCP/CD8-APC/CD45RA-FITC/CD62LPE Kit（記憶表型）流式熒光抗體標記細胞，4 ℃孵育30 min 后上機檢測RAK 細胞經不同濃度DAC 刺激后的T細胞亞群（CD4+、CD8+）、NKT細胞（CD3+CD56+CD16+）比例。采用BD FACS CantoⅡ流式細胞儀的FACS DivaTM軟件進行檢測，FlowJo7.6.1 軟件分析數據。

1.2.4 Annexin Ⅴ/PI檢測DAC 對RAK 細胞凋亡的影響 不同濃度的DAC（0、50、500、1 000、2 000、3 000 nmol/L）刺激RAK細胞24 h后，分別于4 d、7 d、10 d、12 d 收集細胞，按照凋亡檢測試劑盒說明書加入Binding buffer 與FITC 標記的Annexin-Ⅴ室溫避光30 min，再加入PI避光孵育5 min，1 h內于流式細胞儀檢測凋亡水平。

1.2.5 不同濃度DAC刺激對RAK細胞效應功能的影響 培養(yǎng)第10天，收集各組不同濃度DAC刺激的RAK 細胞，調整濃度為2.0×105個/ml 置于96 孔板，加入50 ng/ml PMA、1 μg/ml 離子霉素刺激，培養(yǎng)基中含有蛋白質轉運抑制劑GolgiStopTM，于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中共同孵育5 h 后收獲細胞，采用CD3-PerCP/CD8-APC 抗體進行細胞表面染色。加入BD IntraSureTM試劑盒中Fix&Perm 破膜劑A 和破膜劑B 各100 μl，4 ℃下進行胞內染色，分別加入IFN-γ-PE、perforin-FITC、GrB-PE 各5 μl，避光孵育30 min，最終以PBS 洗滌后重懸，同時設置同型對照管。RAK 細胞表面溶酶體相關膜蛋白1（lysosome associated membrane protein 1，LAMP1，又名CD107a）表達的分析：收集培養(yǎng)第10 天的各組DAC 刺激的RAK細胞，按RAK細胞：HepG2靶細胞=10：1（1×106：1×105）在U 型底的96 孔板中充分混勻，然后向細胞混合物中加入5 μl CD107a-PE 抗體，2 h后加入蛋白轉運抑制劑GolgistopTM（終濃度：10 μg/ml）溫和混勻后，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，4 h 后收集細胞，按上述方法進行表面染色，流式檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有數據均采用xˉ±s表示，組間比較采用t檢驗，應用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計軟件分析實驗結果，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DAC 刺激的RAK 細胞的形態(tài)學觀察 6 種不同劑量DAC 刺激的RAK 細胞培養(yǎng)至第10 天時，顯微鏡下細胞大部分呈圓形，團簇狀生長，隨著DAC濃度增大，細胞團逐漸減少（圖1、圖2）。

圖1 RAK細胞培養(yǎng)的實驗流程圖Fig.1 Flow chart of RAK cell culture

圖2 不同劑量DAC刺激的RAK細胞的生長狀態(tài)Fig.2 Growth status of RAK cells treated with different concentrations of DAC

2.2 DAC 對RAK 細胞增殖的影響 隨著培養(yǎng)時間延長，細胞總數逐漸增加，培養(yǎng)至第12天時，DAC高濃度組（2 000 nmol/L、3 000 nmol/L）與50 nmol/L 組相比，細胞數量顯著減少（圖3A）。如圖3B、C所示，RAK細胞在第4天快速增殖，添加不同濃度的DAC各組增殖率分別為（83.40±0.55）%、（82.4±3.30）%、（81.80±2.19）%、（79.50±3.46）%、（76.80±6.33）%、（71.40±6.78）%，DAC 3 000 nmol/L 組增殖率顯著低于DAC 50、500、1 000 nmol/L組（P＜0.05），提示DAC濃度越大，對細胞增殖抑制越顯著。

圖3 DAC對RAK細胞增殖的影響Fig.3 Effects of DAC on proliferation of RAK cells

2.3 DAC 對RAK 細胞免疫表型的影響 隨著培養(yǎng)時間延長，各組RAK 細胞CD4 比例呈上升趨勢，CD8 比例呈下降趨勢。與對照組相比，培養(yǎng)第10 天高濃度DAC 組（1 000、2 000、3 000 nmol/L）RAK 細胞CD4 比例顯著升高（P＜0.05），CD8 比例顯著降低（P＜0.05），見圖4。各組RAK細胞NKT（CD3+CD56+）比例隨培養(yǎng)時間延長呈上升趨勢，在第12 天，3 000 nmol/L DAC 刺激RAK 細胞組NKT 比例明顯升高（P＜0.01），見圖5。第10天收集各組RAK 細胞檢測記憶表型，發(fā)現CD4+或CD8+TCM（CD45RA-/CD62L+）表達隨DAC 濃度增加呈下降趨勢（P＜0.05），而CD4+或CD8+的TEM（CD45RA-/CD62L-）表達隨DAC 濃度增加呈輕度上升趨勢。同時比較CD4+TCM 與CD8+TCM 表達，可觀察到前者比例略高于后者（圖6）。

圖4 不同濃度DAC 刺激的RAK 細胞在不同時間點對CD4、CD8表達的影響Fig.4 CD4 and CD8 expressions of RAK cells in different DAC concentrations and time points

圖5 不同濃度DAC 刺激的RAK 細胞在不同時間點對NKT表達水平的影響Fig.5 NKT expression of RAK cells in different DAC concentration and time points

圖6 不同濃度DAC對RAK細胞記憶表型的影響Fig.6 Effects of different concentrations of DAC on memory phenotype of RAK cells

2.4 DAC 對RAK 細胞凋亡水平的影響 與對照組相比，隨著培養(yǎng)時間延長，高濃度DAC 刺激組（1 000、2 000、3 000 nmol/L）凋亡水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），提示DAC 濃度超過1 000 nmol/L 時可促進RAK細胞凋亡（圖7）。

圖7 不同濃度DAC對RAK細胞凋亡的影響Fig.7 Effects of different concentrations of DAC on apoptosis of RAK cells

2.5 DAC 對RAK 細胞效應功能的影響 于培養(yǎng)第10 天收集不同濃度DAC 刺激的RAK 細胞檢測免疫效應相關分子表達。圖8A 顯示，與其他DAC 濃度組相比，1 000 nmol/L DAC 刺激組IFN-γ水平顯著升高（P＜0.05）。500 nmol/L 和1 000 nmol/L DAC 刺激組的perforin 表達高于0 nmol/L 和50 nmol/L DAC刺激組（P＜0.01）。500 nmol/L 和1 000 nmol/L DAC刺激組的GrB 表達略高于其他組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。以HepG2為靶細胞，按效靶比10：1與RAK 細胞共孵育，流式細胞術檢測RAK 細胞表面CD107a 表達，圖8B 顯示，經500、1 000 nmol/L DAC 刺激的RAK 細胞的細胞毒效應分子CD107a的陽性率較對照組提高更為明顯（P＜0.05）。

圖8 不同濃度DAC對RAK細胞毒活性的影響Fig.8 Effects of different concentrations of DAC on cytotoxic activity of RAK cells

3 討論

過繼性免疫治療（adoptive cell transfer therapy，ACT）領域正在快速發(fā)展，以T 細胞為主的細胞免疫治療受到廣泛關注，科學家們對如何優(yōu)化T 細胞的生成、提高T 細胞殺傷效率、減少T 細胞耗竭、開發(fā)通用型T細胞、減少腫瘤微環(huán)境抑制、降低臨床毒性等問題展開了深入研究［10-12］。RN 是重組人纖維連接蛋白片段，包括細胞結合域、肝磷脂結合域和CS-1位點3 個功能區(qū)域，包被在培養(yǎng)介質上的RN 與CD3Ab 協(xié)同作用可有效刺激外周血T 細胞的附著、伸展、分化和增殖［13］。本研究采用RN 聯合CD3Ab包被后加入IL-2 共同刺激PBMC，獲得了上萬倍增殖的RAK細胞，大大提高了細胞培養(yǎng)效率。RAK細胞是廣譜的免疫效應細胞，在這個異質性細胞群體中，主要的效應細胞為CD3+CD8+細胞毒T 細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）。目前為提高T 細胞制品的治療效果，許多研究主要集中于應用藥物或細胞因子等進行誘導培養(yǎng)及條件優(yōu)化，提高效應細胞的體外增殖水平及免疫活性。

DAC 是FDA 批準的DNA 去甲基化劑，已被證實能夠抑制DNA甲基轉移酶，逆轉衰竭相關的DNA甲基化程序，從而在體內外激活表觀遺傳沉默的基因［14-15］。本研究在體外添加不同濃度的DAC 對RAK細胞進行短時刺激（24 h），然后充分去除藥物，在不同時間點觀察藥物作用后RAK 細胞的生長趨勢和免疫效應活性。CFSE增殖實驗結果顯示，RAK細胞在培養(yǎng)第4天快速增殖，高劑量的DAC，特別是3 000 nmol/L組增殖率顯著低于50、500、1 000 nmol/L DAC 組。細胞計數結果提示，隨著培養(yǎng)時間延長，細胞總數逐漸增多，到培養(yǎng)后期DAC 高濃度組（2 000、3 000 nmol/L）細胞數量顯著降低，提示DAC濃度越高，對細胞擴增抑制越顯著。RAK 細胞群是以CD8+為主的細胞群，隨著培養(yǎng)時間延長，CD8+比例可達80%以上，盡管CD8+T 細胞是發(fā)揮腫瘤殺傷作用的主要細胞群，但CD4+T 細胞的調節(jié)性和記憶維持性不容忽視，失去CD4+T 細胞的輔助會導致CD8+T 細胞耗竭［12］。因此不論是體外擴增培養(yǎng)，或是基因工程改造的T 細胞，合適的CD4+/CD8+T 細胞都有利于二者相互協(xié)調共同發(fā)揮抗腫瘤作用［17］。在細胞制品中提高CD4+T 細胞比例，可能是提高過繼免疫細胞療效的關鍵。本研究發(fā)現，隨著培養(yǎng)時間延長，DAC 刺激的RAK 細胞CD4 和NKT 比例呈上升趨勢，CD8 比例呈下降趨勢，尤其是高濃度DAC（1 000、2 000、3 000 nmol/L）會促進CD4+T 細胞比例升高。但當DAC 濃度超過1 000 nmol/L 時，會加速RAK 細胞凋亡。本研究通過記憶表型分析發(fā)現RAK 細胞以中央記憶型T 細胞亞群（CD45RA-/CD62L+）為主，CD4+或CD8+TCM 表達雖然隨DAC 濃度增加呈下降趨勢，但在DAC 刺激后CD45RA-/CD62L+的表達更集中于CD4 陽性而非CD8 陽性的RAK 細胞，提示DAC 有利于CD4+T 細胞TCM 生成，從而使其具備更加持久的抗腫瘤能力。本研究還發(fā)現低濃度DAC 不僅不影響細胞增殖，還能夠促進細胞毒相關細胞因子分泌，特別是1 000 nmol/L DAC 刺激的RAK 細胞分泌的IFN-γ 和perforin 水平顯著升高。細胞毒效應分子CD107a 的陽性率也顯著高于對照組，提示該濃度下DAC刺激的RAK細胞對腫瘤細胞殺傷作用明顯增強。

現有的研究表明，DNA 甲基轉移酶3a（DNMOL/LT3a）介導的新生DNA 甲基化不僅直接驅動T 細胞抑制和衰竭，DNA 甲基化也可通過改變多種免疫相關基因的轉錄水平而導致T 細胞分化和活性的改變［15-16］。2013年，KOPP 等［8］發(fā)現使用的DAC 劑量不同會出現低甲基化和細胞毒性的雙相反應，低濃度DAC 在細胞增殖過程中影響NK 細胞激活和抑制受體表達，高劑量DAC 降低NK 細胞增殖和活力。近期有研究采用低劑量（10～100 nmol/L）DAC 作用CAR-T 細胞，發(fā)現DAC 可啟動表觀遺傳重編程，賦予CAR-T 細胞增強和持久的抗腫瘤潛能，提供了一種體外給藥制備具有更好抗腫瘤特性的CAR-T 細胞的選擇［9，18］。該課題組一致認為DAC 在一定劑量范圍內可產生最佳免疫調節(jié)作用。而在本研究中，由于DAC作用的是RAK細胞，本研究推薦的作用于RAK 細胞的DAC 濃度為1 000 nmol/L，大大超過既往研究使用的劑量，考慮到也許是RN 能抵抗由于淋巴細胞增殖過程中高度活化而誘發(fā)的細胞凋亡，使活化細胞保持高分裂狀態(tài)。當細胞處于快速增殖狀態(tài)，用較高劑量的去甲基藥物短時間刺激也可獲得更高的擴增率、更合適的細胞亞群比例及更強免疫活性的效應細胞。將藥物引入RAK 培養(yǎng)體系也為今后RAK 的臨床應用提供良好的基礎借鑒，在此研究基礎上，課題組將進一步通過動物實驗驗證DAC刺激的RAK 細胞的抗腫瘤療效，同時希望在基因組學水平研究DAC 對RAK 細胞關鍵轉錄因子及免疫相關信號通路等的影響，也為改善過繼性T 細胞治療提供可參考的實驗數據。