地黃炮制過程中HPLC-RID 指紋圖譜及模式識別研究

張麗先，寧二娟，李智寧，魏 悅，李飛飛，張?zhí)姨?/p>

（河南省科學(xué)院，a.河南省納普生物技術(shù)有限公司；b.天然產(chǎn)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002）

地黃為玄參科植物地黃（Rehmanniae radix）的新鮮或干燥塊根，秋季釆挖，除去蘆頭、須根及泥沙，鮮用，習(xí)稱“鮮地黃”；除鮮用外，進(jìn)行初步處理和干燥，得另一種鮮地黃形式地黃片，便于儲(chǔ)存，以保證中藥材質(zhì)量；將地黃緩緩烘焙至約八成干，習(xí)稱“生地黃”；生地黃酒燉至酒吸盡，取出，晾曬至外皮黏液稍干時(shí)，切厚片或塊，干燥，即得熟地黃。鮮地黃清熱生津、涼血止血，用于熱病傷陰、舌絳煩渴；生地黃清熱涼血、養(yǎng)陰生津，用于舌絳煩渴、陰虛內(nèi)熱；熟地黃滋陰補(bǔ)血、益精填髓，用于肝腎陰虛、血虛萎黃［1-5］。

鮮地黃、生地黃、熟地黃藥性迥異，主要?dú)w因于加工炮制過程中化學(xué)成分的變化。糖類成分在地黃中含量很高，其中鮮地黃中水蘇糖含量高達(dá)60%。研究表明低聚糖類成分有調(diào)節(jié)腸道菌群、調(diào)節(jié)血糖和血脂、保肝、抗腫瘤的功效，是一種極佳的功能性食品原料［6］。開展炮制前后地黃中糖類成分變化的研究對于低聚糖產(chǎn)品開發(fā)意義重大，為此，本試驗(yàn)建立地黃炮制過程中不同炮制品HPLC-RID 特征圖譜分析方法，同時(shí)測定地黃中果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖5 種糖類成分含量，以期借助模式識別評估鮮地黃（包括地黃片）-生地黃-熟地黃不同炮制品中糖類成分差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀，ME204萬分之一電子天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司）；AUW 220D 十萬分之一天平（日本島津公司）；KQ-500E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.1.2 藥品與試劑 葡萄糖（批號110833-201506，純度99.9%）、水蘇糖（批號112031-201701，純度90.5%）購自中國食品藥品檢定研究院；果糖（批號171202）、蔗糖（批號17042602）、棉子糖（批號1704705），純度≥98%，購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，乙腈為色譜純（天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司），水為娃哈哈純凈水。

1.1.3 地黃來源 鮮地黃、生地黃購自河南省各地，熟地黃由實(shí)驗(yàn)室依據(jù)酒燉法自行炮制。地黃來源見表1。

表1 12 批地黃來源

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX NH2色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-純水（70∶30，體積比）混合溶液為流動(dòng)相，流量1.0 mL/min，柱溫40 ℃，RID 溫度50 ℃。

1.2.2 供試品溶液配制 鮮地黃切成小塊，研碎；生地黃、熟地黃切成約5 mm 的小塊，經(jīng)80 ℃減壓干燥24 h 后，磨成粗粉。鮮地黃取約2.0 g（地黃片、生地黃、熟地黃取約0.5 g），精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%乙腈25 mL，稱定重量，超聲（500 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用50%乙腈補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.3 對照品溶液配制 取適量果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水蘇糖對照品，用50%乙腈溶解于5 mL容量瓶中，得1 mg/mL 的混合對照品溶液，混合對照品及單一對照品色譜見圖1。

圖1 混合對照品及單一對照品HPLC-RID 色譜圖

1.2.4 HPLC-RID 特征圖譜建立 按照“1.2.2”制備1～12 號供試品溶液，在“1.2.1”色譜條件下進(jìn)樣分析，采集1～12 號樣品色譜圖作為HPLC-RID 特征圖譜，見圖2。

圖2 12 批樣品HPLC-RID 特征圖譜

2 結(jié)果與分析

2.1 相似度評價(jià)結(jié)果

在Open Lab 工作站中導(dǎo)出1～12 號樣品AIA 格式的數(shù)據(jù)文件，在中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012.130723 版本）中依次打開，設(shè)置1 號樣品色譜圖為參照圖譜，經(jīng)過多點(diǎn)校正、峰匹配后，計(jì)算相似度，相似度結(jié)果見表2。12 批地黃不同炮制品指紋圖譜相似度大于0.900，說明地黃炮制前后寡糖類成分種類未見顯著差異，單獨(dú)基于相似度分析不能很好地區(qū)分地黃不同炮制品。

表2 12 批樣品相似度計(jì)算結(jié)果

2.2 主成分分析

PCA 是一種使用最廣泛的數(shù)據(jù)降維算法，基本思想就是在保留原始變量盡可能多的信息的前提下達(dá)到降維的目的，從而簡化問題的復(fù)雜性并抓住問題的主要矛盾，揭示事物內(nèi)部變量之間的規(guī)律性，簡化問題，提高分析效率，得到對事物特征及其發(fā)展規(guī)律的一些深層次的啟發(fā)［7］。借助SPSS 16.0 數(shù)據(jù)分析軟件對12 批樣品5 個(gè)指標(biāo)性糖類成分峰面積進(jìn)行主成分分析，PC1 和PC2 兩個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率分別為59.04%、24.05%，合計(jì)為83.09%，能夠概括地黃樣品的絕大部分信息，分類結(jié)果見圖3。

圖3 12 批地黃不同炮制品PCA（○：生地黃，◇：熟地黃，+：鮮地黃）

2.3 聚類分析

HCA 是一個(gè)把數(shù)據(jù)對象劃分成子集的過程，每個(gè)子集是一個(gè)簇，使得簇中的對象彼此相似，但與其他簇中的對象不相似。聚類的輸入是一組未被標(biāo)記的樣本，聚類根據(jù)數(shù)據(jù)自身的距離或相似度劃分為若干組，劃分的原則是組內(nèi)距離最小化而組間距離最大化，是一種非監(jiān)督的算法［8］。運(yùn)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對12 批樣品進(jìn)行聚類分析，以組間聯(lián)接法聚類，平方Euclidean 距離為指標(biāo)，結(jié)果見圖4。12批地黃炮制品分為3 類，其中生地黃1～4 號聚為一類，熟地黃5～7 號為一類，鮮地黃包括地黃片8～12號聚為一類，聚類結(jié)果與PCA 結(jié)果一致。表明地黃不同炮制品之間寡糖成分含量差異明顯，選定的果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖能較大程度上代表地黃不同炮制品之間寡糖類成分的差異。地黃片與鮮地黃中寡糖類成分無顯著差異，可作為鮮地黃難以長期儲(chǔ)存的解決辦法。

圖4 12 批地黃不同炮制品HCA 結(jié)果

2.4 含量測定

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取“1.2.3”混合對照品溶液，按“1.2.1”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算6 次測定中果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水蘇糖峰面積的RSD，分別為1.52%、1.39%、1.25%、1.74%、0.96%、2.05%，儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取1 號樣品，按“1.2.2”方法平行制備供試品溶液6 份，按“1.2.1”色譜條件測定，果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水蘇糖峰百分含量的RSD依次為1.63%、2.18%、2.95%、2.68%、2.84%，該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1 號樣品，按“1.2.2”方法平行制備供試品溶液，分別于制備后0、4、8、12、24、48 h，按“1.2.1”色譜條件測定，果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水蘇糖峰面積的RSD分別為1.75%、1.69%、2.54%、2.69%、2.87%，供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 加樣回收率試驗(yàn) 取1 號樣品，分別精密稱取6 份0.25 g，置于25 mL 量瓶中，分別加入與已知含量等量的5 種對照品，水定容，超聲30 min，過膜，上機(jī)分析，計(jì)算各指標(biāo)成分的回收率。果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水蘇糖平均回收率分別為95.1%、98.6%、95.2%、102.7%、103.6%，RSD分別為2.15%、3.06%、3.45%、2.98%、2.66%，該方法準(zhǔn)確可靠。

2.4.5 含量測定 將制備的1～12 號供試品溶液和混合對照品溶液按照“1.2.1”色譜條件依次進(jìn)樣分析，記錄5 指標(biāo)成分色譜峰峰面積，外標(biāo)法依次計(jì)算果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖及水蘇糖含量，具體見表3。

表3 12 批不同地黃炮制品中5 種糖的含量（單位：%，n=3）

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)建立了HPLC-RID 法同時(shí)測定地黃不同炮制品中果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖5 種單糖及低聚糖含量的方法，方法可靠，便于操作。考慮到溫度、風(fēng)、廢液瓶放置等環(huán)境因素對示差檢測器的穩(wěn)定及數(shù)據(jù)采集影響較大，測試開展之前需檢查儀器環(huán)境是否適宜；鑒于氨基柱反相使用耐受性差、流動(dòng)相均一性對示差檢測器基線平穩(wěn)影響大，選擇單相70%乙腈為流動(dòng)相；由于折光率隨溫度變化很大，溫度不恒定，噪音和靈敏度顯著受損，示差檢測器必須恒溫，綜合考慮色譜柱耐受性及出峰情況，柱溫箱、流通池溫度分別設(shè)置為40、50 ℃。

果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖5 種糖組分的主成分分析及聚類分析結(jié)果一致，表明5 種糖較好地表達(dá)了鮮地黃、生地黃、熟地黃之間的差異與聯(lián)系，其中切片快速冷凍干燥的地黃片與鮮地黃中5種糖類成分無明顯差異，可將地黃片作為鮮地黃的一種儲(chǔ)存方式，較大程度上緩解鮮地黃難以儲(chǔ)藏、容易腐爛變質(zhì)、發(fā)芽等問題。

地黃采摘后，在鮮地黃-生地黃-熟地黃加工炮制過程中，果糖含量逐步遞增，水蘇糖含量降低，蔗糖、棉子糖含量先升高后降低，葡萄糖含量變化不明顯?？赡苁桥谥七^程中，由于糖受熱不穩(wěn)定，水蘇糖可分解為三糖和二糖，棉子糖可分解為蔗糖、果糖等，而蔗糖又有可能分解為果糖和葡萄糖，從而使得地黃中各種糖含量處在動(dòng)態(tài)變化中。