HPLC-MS/MS法檢測奶粉中酪蛋白磷酸肽的含量

◎ 楊余語，劉 飛，溫林鳳，劉 果，曹 庸

（1.廣州綠萃生物科技有限公司，廣東 廣州 510663；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642）

天然功能活性肽在促進(jìn)鈣吸收、改善睡眠、降血壓、改善骨關(guān)節(jié)和抗菌消炎等方面具有獨(dú)特功效，蘊(yùn)藏著巨大的市場潛力。乳蛋白質(zhì)由酪蛋白和乳清蛋白組成，酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphopeptides，CPP）具有磷酸基團(tuán)，可作為Ca、Fe、Zn等金屬離子的載體，防止這些金屬離子在小腸中沉淀，從而提高金屬離子的吸收率[1-3]。一般使用具有特異性的蛋白酶水解酪蛋白制備得CPP。維生素D可促進(jìn)Ca2+吸收，但Ca2+的吸收速率取決于Ca2+的濃度。在非酸性條件下，Ca2+易形成不溶性鹽而造成鈣流失，酪蛋白磷酸肽的C端和N端分別具有一個(gè)磷酸絲氨酸殘基，可與Ca2+結(jié)合為可溶性復(fù)合物，防止鈣沉淀的產(chǎn)生，有效增加鈣在體內(nèi)的滯留時(shí)間。目前，通常采用酶水解法、微生物發(fā)酵法和化學(xué)合成法制備生物活性肽，使用膜分離、離子交換層析、凝膠過濾層析和高效液相色譜技術(shù)進(jìn)行分離和純化，通過色譜、質(zhì)譜等方法進(jìn)行表征，并通過體內(nèi)和體外試驗(yàn)對(duì)其活性評(píng)價(jià)和穩(wěn)定性進(jìn)行研究[4-6]。對(duì)于活性好的肽，可根據(jù)活性肽的特點(diǎn)，引入功能性食品、醫(yī)療、保健品和化妝品等行業(yè)中。目前，CPP已廣泛應(yīng)用于保健品及嬰幼兒奶粉中，CPP的檢測方法有電泳法、鋇鹽法、高效液相色譜法及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，鋇鹽法適合檢測含量較高的CPP樣品，對(duì)微量檢測誤差較大，液相色譜檢測法穩(wěn)定高效，但部分樣品存在的干擾較大[7-10]。本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS）法測定奶粉中CPP含量，優(yōu)化處理方法，建立液質(zhì)檢測方法，為奶粉中CPP含量檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

對(duì)照品：酪蛋白磷酸肽（CPP），批次20200626H，純度90%（按GB 31617—2014測定），廣州綠萃生物科技有限公司提供；奶粉，不同廠家提供或購買；乙腈、甲酸、甲醇，色譜純；水，符合GB/T 6682—2008規(guī)定的一級(jí)水；鹽酸，分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BS223S千分之一天平，德國Sartorius公司；QTRAP 4500高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，AB SCIEX；C18反相硅膠液相色譜柱（Ultimate?LP-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm），月旭公司；2150 T超聲波清洗器，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；L 530臺(tái)式低速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DELTA 320精密pH計(jì)，梅特勒-托利多公司；DHG-970熱風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 單體制備

以含量＞90%的CPP（根據(jù)GB 31617—2014附錄A方法檢測）為原料，通過制備液相及分析液相制備得CPP-P5單體：RELEELNVPGEIVEpSLpSpSpSEESITR，再經(jīng)過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜全掃、MS2找到定量離子（m/z），實(shí)現(xiàn)對(duì)CPP原料的檢測分析；以含量＞90%的CPP為對(duì)照品，通過外標(biāo)法確定奶粉中酪蛋白磷酸肽的相對(duì)含量。

1.3.2 對(duì)照品溶液配制

稱取純度為90%的CPP 1.00 g（準(zhǔn)確至0.000 1 g），加水溶解并定容至1 000 mL容量瓶中，配制成1 000 μg·mL-1的CPP對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確吸取CPP對(duì)照品儲(chǔ)備液0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL和1.25 mL，用水定容至10 mL容量瓶中，該對(duì)照系列中CPP濃度分別為50.00 μg·mL-1、75.00 μg·mL-1、100.00 μg·mL-1和125.00 μg·mL-1。

1.3.3 樣品前處理

（1）一次提取。稱取制備均勻的固體試樣約5 g或液體試樣約10 g（精確至0.01 g），加50 mL水將試樣充分溶解，攪拌均勻，超聲振蕩提取5 min。用鹽酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH至4.60±0.05，再超聲提取約10 min，用水定容至100 mL。將上述待測液用0.22 μm濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。

（2）多次提取。稱取制備均勻的固體試樣約5 g或液體試樣約10 g（精確至0.01 g），加50 mL水將試樣充分溶解，攪拌均勻，超聲振蕩提取5 min。用鹽酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH至4.60±0.05，再超聲提取約10 min，離心，得到渣加20 mL水，充分?jǐn)嚢?，超聲、調(diào)節(jié)pH、再超聲，重復(fù)提取2次，合并提取上清液，多次提取得到的上清液控制在100 mL內(nèi)，合并上清液定容至100 mL。將上述待測液用0.22 μm濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。

1.3.4 儀器條件

（1）液相色譜條件。Welch Ultimate?LP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：0.1%甲酸乙腈溶液；流動(dòng)相流動(dòng)速度：0.6 mL·min-1；色譜柱柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；洗脫梯度：0～1 min，10% B；1～5 min，10%～22% B；5～10 min，22%～25% B；10～35 min，25%～99% B；35～40 min，99% B；40.1～45.0 min，10% B。

（2）質(zhì)譜條件。氣簾氣（CUR）：206.85 kPa（30.00 psi）；霧化氣（GS1）：344.75 kPa（50.00 psi）；輔助加熱氣（GS2）：55 L·min-1；碰撞氣（CAD）：34.475 kPa（5.00 psi）；離子源噴霧電壓（IS）：5 500.00 V；離子源溫度（TEM）：500 ℃；母離子/子離子（m/z）：1 042.0/983.4*。

1.3.5 結(jié)果計(jì)算

試樣中蛋白磷酸肽含量的計(jì)算公式為

式中：X為試樣中酪蛋白磷酸肽的含量，g·kg-1；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得試樣溶液中酪蛋白磷酸肽的濃度，μg·mL-1；V為樣品溶液定容體積，mL；m為最終樣液代表的試樣質(zhì)量，g；1 000為換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單體制備

CPP溶液通過制備液相分離、收集P5、濃縮凍干，得到P5單體，分析液相純度高達(dá)85%以上。CPP液相色譜圖見圖1。

圖1 CPP液相色譜圖

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

試驗(yàn)中以1.0 mg·L-1單體標(biāo)準(zhǔn)溶液直接注入三重四極桿質(zhì)譜儀，通過質(zhì)譜自動(dòng)優(yōu)化MS/MS采集參數(shù)和特征碎片離子。通過高分辨質(zhì)譜（Q Exactive Orbitrap）進(jìn)行全掃描/數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)掃描（Full MS/dd-MS2）模式掃描，在優(yōu)化的碰撞能下，選擇母離子對(duì)應(yīng)豐度最大的子離子進(jìn)行定量分析。

對(duì)制備得到的P5單體在m/z200～2 000進(jìn)行Q1模式全掃描，見圖2（a），得到母離子1 042.0；再進(jìn)行MS2掃描，見圖2（b），確定子離子983.3，因此選擇1 042.0/983.3m/z作為定量離子。

2.3 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.3.1 一次提取HPLC-MS檢測結(jié)果

8個(gè)不同品牌廠家的奶粉樣品前處理經(jīng)過一次提取，檢測CPP含量結(jié)果見表1?；厥章蕿?1.45%～87.24%，表明一次提取對(duì)目標(biāo)肽的提取率較低，因此需繼續(xù)優(yōu)化提取方法。

2.3.2 多次提取HPLC-MS檢測結(jié)果

選取不同廠家的奶粉樣品，按照1.3.3前處理方法中的多次提取法進(jìn)行處理和檢測，試驗(yàn)結(jié)果見表2。檢測結(jié)果表明，經(jīng)過多次提取法處理后，回收率有較大提升，回收率均≥85%，平均回收率為95%，滿足檢測要求。

圖2 P5單體的質(zhì)譜圖

表1 一次提取CPP的HPLC-MS檢測數(shù)據(jù)表

表2 多次提取CPP的HPLC-MS檢測結(jié)果表

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

將 濃 度 為50 μg·mL-1、75 μg·mL-1、100 μg·mL-1和125 μg·mL-1的CPP對(duì)照品溶液按優(yōu)化后的質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，以溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果如圖3所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=6 525.2x-199 380，R2=0.998 5。結(jié)果表明，CPP對(duì)照品在50～125 μg·mL-1線性關(guān)系良好，CPP標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，色譜圖見圖4。

圖3 CPP對(duì)照品溶液線性回歸曲線圖

2.5 檢測限和定量限

將CPP對(duì)照品系列溶液與空白一起通過HPLCMS進(jìn)樣分析，得到高效液相色譜儀器的基線噪聲值及樣品信號(hào)強(qiáng)度，按照信噪比S/N=3確定檢測限，通過分析計(jì)算得到該方法的檢測限為3.3 μg·kg-1；將信噪比S/N=10作為該方法的定量限，計(jì)算得到該方法的定量限為11.0 μg·kg-1。

2.6 精密度

對(duì)濃度為100 μg·g-1的CPP溶液平行測定6次，所得HPLC-MS色譜圖的保留時(shí)間及峰面積見表3。6次平行測定試驗(yàn)保留時(shí)間的RSD為0.18%、峰面積的RSD為0.99%，表明該方法的精密度良好。

圖4 CPP對(duì)照品色譜圖

表3 精密度檢測結(jié)果表

2.7 加標(biāo)回收率

對(duì)不含CPP的奶粉樣品添加CPP，添加量為50 μg·g-1、100 μg·g-1、150 μg·g-1，對(duì)樣品處理后，在色譜條件下測定樣品液中的CPP含量。CPP的回收率結(jié)果見表4?；厥章蕿?8.7%～103.3%，奶粉樣品加標(biāo)回收率良好。

表4 不同CPP添加量回收率測定結(jié)果表

3 結(jié)論

本文對(duì)高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜檢測奶粉中的酪蛋白磷酸肽的質(zhì)譜條件和前處理?xiàng)l件進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)驗(yàn)證，該方法的線性關(guān)系良好，精密度和準(zhǔn)確度滿足檢測要求。采用本文建立的方法檢測奶粉中CPP含量，具有前處理簡單、檢測限低、方法快速簡便、專屬性好及適用性強(qiáng)等的特點(diǎn)。