高效液相色譜法測定熏、烤水產(chǎn)品中苯并[a]芘的不確定度評定

◎ 石劍夫，焦文佳，陳 茹

（1.廣東省食品工業(yè)公共實驗室，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 511442；3.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，廣東 廣州 511442）

苯并[a]芘是苯與芘稠合而成的一類多環(huán)芳烴，具有明顯致癌作用[1-2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，食品中的苯并[a]芘的來源有兩種：由工業(yè)生產(chǎn)、煤炭的不完全燃燒產(chǎn)生，通過空氣、水流和土壤進(jìn)入糧食、蔬菜瓜果、水產(chǎn)和動物制品中；高溫烘烤、油炸、煙熏、烹調(diào)時，食品中的碳水化合物、蛋白質(zhì)等有機(jī)物發(fā)生裂解反應(yīng)，再經(jīng)過一系列化學(xué)反應(yīng)形成苯并[a]芘。GB 2762—2017[3]規(guī)定，熏、烤水產(chǎn)品中苯并[a]芘的安全限量為5.0 μg·kg-1。因此，準(zhǔn)確測定熏、烤水產(chǎn)品中苯并[a]芘的含量非常重要。

不確定度評定是一種評價檢測方法科學(xué)性、合理性的常用方式，可以為測試結(jié)果的準(zhǔn)確性提供參考。此次熏、烤水產(chǎn)品中苯并[a]芘的檢測按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.27—2016[4]開展，并建立不確定度來源分析數(shù)學(xué)模型，以評定檢驗過程中產(chǎn)生的不確定度[6-8]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

H-class plus超高效液相色譜儀（Waters）；ME204E/02電子天平，萬分之一，梅特勒-托利多（上海）有限公司。苯并[a]芘（100.0%），CAS:50-32-8（AccuStandard）；甲醇（LC-MS，Merck）；乙腈（LC-MS，Merck）；試驗用水均為一級水。

1.2 提取樣液

嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.27—2016[4]進(jìn)行試樣制備、提取和凈化。將柴魚花片試樣經(jīng)過制樣、稱樣、正己烷提取、苯并[a]芘分子印跡柱過柱、復(fù)溶和過膜等標(biāo)準(zhǔn)化步驟獲得樣液[4]。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用移液器將苯并[a]芘標(biāo)物轉(zhuǎn)移至儲備液瓶中，得苯并[a]芘儲備液（100.4 μg·mL-1）。用移液器吸取苯并[a]芘儲備液20 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，得苯并[a]芘中間液200.8 ng·mL-1，當(dāng)天配制。分別移取中間液0.025 mL、0.050 mL、0.250 mL、0.500 mL、1.000 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱：C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈+水=（88+12）；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：激發(fā)波長384 nm，發(fā)射波長406 nm。

2 數(shù)學(xué)模型

食品中苯并[a]芘的含量測定采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，定量結(jié)果按下面的公式計算。

式中：X為試樣中苯并[a]芘的含量，μg·kg-1；V為樣液最終定容體積，mL；Cx為標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的苯并[a]芘的質(zhì)量濃度，ng·mL-1；m為試樣質(zhì)量，g；F為濃縮倍數(shù)；1 000為ng·g-1換算成μg·kg-1的換算因子。

3 不確定度來源分析

通過分析苯并[a]芘含量的計算公式，食品中苯并[a]芘檢驗的不確定度來源主要有樣品質(zhì)量、前處理過程、標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合及測量重復(fù)性等。詳情見圖1。

圖1 不確定度來源分析圖

4 不確定度分析

4.1 由苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度分量urel,1

4.1.1 由苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度分量urel,2

通過查詢所使用的苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，其擴(kuò)展不確定度為2.4%，取置信水平p=95%，包含因子k=2，則可得其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

4.1.2 使用器具進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線配制而引入的不確定度urel,3

使用容量瓶定容和使用移液器移取溶液是標(biāo)準(zhǔn)曲線配置的主要不確定度來源。本實驗所使用的容量瓶均通過檢定，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。依據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）和移液器的校準(zhǔn)證書，按照三角分布計算，使用容量瓶定容和使用移液器移取溶液引入的不確定度見表1。本實驗在標(biāo)準(zhǔn)曲線配置過程中引入的不確定度為

表1 使用容量瓶和移液器引入的不確定度表

4.1.3 環(huán)境溫度變化引入的不確定度urel,4

本實驗在（20±4）℃條件下進(jìn)行，經(jīng)查，乙腈的膨脹系數(shù)為1.37×10-3℃-1，按照矩形分布計算，在配制標(biāo)準(zhǔn)曲線時由于環(huán)境溫度變化而引入的不確定度見表2。

表2 環(huán)境溫度變化引入的不確定度表

環(huán)境溫度變化引入的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

由苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量為

4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合及結(jié)果重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,5

4.2.1 結(jié)果重復(fù)性引入的不確定度分量urel,6

在相同條件下，按照標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法對同一試樣重復(fù)檢驗6次，檢驗結(jié)果分別為21.4 μg·kg-1、21.3 μg·kg-1、21.1 μg·kg-1、21.5 μg·kg-1、21.5 μg·kg-1和21.5 μg·kg-1，則重復(fù)性不確定度分量為

重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量為

4.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,7

使用高效液相色譜儀將苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液測定3次，分別得到苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液各濃度各3個峰面積，分別取平均值，以苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液的濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），求其回歸方程和相關(guān)參數(shù)，詳情見表3。

表3 苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液3次測定的結(jié)果表

計算得到苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=60 421x+2 900.7，相關(guān)系數(shù)r=1，由此可知，苯并[a]芘濃度和峰面積具有顯著的線性相關(guān)性。

回歸直線的標(biāo)準(zhǔn)偏差（y殘差的標(biāo)準(zhǔn)差）計算為

式中：m為每個測量點(diǎn)重復(fù)測量次數(shù)，m=3；n為測量點(diǎn)數(shù)，n=5；yij為儀器各點(diǎn)響應(yīng)值；yi為回歸直線計算值。

由苯并[a]芘的峰面積引入的不確定度分量u1為

回歸系數(shù)斜率的不確定度u2為

回歸系數(shù)截距的不確定度u3為

不確定度分量u1～u3符合應(yīng)用公式（3）。

先計算器傳播系數(shù)，對線性方程y=ax+b求偏導(dǎo)知：

其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量為

由結(jié)果重復(fù)性和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量為

4.3 試樣前處理過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,8(Q)

4.3.1 稱量試樣引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,9(m)

使用萬分之一天平稱取6份試樣，其質(zhì)量分別為1.002 4 g、1.002 6 g、1.001 7 g、1.003 9 g、1.006 7 g和1.005 8 g，計算得方差為0.000 003 37。經(jīng)查，試樣稱量所使用的萬分之一天平，其最大允差為0.50 mg，按矩形分布稱量試樣引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

稱量試樣引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

4.3.2 試樣前處理過程中所用器量引入不確定度urel,10(V3)

取5 mL正己烷（定容體積）時用5 mL移液器，其最大允許誤差為±30.00 μL，依據(jù)三角分布

最終定容體積時用1 000 μL移液器，其最大允許誤差為±10.00 μL，依據(jù)三角分布移取1 mL乙腈時引入的相對不確定度為

取0.5 mL復(fù)溶液于1 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度線時。使用的1 000 μL移液器最大允許誤差為±5.00 μL，依據(jù)三角分布移取1 mL乙腈時引入的相對不確定度為

使用的1 mL容量瓶最大允許誤差為±0.010 mL，依據(jù)三角分布其相對不確定度為

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

4.3.3 溫度不同引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量urel,15(T3)

實驗在（20±4）℃條件下進(jìn)行，經(jīng)查，正己烷的膨脹系數(shù)為1.36×10-3℃-1，乙腈的膨脹系數(shù)為1.37×10-3℃-1，檢定標(biāo)準(zhǔn)溫度（20 ℃）和溶液溫度不同引入的不確定度分量urel,15(T3)，按照矩形分布計算。

4.3.4 樣品處理過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,8(Q)用5 mL移取兩次引入的不確定度為

4.4 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評定

經(jīng)過本實驗可得食品中苯并[a]芘測定的各主要不確定度分量（表4），計算可得總合成相對擴(kuò)展不確定為

表4 食品中苯并[a]芘測定的合成相對擴(kuò)展不確定的分量表

4.5 評定本次檢驗的相對擴(kuò)展不確定度

本次檢驗的相對擴(kuò)展不確定度公式為Urel=k×urel，假設(shè)本次檢驗過程誤差符合正態(tài)分布，取置信水平p=95%，包含因子k=2，則本次檢驗的相對擴(kuò)展不確定度為Urel=2×0.037×100%=7.4%。

苯并[a]芘相對擴(kuò)展不確定度為7.4%，樣品檢出21.3 μg·kg-1，則其擴(kuò)展不確定度為U=21.3×7.4%=1.6 μg·kg-1。

5 結(jié)論

本次采用高效液相色譜法檢驗熏、烤水產(chǎn)品中的苯并[a]芘含量，經(jīng)過分析過程和計算不確定度，可知配制苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度最大，建議從事該方法檢驗的檢驗人員在標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中應(yīng)盡可能地選擇高精度的器具，定期對相關(guān)器具和儀器進(jìn)行檢定或校準(zhǔn)，保證器具和儀器處于正常工作狀態(tài)。同時，檢驗人員也應(yīng)按照標(biāo)準(zhǔn)要求規(guī)范操作，通過培訓(xùn)學(xué)習(xí)提高檢驗人員專業(yè)技能，減少人工誤差，從而保證檢驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠。