超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定雞肉、雞蛋中尼卡巴嗪、金剛烷胺、金剛乙胺殘留量

◎ 歐陽思雨，藍(lán) 偉，賈 佳，胡秋連，杜裕芳

（江西省檢驗檢測認(rèn)證總院食品檢驗檢測研究院，江西 南昌 330000）

尼卡巴嗪（Nicarbazin）是一種廣譜、穩(wěn)定、高效的抗球蟲藥物，因此用作飼料添加劑預(yù)防雞球蟲病是非常廣泛的，然而尼卡巴嗪殘留物代謝緩慢[1]，易通過食物鏈對人體健康產(chǎn)生潛在威脅。金剛烷胺（Amantadine）和金剛乙胺（Rimantadine）作為一類抗流感病毒藥物，也易被非法用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，若被非法濫用則易導(dǎo)致個體產(chǎn)生抗藥性甚至導(dǎo)致病毒產(chǎn)生變異，同樣會對人們產(chǎn)生危害。而雞肉和雞蛋是人類日常生活中主要食物來源之一，目前液質(zhì)通常是按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)分開檢測尼卡巴嗪和金剛烷胺、金剛乙胺，作為常檢項目，本文旨在建立一種同時檢測雞肉和雞蛋中尼卡巴嗪、金剛烷胺和金剛乙胺的方法，既可以實現(xiàn)對雞肉和雞蛋類食品進行大批量、快速高效的定性和定量分析測定，也能滿足市場需求，對藥物殘留問題起到日常監(jiān)管作用。

1 材料與方法

1.1 試劑耗材

鹽酸金剛烷胺，Dr.Ehrenstorfer GmbH，99.4%；鹽酸金剛乙胺，Standard Chemicals，99.2%；尼卡巴嗪，BePure，99.7%；金剛烷胺-D15，BePure，99.2%；美金剛-D6，CATO，98.0%；尼卡巴嗪-D8，WITEGA，99.9%；甲醇、乙腈、二甲基甲酰胺、正己烷、甲酸，均為色譜純；冰乙酸、無水硫酸鈉，分析純；PSA凈化吸附劑（乙二胺-N-丙基硅烷），粒度40 μm；濾膜，0.22 μm。市售雞肉和雞蛋。

1.2 儀器設(shè)備

沃特世TQS液質(zhì)聯(lián)用儀，美國沃特世公司；SL8臺式離心機，美國Thermo Fisher Scientific公司；Vortex Wizard渦旋儀；N-EVAP氮吹儀，美國-Organomation公司；QUINTIX213-1CN電子天平，上海-賽多利斯公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別精密稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)適量，置于6只10 mL容量瓶中，金剛烷胺、金剛乙胺、金剛烷胺-D15和美金剛-D6用甲醇定容，尼卡巴嗪和尼卡巴嗪-D8用二甲基甲酰胺定容。將上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋得到金剛烷胺、金剛乙胺、尼卡巴嗪的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液和金剛烷胺-D15、美金剛-D6、尼卡巴嗪-D8的混合內(nèi)標(biāo)使用液。

分別吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，用50%乙腈定容，得到混合外標(biāo)濃度均為1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和100 ng·mL-1，內(nèi)標(biāo)金剛烷胺-D15、金剛乙胺-D6、尼卡巴嗪-D8濃度為20 ng·mL-1、10 ng·mL-1、50 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.4 樣品處理

稱取均質(zhì)后的樣品2 g于50 mL離心管中，加入混合內(nèi)標(biāo)使用液10 μL，加1%乙酸乙腈溶液10 mL，渦旋2 min，4 500 r·min-1離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，重復(fù)提取1次，合并兩次上清液，加無水硫酸鈉3 g，正己烷10 mL，渦旋1 min，4 500 r·min-1離心3 min，棄去正己烷層，剩余溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，40 ℃氮吹至近干，用1.0 mL甲醇溶解殘渣，加入PSA 50 mg，渦旋30 s，離心，吸取上清液0.5 mL 40 ℃氮氣吹干，加入50%乙腈水溶液0.5 mL，渦旋30 s，溶液過0.22 μm濾膜待測。

1.5 儀器分析條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流速：0.25 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL；優(yōu)化后的流動相洗脫梯度見表1。

表1 梯度洗脫程序表

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：金剛烷胺和金剛乙胺為正離子掃描，尼卡巴嗪為負(fù)離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)離子檢測；毛細(xì)管電壓：ESI+2.75 kV，ESI-2.46 kV；脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流量：800 L·h-1；錐孔反吹氣流量：150 L·h-1。優(yōu)化后的相關(guān)參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

金剛烷胺、金剛乙胺結(jié)構(gòu)中均含有氨基且極性較強[2]，而尼卡巴嗪使用乙腈提取效率較好[3]，分別選用純乙腈、1%乙酸乙腈、5%乙酸乙腈作為提取溶劑，考察不同提取溶劑對3種化合物的提取效果，結(jié)果表明1%乙酸乙腈對金剛烷胺和金剛乙胺的提取效果優(yōu)于純乙腈，對尼卡巴嗪的提取效果優(yōu)于5%乙酸乙腈，因此選擇1%乙酸乙腈作為提取溶劑，既能提高金剛烷胺和金剛乙胺的提取效果，又能保證尼卡巴嗪的提取效果。無水硫酸鈉能使水飽和，將目標(biāo)物充分萃取到乙腈層，而選擇有機溶劑之后再加入鹽，可以避免樣品局部過熱導(dǎo)致的回收率降低。PSA主要用于去除樣品中的有機酸和糖類等物質(zhì)，減少樣品基質(zhì)中的干擾[4]。

表2 質(zhì)譜參數(shù)表

2.2 儀器條件優(yōu)化

金剛烷胺和金剛乙胺分子結(jié)構(gòu)中的氨基在離子化過程中易得到H+形成穩(wěn)定的[M+H]+離子，因此采用電噴霧正離子（ESI+）掃描模式；尼卡巴嗪容易丟失H+以形成穩(wěn)定的[M-H]-離子，因此采用電噴霧負(fù)離子（ESI-）掃描模式。在MS定量分析時，采用金剛烷胺-D15作為金剛烷胺的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，美金剛-D6作為金剛乙胺的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，尼卡巴嗪-D8作為尼卡巴嗪的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，來進行定量分析，以用于控制樣品提取凈化、分離和電離等過程中的誤差。流動相則選擇使用基線更平穩(wěn)、得到更好峰形的乙腈和可以增加金剛烷胺、金剛乙胺的電離效果以及對尼卡巴嗪影響不太大的0.1%甲酸水，來進行洗脫分離，3種組分都能達到較好的峰形和分離度，見圖1。

圖1 各組分離子對質(zhì)譜圖

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度

以目標(biāo)物的濃度與相應(yīng)的峰面積建立曲線，權(quán)重1/x，計算信噪比，以S/N≥10確定定量限。各物質(zhì)信噪比見表3。

表3 各組分上機濃度及信噪比表

2.3.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)計算公式為

式中：A為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)點的峰面積；B為溶劑標(biāo)準(zhǔn)點的峰面積；|ME|≤20%，可認(rèn)為該基質(zhì)沒有基質(zhì)效應(yīng)[5]。

不加內(nèi)標(biāo)溶液參照1.4樣品處理得到樣品的基質(zhì)溶液，用基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)點，上機測定，得到基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)點的峰面積，與溶劑標(biāo)準(zhǔn)點峰面積比較，計算尼卡巴嗪、金剛烷胺、金剛乙胺的|ME|值分別為11.39%、4.19%、5.15%，均小于20%，可以判斷，尼卡巴嗪、金剛烷胺和金剛乙胺在雞肉和雞蛋中基本無基質(zhì)效應(yīng)。

2.3.3 回收率和精密度

分別在陰性樣品中添加0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1共3個濃度水平的3種物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，每個水平做6平行，按照1.4樣品處理方法進行處理測定，結(jié)果見表4，本方法回收率為80.4%～112.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4%～7.3%，能滿足尼卡巴嗪、金剛烷胺和金剛乙胺的檢測要求。

表4 三梯度六平行加標(biāo)回收率表

2.3.4 實際樣品檢測

采用上述方法隨機檢測了市場上60批雞肉樣品和20批雞蛋樣品，其中一份雞肉樣品中檢出尼卡巴嗪含量為61 μg·kg-1，其余樣品均未檢出上述3種成分殘留。

3 結(jié)論

本實驗建立了一種超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時測定雞肉、雞蛋中尼卡巴嗪、金剛烷胺、金剛乙胺殘留量的檢測方法。優(yōu)化了色譜條件、質(zhì)譜條件，采用內(nèi)標(biāo)校正，定量限低，靈敏度高，準(zhǔn)確度好，回收率好，能夠同時進行雞肉、雞蛋中尼卡巴嗪、金剛烷胺和金剛乙胺的定量測定，可節(jié)省部分成本，大批量快速篩查雞肉和雞蛋中的這3種成分，能夠更加快捷地完成檢驗檢測機構(gòu)日常樣品的檢測需要，可用于實際測定。