樺木酸對胃癌MGC-803 細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用及其機(jī)制

許廣松，蔣海兵, 盤 箐, 李國慶

（1.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院普外科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 衡陽 421001；3.永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院病原生物與免疫學(xué)教研室，湖南 永州 425100）

胃癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，也是全球癌癥死亡的第二大原因。胃癌的治療以手術(shù)切除為主，輔以化療和放療等綜合治療，但死亡率仍然很高［1-2］。晚期或轉(zhuǎn)移性胃癌患者缺乏更好的治療方法，全身化療仍是主要選擇［3-4］。但常規(guī)化療藥物具有較高耐藥性、細(xì)胞毒性和嚴(yán)重不良反應(yīng)［5-6］，因此尋找一種高效且不良反應(yīng)少的抗癌藥物，對減少胃癌化療引起的不良反應(yīng)具有重要意義。

樺木酸（betulinic acid，BEA） 是一種來源廣泛的五環(huán)三萜類化合物，具有抗腫瘤、抗炎和抗瘧疾等多種生物活性［7-8］。有研究［9］表明：BEA 可抑制肝癌細(xì)胞的增殖。但到目前為止，BEA 在胃癌中的研究少見報(bào)道，其作用機(jī)制仍不清楚。轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/SMAD 通路是一種廣泛存在于正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可以激活上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal-transition，EMT），引起腫瘤的發(fā)生，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡等病理過程［10-11］。本研究觀察BEA 對胃癌MGC-803 細(xì)胞TGF-β/SMAD 信號通路的影響，并進(jìn)一步闡明其可能的作用機(jī)制，為BEA 的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器BEA 購自美國Sigma 公司，CCK-8 試劑盒購自南京逸飛雪生物科技有限公司，AnnexinⅤ-FITC 凋亡試劑盒購自日本同仁化工公司，性別決定區(qū)Y 框蛋白4 （SRY-box 4，SOX4）、E 盒結(jié)合鋅指蛋白2 （zinc finger E-box- binding protein 2，ZEB2）、 基質(zhì)金屬蛋白酶9 （matrix metalloproteinase-9，MMP-9） 及鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail 和Slug 抗體購自美國CST 公司，轉(zhuǎn)化生長因子β 受體1 （transforming growth factor-β receptor 1，TGF-βR1）、SMAD 同源物7 （SMAD homology 7，SMAD7）、 SMAD 同源物2 （SHAD homology 2，SMAD2）、 磷酸化 SMAD2 （phosporylated SMAD2，p-SMAD2）、 SMAD 同源物3 （SMAD homology3，SMAD3） 和磷酸化SMAD3（phosphorylated SMAD3，p-SMAD3） 抗體購自武漢博斯特生物技術(shù)公司，RIPA 裂解緩沖液、蛋白酶抑制劑和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光 （enhanced chemiluminescence，ECL） 試劑均購自南京諾唯贊生物科技有限公司。Transwell 小室購自美國Corning Costar 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌MGC-803 細(xì)胞株購自美國模式培養(yǎng)物研究所（American Type Culture Collection ，ATCC），用含10% 胎牛血清、100 U·mL－1青霉素和100 g·mL－1鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 CCK-8 法檢測各組細(xì)胞增殖率將MGC-803細(xì)胞（3 000 個/孔） 接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，預(yù)培養(yǎng)24 h 后，分為對照組和不同劑量BEA 組，分別采用含0、 2.5、 5.0、 10.0、 20.0、 40.0 和80.0 μmol·L－1BEA 的DMEM 高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，分別在24、48 和72 h 加入CCK-8 試劑，采用分光光度法檢測波長450 nm 處各組細(xì)胞的吸光度（A） 值。細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組A 值－ 空白組A 值） /（對照組A 值－空白組A 值） ×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率將MGC-803 細(xì)胞接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分為對照組和不同劑量BEA 組，分別采用含0、2.5、5.0、10.0和20.0 μmol·L－1BEA 的DMEM 高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。置于培養(yǎng)箱中72 h 后，收集各組細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌2 次，采用Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡試劑盒染色，于流式細(xì)胞儀上檢測并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=（早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù)） /細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞遷移率細(xì)胞分組同 “1.4”，當(dāng)MGC-803 細(xì)胞融合率達(dá)95% 后，用移液槍尖端垂直于細(xì)胞培養(yǎng)板劃出一條直線，然后用PBS 緩沖液沖洗，去除分離的細(xì)胞。加入無血清DMEM 高糖培養(yǎng)基，加入不同劑量BEA。MGC-803 細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后拍照，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=（0 h 劃痕寬度－培養(yǎng)24 h 后劃痕寬度） /0 h 劃痕寬度×100%。

1.6 Transwell 法檢測細(xì)胞侵襲能力細(xì)胞分組同“1.4”，將100 μL 基質(zhì)凝膠和無血清DMEM 培養(yǎng)基（1∶8） 的混合物涂布在上Transwell 室上。在基質(zhì)凝膠凝固4 h 后，將MGC-803 細(xì)胞（5×104mL－1） 用不含血清的DMEM 接種于上室，下室加入含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，用甲醇固定，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下對膜下表面的細(xì)胞進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)，以侵襲細(xì)胞數(shù)代表細(xì)胞侵襲能力。

1.7 Western blotting 法檢測各組細(xì)胞中SMAD7、TGF- βR1、p-SMAD2、p-SMAD3、SOX4、ZEB2、MMP-9、Snail 和Slug 蛋白表達(dá)水平將MGC-803細(xì)胞分為對照組和20.0 μmol·L－1BEA 組，分別采用含0 和20.0 μmol·L－1BEA 的DMEM 高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞以5×105mL－1密度接種于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)48 h 后用RIPA 裂解液提取各皿總蛋白質(zhì)，采用BCA 法檢測總蛋白含量，將等量的蛋白質(zhì)在10 % SDS-PAGE 上電泳，然后在硝酸纖維素膜上進(jìn)行免疫印跡，室溫下用5% 脫脂牛奶封閉細(xì)胞膜2 h，分別加入一抗，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次；加入山羊抗兔HRP 標(biāo)記二抗（稀釋比例為1∶5 000），室溫孵育1 h，ECL 顯色，凝膠成像系統(tǒng)觀察蛋白條帶灰度值。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞增殖率、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞遷移率、侵襲細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞中SMAD7、TGF-βR1、p-SMAD2、 p-SMAD3、 SOX4、 ZEB2、 MMP9、Snail 和Slug 蛋白表達(dá)水平，均符合正態(tài)分布，以±s表示，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞增殖率與對照組比較，培養(yǎng)24、48 和72 h 后，2.5、 5.0、 10.0、 20.0、 40.0 和80.0 μmol·L－1BEA 組細(xì)胞增殖率明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。但BEA 劑量在20 μmol·L－1以上時，20.0、 40.0 和80.0 μmol·L－1BEA組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），因此 后 續(xù)Western blotting 實(shí) 驗(yàn) 采用20 μmol·L－1BEA。見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of cells in various groups（n=6,±s，η/%）

表1 各組細(xì)胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of cells in various groups（n=6,±s，η/%）

* P＜0.05 compared with control group.

Group Control BEA[cB/(μmol·L－1)]2.5 5.0 10.0 20.0 40.0 80.0 Proliferation rate(t/h) 24 100.00±1.20 86.20±4.53*75.45±3.66*70.32±3.11*67.53±2.87*66.20±2.54*64.60±3.53*48 93.52±3.61 74.60±3.23*62.47±3.25*57.63±2.55*50.22±1.86*48.60±1.55*48.20±3.73*72 102.30±3.77 75.14±3.20*67.50±2.62*61.82±2.34*59.53±2.10*57.10±1.50*55.22±2.38*

2.2 各組細(xì)胞凋亡率與對照組（3.10%±0.21%） 比較，培養(yǎng)72 h 后，2.5、 5.0、 10.0 和20.0 μmol·L－1BEA 組細(xì)胞凋亡率（11.22%±0.32%、 15.32%±0.50%、 23.35%±1.20% 和30.20%±2.36%） 逐漸升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率Fig.1 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

2.3 各組細(xì)胞遷移率與對照組比較，培養(yǎng)24 h后，2.5、5.0、10.0 和20.0 μmol·L－1BEA 組細(xì)胞遷移率明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見圖2 和表2。

圖2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞遷移率（Bar=250 μm）Fig.2 Migration rates of cells in various groups detected by cell scratch assay（Bar=250 μm）

2.4 各組細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)與對照組比較，培養(yǎng)24 h 后，2.5、5.0、10.0 和20.0 μmol·L－1BEA組細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見圖3 和表2。

表2 各組細(xì)胞遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)Tab.2 Migration rate and number invasion of MGC-803 cells in each group （n=6,x±s）

圖3 Transwell 法檢測各組細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)(Bar=100 μm)Fig.3 Number of invasion cells in various groups detected by Transwell assay (Bar=100 μm)

2.5 2 組細(xì) 胞 中TGF- β/SMAD 信 號 通 路 及SOX4、ZEB2、MMP-9、Snail 和Slug 蛋白表達(dá)水平與對照組比較，培養(yǎng)48 h 后，20 μmol·L－1BEA組細(xì)胞中SMAD7 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），TGF- β R1 、 p-SMAD2 、 p-SMAD3、SOX4、ZEB2、MMP-9、Snail 和Slug 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見圖4 和5。

圖4 2 組細(xì)胞中TGF-β/SMAD 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖(A)和直條圖(B)Fig.4 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of TGF- β / SMAD signaling pathway related proteins in cells in two groups

3 討 論

目前，在世界范圍內(nèi)胃癌的發(fā)病率和病死率均處于較高水平，臨床收治的胃癌患者以進(jìn)展期為主。近年來隨著新型藥物的出現(xiàn)和治療手段的多樣化，對于無法手術(shù)晚期胃癌采取以藥物治療為主的綜合治療后，既可以提高胃癌患者的生存率，亦能改善患者的生活質(zhì)量。中藥蘊(yùn)含的天然產(chǎn)物多樣化、不良反應(yīng)少且治療效果明顯，是尋找腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的重要來源。研究［12］證實(shí)：BEA 具有多種生物活性，如抗癌、抗感染、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗炎等，并且對艾滋病的治療有一定的輔助作用。因此，本研究通過觀察BEA 對胃癌MGC-803細(xì)胞的作用效果，探討其可能的作用機(jī)制。

本研究采用CCK-8 法檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，MGC-803 細(xì)胞經(jīng)不同濃度BEA 處理24、48 和72 h 后，細(xì)胞增殖率呈劑量依賴性降低，說明BEA 能抑制MGC-803 細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示： 經(jīng)不同劑量BEA 作用72 h 后，MGC-803 細(xì)胞凋亡率隨BEA 劑量增加而明顯升高，表明BEA 可促進(jìn)MGC-803 細(xì)胞凋亡；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對照組比較，經(jīng)不同劑量BEA 處理后MGC-803 細(xì)胞遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯降低，說明BEA 能抑制MGC-803 細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究結(jié)果表明：BEA 能明顯抑制MGC-803 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并能促進(jìn)MGC-803 細(xì)胞凋亡。BEA 對胃癌細(xì)胞有明顯的抑制作用，可作為胃癌的化療或輔助藥物。

TGF-β 是一種多功能細(xì)胞因子，在多種腫瘤組織中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后有密切關(guān)聯(lián)［13］。在大多數(shù)細(xì)胞中，SMADs 信號途徑是TGF-β 發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)的經(jīng)典途徑，TGF-β/SMAD 信號通路分布于多種組織和細(xì)胞中，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、代謝和遷移等功能中均發(fā)揮重要作用［14-15］。TGF-βR1 激活后，下游SMAD2 和SMAD3 被 磷 酸 化 激 活，激 活 的SMAD2 和SMAD3 繼續(xù)與SMAD4 形成SMAD 復(fù)合物，該復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與DNA 結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)［16］。SMAD7 作為TGF-β/SMAD 信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，可與細(xì)胞質(zhì)中的TGF-βR1 相互作用，導(dǎo)致TGF-βR1 降解［17］。本研究結(jié)果顯示：BEA 可明顯提高M(jìn)GC-803 細(xì)胞中SMAD7 蛋白表達(dá)水平，抑制TGF- βR1 表達(dá)，從而降低TGF- βR1 下游SMAD2 和SMAD3 的磷酸化水平，表明BEA 可以通過上調(diào)SMAD7 的表達(dá)來抑制TGF-β/SMAD 信號通路的激活。

SOX4 基因是SOX 家族成員，屬于編碼轉(zhuǎn)錄因子，在促進(jìn)骨及神經(jīng)組織正常發(fā)育中發(fā)揮重要作用，還在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)以及與腫瘤患者的預(yù)后及生存期有關(guān)聯(lián)［18］；MMP-9 是基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs） 家族成員，在腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中均發(fā)揮重要作用［19］； 轉(zhuǎn)錄因子Snail 和Slug 是EMT 過程中的重要分子，可以促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡促進(jìn)細(xì)胞存活［20］。本研究結(jié)果顯示：BEA 可降低MGC-803 細(xì)胞中SOX4、ZEB2、MMP-9、Snail 和Slug 蛋白表達(dá)水平，提示BEA 可能通過抑制MGC-803 細(xì)胞中TGF-β/SMAD 信號通路的激活，進(jìn)而下調(diào)下游分子SOX4、 ZEB2、 MMP-9、 Snail 和Slug 蛋白表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖、 凋亡、 遷移和侵襲。

圖5 2 組細(xì)胞中SOX4、ZEB2、MMP-9、Snail 和Slug蛋白表達(dá)電泳圖(A)和直條圖(B)Fig.5 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of SOX4, ZEB2, MMP-9, Snail and Slug proteins in cells in two groups

綜上所述，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)BEA 能抑制TGF-β/ SMAD 信號通路激活，從而抑制下游SOX4、 ZEB2、 MMP9、 Snail 和Slug 蛋白表達(dá)，起到調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲的作用，本研究結(jié)果為BEA 在胃癌治療中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。