實時熒光定量PCR 法檢測外周血中BCR/ABL基因表達(dá)在Ph+急性淋巴細(xì)胞白血病患者造血干細(xì)胞移植治療中的應(yīng)用

馮術(shù)青, 姚艷紅, 史 月, 劉志彬, 高 峰

（華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，河北 唐山 063000）

費城染色體陽性急性淋巴細(xì)胞白血?。≒hiladelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia，Ph+ALL） 是ALL 患者中常見的類型，在成人ALL 患者中占20%～30%，在兒童ALL 中約占5%［1］。Ph+ALL 患者以存在Ph 染色體為遺傳學(xué)特征，Ph 染色體是第22 對染色體長臂和第9 對染色體長臂交互異位產(chǎn)生，轉(zhuǎn)錄為BCR/ABL 融合基因，產(chǎn)生酪氨酸激酶［2］。在酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI） 問世以前，異基因造血干細(xì)胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，Allo-HSCT） 是治療Ph+ALL 的標(biāo)準(zhǔn)方法，若無Allo-HSCT，Ph+ALL 患者無進展生存（progressionfree survival，PFS） 率低于20%，中位生存期僅為8～16 個月。在TKI 時代，Allo-HSCT 仍然是此類患者的標(biāo)準(zhǔn)鞏固治療方案［3］。但有研究［4］結(jié)果顯示：自體造血干細(xì)胞移植（autologous hematopoietic stem cell transplantation，Auto-HSCT） 和單倍體相合造血干細(xì)胞移植（haploidentical hematopoietic stem cell transplantation，Haplo-HSCT） 可獲得與Allo-HSCT 類似的治療效果。無論患者治療方案如何，在Ph+ALL 患者中，分子生物學(xué)反應(yīng)尤為重要。美國綜合癌癥網(wǎng)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN） 指南推薦采用實時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 法檢測BCR/ABL 融合基因以評估Ph+ALL 患者的微小殘留?。╩inimal residual disease，MRD）［5］。研究［6］顯示：治療后MRD 陰性患者較MRD 陽性患者預(yù)后更好，復(fù)發(fā)率明顯降低。目前能否根據(jù)MRD 結(jié)果選擇Auto-HSCT 或者Allo-HSCT 尚無定論，HSCT 后是否需要TKI維持治療，何時開始維持治療以及維持治療時間等問題，目前仍未達(dá)成共識。本文作者回顧性分析本科就診的20 例Ph+ALL 患者，主要根據(jù)MRD 結(jié)果，并結(jié)合患者年齡及治療意愿選擇Auto-HSCT或Allo-HSCT，術(shù)后依據(jù)MRD 結(jié)果給予分層干預(yù)治療，取得了較為滿意的療效，為今后Ph+ALL 患者治療方法的選擇提供了初步的參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2009 年10 月—2020 年10 月于本院進行造血干細(xì)胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT） 的20 例Ph+ALL 患者，其中男性9例，女性11例，中位年齡32（14～61） 歲。按移植前疾病狀態(tài)分組： 完全緩解（complete remission，CR） 1期（CR1） 15 例，CR2 期（CR2）1 例，CR3 期（CR3） 1 例，未緩解（no remission，NR） 3 例。按移植類型分組： Auto-HSCT 3 例；Allo-HSCT 17 例，其中同胞全相合造血干細(xì)胞移植（matched sibling donor hematopoietic stem cell transplantation，MSD-HSCT） 4 例，親緣間單倍體造血干細(xì)胞移植（haploidentical hematopoietic stem cell transplantation，Haplo-HSCT） 13 例。診斷至移植中位時間為8 （5～34） 個月。

1.2 Ph+ALL 診斷和研究對象納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

Ph+ALL 診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫表型、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)（morphology，immunophenotype，cytogenetics，molecular biology，MICM） 進行診斷分型。骨髓細(xì)胞形態(tài)提示原始幼稚淋巴細(xì)胞＞0.20 診斷為ALL。對于免疫表型分析提示B 細(xì)胞ALL 的患者，采用R 顯帶技術(shù)進行染色體核型分析。同時采用RT-qPCR 法檢測BCR/ABL 融合基因以確定Ph+ALL 的診斷，并監(jiān)測MRD，BCR/ABL 融合基因表達(dá)陽性即定義為MRD 陽性。

納入標(biāo)準(zhǔn)： ①經(jīng)過MICM 分型診斷確診為Ph+ALL 的患者；②年齡14～65 歲；③Allo-HSCT患者有健康的合適供者，且符合倫理要求；④患者充分理解HSCT 相關(guān)風(fēng)險并自愿簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者有嚴(yán)重的重要臟器功能損害；②并發(fā)嚴(yán)重感染或持續(xù)感染且不能得到有效控制者。

1.3 RT-qPCR 法檢測BCR/ABL 基因表達(dá)

具體實驗操作見參考文獻［7］ 中的方法。

1.4 移植前治療

15 例本院初治Ph+ALL 患者誘導(dǎo)治療均采用以伊馬替尼（imatinib，IM） 為代表的TKI 聯(lián)合長春新堿+強的松（vincristine + prednisone，VP） 方案化療。Auto-HSCT 組患者的化療方案為TKI 聯(lián)合超劑量環(huán)磷酰胺+長春新堿+柔紅霉素+地塞米松 （hyper cyclophosphamide+vincristine +daunorubicin + dexamethasone，Hyper CVDD） 鞏固并強化5 個周期后進行。Allo-HSCT 組患者均采用TKI 聯(lián)合環(huán)磷酰胺+長春新堿+阿糖胞苷+柔紅霉素+ 強的松（cyclophosphamide+vincristine+cytarabine+daunorubicin+prednisone，COADP）和TKI 聯(lián)合大劑量甲氨蝶呤（high dose methotrexate，HD-MTX） 各1 周期強化治療后進行。5 例復(fù)發(fā)患者中2 例在接受TKI （達(dá)沙替尼）聯(lián)合長春新堿+柔紅霉素+強的松（vincristine +daunorubicin + prednisone，VDP） 方案再誘導(dǎo)化療達(dá)血液學(xué)完全緩解（hematological complete remission，HCR），經(jīng)過原方案鞏固2 個周期后MRD 仍呈陽性而進行Allo-HSCT。其余3 例經(jīng)多次化療未達(dá)CR 的患者直接進行Allo-HSCT。所有患者均接受預(yù)防性鞘內(nèi)注射（阿糖胞苷30 mg+甲氨蝶呤10 mg+地塞米松5 mg） 6 次，均未發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血?。╟entral nervous system leukemia，CNSL）。

1.5 移植預(yù)處理方案和移植物抗宿主?。╣raft versus host disease，GVHD）防治方案

1.5.1 預(yù)處理方案 Auto-HSCT 和MSD-HSCT組：改良白消胺/環(huán)磷酰胺（busulfan/cyclophosphamide，BU/CY）；Haplo-HSCT 組：改良BU/CY+ 兔抗人胸腺細(xì)胞球蛋白（rabbit anti human thymocyte globulin，rATG）［8］。

1.5.2 Allo-HSCT 組GVHD 預(yù)防方案 采用常規(guī)的環(huán)孢素A （cyclosporin A，CSA） +短程甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）+嗎替麥考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF），CSA 血藥谷濃度維持在150～300 μg·L－1。

1.6 造血干細(xì)胞動員、采集和干細(xì)胞回輸

異體移植供者皮下注射重組人粒細(xì)胞集落刺激因 子 （recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF）（日本麒麟公司產(chǎn)品）5 μg·kg－1·d－1，自第4 天開始使用COBE Spectra 血細(xì)胞分離機采集外周血造血干細(xì)胞，所有供體經(jīng)2～3 次采集均獲得移植所需干細(xì)胞數(shù)。17 例Allo-HSCT 組患者回輸單個核細(xì)胞（mononuclear cell，MNC） 中位數(shù)為9.68 （8.51～12.26） ×108kg－1，CD34+ 細(xì)胞中位數(shù)為5.65 （4.56～6.62） ×106kg－1。Auto-HSCT 組患者采用大劑量環(huán)磷酰胺（4.0 g·m－2） +rhG-CSF （5 μg·kg－1·d－1） 聯(lián)合動員方案，同時使用COBE Spectra 血細(xì)胞分離機采集自體外周血造血干細(xì)胞，所有患者經(jīng)1～2 次采集均獲得移植所需干細(xì)胞數(shù)。3 例Auto-HSCT 患者回輸MNC中位數(shù)為4.42（3.59～5.68）×108kg－1，CD34+ 細(xì)胞中位數(shù)為2.52 （2.05～3.68） ×106kg－1。異基因造血干細(xì)胞回輸采用靜脈推注法，每次以50 mL 注射器抽取采集物通過中心靜脈緩慢推注入患者體內(nèi)。自體造血干細(xì)胞在38 ℃～40 ℃水浴中快速復(fù)溫后以輸血器通過中心靜脈快速回輸。

1.7 移植后BCR/ABL 基因檢測

所有患者均在移植后1、2、3、6、9 和12 個月進行規(guī)律的外周血BCR/ABL 基因檢測，對于規(guī)律檢測中出現(xiàn)BCR/ABL 基因陽性（MRD 陽性） 的患者給予干預(yù)治療，并縮短BCR/ABL 基因檢測周期為每月1 次。對于1 年內(nèi)BCR/ABL 基因檢測持續(xù)為陰性（MRD 陰性） 的患者，之后每半年檢測1 次，直至移植術(shù)后3 年。

1.8 移植后干預(yù)治療原則

1.8.1 Auto-HSCT 組 患者造血重建后，無論BCR/ABL 基因定量檢測結(jié)果如何，均給予TKI 口服進行干預(yù)治療，如出現(xiàn)基因水平的復(fù)發(fā)，建議立即行Allo-HSCT （前提為患者具有Allo-HSCT條件）。

1.8.2 Allo-HSCT 組 患者造血重建后，無論BCR/ABL 基因定量檢測結(jié)果如何，均給予TKI 口服干預(yù)治療，其后檢測BCR/ABL 基因持續(xù)陰性者，TKI 口服干預(yù)治療1 年后停用。如果前3 個月出現(xiàn)BCR/ABL 基因檢測結(jié)果陽性，早期干預(yù)治療主要以口服TKI 為干預(yù)治療手段，3 個月后出現(xiàn)BCR/ABL 基因陽性者以減停免疫抑制劑聯(lián)合TKI治療為干預(yù)手段。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。移植后患者總生存（overall survival，OS） 率以百分率（%） 表示，采用Kaplan-meier 生存模型進行評估。組間比較采用Log-rank 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BCR/ABL 基因定量檢測指導(dǎo)下的移植選擇

15 例本院初診Ph+ALL 患者在誘導(dǎo)治療達(dá)CR后均接受了RT-qPCR 檢測外周血BCR/ABL 基因作為MRD 評估指標(biāo)，其中8 例患者經(jīng)誘導(dǎo)治療后MRD 陰性，依據(jù)患者年齡、體能狀態(tài)和治療意愿為3 例患者進行了Auto-HSCT ，其余5 例及另外7 例初治誘導(dǎo)后MRD 持續(xù)為陽性患者，后期均接受了Allo-HSCT。另外5 例均為在外院治療復(fù)發(fā)后來本院治療的患者，其中2 例在本院經(jīng)再誘導(dǎo)化療后達(dá)HCR，但外周血MRD 持續(xù)為陽性故選擇了Allo-HSCT；其余3 例患者雖經(jīng)多種化療方案仍處于NR 狀態(tài)，檢測BCR/ABL 激酶區(qū)突變發(fā)現(xiàn)2 例為T315I 突變，1 例無突變，3 例患者及家屬移植意愿強烈故最終均選擇了Allo-HSCT。

2.2 Auto-HSCT 組患者干預(yù)治療情況

Auto-HSCT 組3 例患者在造血功能重建后均接受了TKI 維持治療，1 例口服IM 300 mg 每日1 次維持治療，無嚴(yán)重的血液學(xué)毒性。另外2 例在接受IM 300 mg 每日1 次維持治療中出現(xiàn)嚴(yán)重血液學(xué)毒性，分別于移植后6 和14 個月更換為達(dá)沙替尼50 mg 每日1 次維持治療。3 例患者口服TKI 藥物維持治療至今，規(guī)律檢測BCR/ABL 基因持續(xù)保持為陰性，最長隨訪52 個月，至今3 例患者均無病存活。

2.3 Allo-HSCT 組患者干預(yù)治療情況

2 例移植前MRD 陰性的CR1 患者在造血重建后口服IM 300 mg 每日1 次維持治療中出現(xiàn)血液學(xué)毒性且在其后的BCR/ABL 基因檢測中持續(xù)陰性而未再予以干預(yù)治療。另外3 例移植前MRD 陰性的CR1 患者造血重建后口服IM 300 mg 每日1 次維持治療，其中2 例MRD 持續(xù)陰性，無嚴(yán)重血液學(xué)毒性等不良反應(yīng)，于移植后1 年停用IM，患者至今均無病生存；另外1 例于移植后6 個月出現(xiàn)MRD轉(zhuǎn)陽，采用減停免疫抑制劑和達(dá)沙替尼治療無效，移植后9 個月時死于髓內(nèi)復(fù)發(fā)。7 例移植前MRD 陽性的CR1 患者中，4 例患者移植后MRD 持續(xù)為陰性，均給予IM 300 mg 每日1 次口服維持治療1 年后停用；另外2 例患者MRD 持續(xù)未轉(zhuǎn)陰，改為達(dá)沙替尼100 mg 每日1 次口服和減停免疫抑制劑干預(yù)治療無效，分別于移植后10 和15 個月死于CNSL 和髓內(nèi)復(fù)發(fā)； 另外1 例患者移植后2 個月MRD 轉(zhuǎn)陰，但在IM 維持治療5 個月時MRD 再次轉(zhuǎn)陽，遂改為達(dá)沙替尼100 mg 每日1 次口服和減停免疫抑制劑治療，患者MRD 再次轉(zhuǎn)陰，現(xiàn)持續(xù)達(dá)沙替尼治療中。移植前3 例NR 患者在移植后均取得HCR，但MRD 持續(xù)陽性，其中伴有T315I 突變的1 例患者于移植后52 d 死于肺內(nèi)感染，另外1 例患者在移植后2 個月采用早期減停免疫抑制劑，無GVHD 發(fā)生，于移植后6 個月死于CNSL 復(fù)發(fā)；1 例移植前無突變的NR 患者在移植后給予達(dá)沙替尼100 mg 每日1 次口服，于移植后7 個月死于髓內(nèi)復(fù)發(fā)。移植前MRD 陽性的CR2 患者，造血重建后口服達(dá)沙替尼100 mg 每日1 次治療，監(jiān)測MRD 逐漸轉(zhuǎn)陰，現(xiàn)持續(xù)口服達(dá)沙替尼中。移植前1 例MRD 陽性的CR3 患者，造血重建后給予口服達(dá)沙替尼100 mg 每日1 次和減停免疫抑制劑治療，于移植術(shù)后125 d 死于Ⅳ度腸道排異。

2.4 隨訪情況

全組患者移植后均達(dá)到造血重建，粒細(xì)胞植活中位時間為14 （11～24） d，血小板植活中位時間17 （13～52） d。隨訪至2020 年12 月，中位隨訪時間為52 （3～111） 個月。全組患者3 年OS 率為（61.1±11.7）%。Allo-HSCT 組和Auto-HSCT 組患者移植后3 年OS 率分別為（52.8±13.4） %和100.0%，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.178），Auto-HSCT 組3 例患者全部存活。移植前MRD 陰性組和移植前HCR 但MRD 陽性組患者3 年OS 率分別為（87.5±11.7） % 和（42.8±15.6） %，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.065）。移植前NR 患者全部死亡。

3 討 論

Ph+ALL 是一組高危白血病亞型［9］，預(yù)后差，在采用TKI 治療前，Ph+ALL 的患者治療反應(yīng)差，復(fù)發(fā)率高，長期生存率低于25%［10］。但近年來隨著TKI 的使用，Ph+ALL 患者的CR 率大幅提高［11］。目前，國內(nèi)及國外指南均推薦化療+TKI治療緩解后，若有合適供者盡快行Allo-HSCT［12］，移植后進行TKI 維持治療［13］，尤其對于移植后早期評估MRD 陽性的患者。由于考慮到尋找合適供者的難度及 Allo-HSCT 的相關(guān)并發(fā)癥，Auto-HSCT 有可能是一些患者可采取的替代治療［14］。尤其在兒童患者及使用TKI 聯(lián)合化療后3 個月內(nèi)獲得分子生物學(xué)緩解的低危成人患者中，Allo-HSCT 的地位已受到了挑戰(zhàn)，已不再是唯一的治療選擇［15］。CHALANDON 等［16］采用IM+Hyper CVAD 方案對Ph+ALL 患者進行誘導(dǎo)化療，緩解后161 例患者行Allo-HSCT，93 例患者行Auto-HSCT，結(jié)果顯示： Allo-HSCT 組患者5 年P(guān)FS 率和OS 率分別為48.3% 和56.7%，與Auto-HSCT 組（分別為46.1% 和55.1%） 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。呂夢楠等［17］報道：移植前接受TKI+化療治療達(dá)CR 的Ph+ALL 患者78 例，其中31 例行Auto-HSCT，47 例行MSD-HSCT，結(jié)果提示：Auto-HSCT 組和MSD-HSCT 組患者3 年無白血病生存（leukemiafree survival，LFS） 率分別為（51.1±9.7） % 和（55.8±7.5） %，3 年OS 率 分 別 為（71.8±8.5） %和（74.1±6.5） %，組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.803，P=0.919）；全組78 例患者中22 例（28.2%） 死亡，其中Auto-HSCT 組患者的死亡率為29% （9/31），MSD-HSCT 組患者死亡率為27.7% （13/47）。本研究中20 例患者3 年OS 率為（61.1±11.7） % ，Auto-HSCT 組患者3 年OS 率為100.0%，Allo-HSCT 組患者3 年OS 率為（52.8±13.4） %，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究中Auto-HSCT 組患者3 年OS 率為100.0%，明顯優(yōu)于國內(nèi)外報道，考慮可能與移植術(shù)后持續(xù)口服TKI 有關(guān)，目前國內(nèi)外對Auto-HSCT 術(shù)后TKI 藥物維持時間仍未達(dá)成共識［18］。本組患者由于病例數(shù)少缺乏統(tǒng)計學(xué)意義，尚需增加病例數(shù)以進一步評估其療效。

MRD 是指CR 后仍然殘留在血液中的少量白血病細(xì)胞，是2017 年NCCN 指南在CR 基礎(chǔ)上提出的一項重要的預(yù)后決定因素，MRD 的監(jiān)測對于危險分層和化療方案的選擇有一定的指導(dǎo)意義［19］。臨床監(jiān)測MRD 的常用方法是多色流式細(xì)胞術(shù)（multi-parametric flow cytometry ，MFC） 和RT-qPCR，2 種實驗方法之間存在互補，RT-qPCR 靈敏性高，而MFC 特異性高［20］。因此，北美專家共識中優(yōu)先推薦在骨髓標(biāo)本中使用RT-qPCR 檢測BCR/ABL 融合基因作為監(jiān)測MRD的方法［21］。但目前國內(nèi)外學(xué)者［22-23］均證實：以RT-qPCR 法檢測慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myelogenous leukemia，CML） 患者的BCR/ABL融合基因，在外周血和骨髓標(biāo)本中具有很好的一致性。因此，本研究以RT-qPCR 法檢測Ph+ALL 患者外周血中BCR/ABL 融合基因作為MRD 的評估指標(biāo)，不僅減少患者反復(fù)骨穿的痛苦，更為患者減輕了經(jīng)濟負(fù)擔(dān)（RT-qPCR 法的檢測費用低于MFC 法）。

對于Ph+ALL 患者，規(guī)律的MRD 檢測是對預(yù)后評估、治療方案的選擇、提早干預(yù)以及延長患者OS 具有重要意義。目前大部分臨床研究［24-26］表明：早期鞏固治療時達(dá)到MRD 陰性是反映患者預(yù)后的有利因素。日本造血細(xì)胞移植協(xié)會［27］在對432 例Ph+ALL 患者的資料進行回顧性分析時發(fā)現(xiàn)：移植前MRD 陰性患者在移植后的復(fù)發(fā)率明顯低于MRD 陽性患者（分別為19% 和29% ）。呂夢楠等［17］報道：對于移植前達(dá)到s3CMR（在治療后3 個月內(nèi)達(dá)到CMR 且持續(xù)至移植） 的Ph+ALL 患者，Auto-HSCT 組和MSD-HSCT 組患者3 年LFS率、 OS 率和累積復(fù)發(fā)（cumulative incidence of relapse，CIR） 率組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；但在未達(dá)到s3CMR 的患者中，Auto-HSCT 組患者3 年CIR 率明顯高于MSD-HSCT 組。本研究中20 例Ph+ALL 患者，移植前MRD 陽性者均選擇Allo-HSCT，MRD 持續(xù)陰性者則依據(jù)個人意愿選擇Auto-HSCT 或Allo-HSCT，移植術(shù)后依據(jù)不同時間點BCR/ABL 融合基因定量水平的變化給予不同的干預(yù)治療措施，結(jié)果顯示：移植前MRD 陰性組患者OS 率為87.5%，移植前HCR 但MRD 陽性組患者OS 率為58.3%，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮可能與患者例數(shù)少有關(guān)，故仍需增加病例數(shù)以進一步統(tǒng)計療效。

綜上所述，采用RT-qPCR 方法檢測BCR/ABL 融合基因可作為監(jiān)測Ph+ALL 患者MRD 的有效手段，依據(jù)MRD 水平給予不同的治療措施可改善患者的OS。隨著TKI 在移植前后的應(yīng)用，使Allo-HSCT 的地位受到了挑戰(zhàn)，對移植前MRD 持續(xù)陰性的患者可考慮以Auto-HSCT 作為鞏固治療手段。