紅細胞人源化小鼠模型的構(gòu)建及其臨床應用研究進展

劉昊川, 李新賀, 陳 冰

（1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院骨科，吉林 長春 130033；2.深圳大學平湖醫(yī)院骨科，廣東 深圳 518002；3.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院麻醉科，吉林 長春 130033）

紅細胞是人體血液中最重要的組成部分，其主要通過骨髓中造血干細胞分化發(fā)育而來，該過程稱之為紅細胞發(fā)育。紅細胞發(fā)育是指骨髓中巨核細胞-紅系前體細胞分化形成網(wǎng)織紅細胞，隨后網(wǎng)織紅細胞遷移至外周血中分化形成成熟的紅細胞［1］。紅細胞發(fā)育是一個精細而又復雜的過程，在該過程中一個微小的基因調(diào)控異常均會導致嚴重的紅細胞相關(guān)疾病發(fā)生，如β-地中海貧血、遺傳性溶血性貧血和鐮狀細胞疾病等［2-4］。雖然同種異體造血干細胞移植可以治愈該類疾病，但移植物抗宿主?。╣raft versus-host disease，GVHD） 等免疫相關(guān)并發(fā)癥限制了其臨床應用［2-3］。理論上，可以通過基因修飾造血干細胞的方法對某些血液系統(tǒng)疾病進行基因治療［2，4］，但實際上基因治療會產(chǎn)生諸多不良反應和風險，如基因編輯技術(shù)會發(fā)生體內(nèi)突變以及患者在應用基因治療后出現(xiàn)死亡等［5-6］。所以，構(gòu)建一種可以用于人紅細胞相關(guān)疾病臨床前期研究的活體動物模型迫在眉睫。

目前，動物模型是對人類生理系統(tǒng)研究的最佳替代品。小鼠和大鼠等嚙齒類動物，具有體積小、繁殖周期短、易于飼養(yǎng)、與人類共享基因組及某些物理特性和便于基因修飾等優(yōu)點，使其成為免疫學、醫(yī)學和生物學等相關(guān)研究領(lǐng)域中極其重要的動物模型。通過小鼠模型研究人類生理系統(tǒng)存在一定局限性，某些小鼠生理系統(tǒng)的組成與人類不一致，尤其是小鼠的免疫系統(tǒng)，如二者的天然免疫系統(tǒng)分子存在明顯差異，包括小鼠中缺乏功能性Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLR） 10，小鼠的TLR11、TLR12 和TLR13 在人類基因組中不表達等［7］。另外，許多藥物和病原體也有種屬特異性，感染人類的病原體與感染小鼠的病原體存在明顯差別，如人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV） 無法感染小鼠細胞，且乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV） 在普通小鼠中無法復制。所以需要一種能夠模仿人體免疫機能、生理和病理表現(xiàn)、同時具有人類免疫系統(tǒng)的小鼠模型，人源化小鼠模型應運而生。經(jīng)過30 余年的實驗研究和技術(shù)發(fā)展，人源化小鼠模型逐漸完善，并應用于感染和免疫等諸多研究領(lǐng)域，但該模型仍存在一定弊端，有部分人源細胞不能穩(wěn)定重建，如紅系細胞。最早提出人源化小鼠模型中人紅細胞重建的是楊永廣教授，后續(xù)有陳青峰教授等均對紅細胞人源化小鼠模型進行了相關(guān)的探索和研究。但是迄今為止，人源化小鼠模型中人紅細胞的重建比例均未達到理想水平。目前我國關(guān)于人源化小鼠模型的研究已有綜述類報道，但尚未見關(guān)于紅細胞人源化小鼠模型的構(gòu)建和臨床應用進展的綜述類報道?，F(xiàn)對紅細胞人源化小鼠模型的構(gòu)建和臨床應用進行綜述。

1 人源化小鼠模型

人源化小鼠模型可以被定義為移植了人造血干細胞或組織的免疫缺陷小鼠，或是指表達人類基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。人源化小鼠模型的構(gòu)建是通過移植入人的組織、 造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs） 或外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），該模型是人類疾病臨床前期體內(nèi)研究的有效實驗工具，同時也對探索人類生物進程起重要作用。人源化小鼠模型已經(jīng)在癌癥、傳染病和艾滋病等諸多研究領(lǐng)域中廣泛應用。進化上的差異導致小鼠作為受體其免疫系統(tǒng)會對人類供體的異種細胞或組織產(chǎn)生強烈的排斥作用，如果想要消除排斥反應要先破壞受體小鼠的自身免疫系統(tǒng)。由此可見，將免疫缺陷小鼠作為受體小鼠是構(gòu)建人源化小鼠模型的基礎(chǔ)，而新品系免疫缺陷小鼠的產(chǎn)生是人源化小鼠模型不斷優(yōu)化的重要動力。

人源化小鼠模型的優(yōu)化依賴于通過基因修飾改造受體免疫缺陷小鼠，最早的免疫缺陷小鼠為裸鼠，裸鼠的叉頭框蛋白N1 （forkhead box protein N1，F(xiàn)OXN1） 基因缺陷使其胸腺不能發(fā)育，缺乏成熟T 細胞及其相關(guān)免疫排斥反應，但其體內(nèi)存在B 淋巴細胞和自然殺傷（natural killer，NK） 細胞，故該小鼠會排斥人源細胞。隨著技術(shù)的發(fā)展和進步，在免疫缺陷小鼠品系的優(yōu)化過程中出現(xiàn)了3 個重要突破，依次為重度聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，scid）基因的突變、NOD-scid 小鼠的出現(xiàn)和白細胞介素2 受體γ 鏈（interleukin-2 receptor γ-chain，Il2rg）-/-免疫缺陷小鼠的誕生。

1.1 scid 基因突變

第一個突破是CB17 小鼠Prkdcscid（protein kinase，DNA activated，catalytic polypeptide，Prkdc； severe combined immunodeficiency，scid）基因［8］突變后，可以接受人外周血PBMCs［9］、胚胎造血組織［10］和造血干細胞［11］的移植。但在該模型中人組織或細胞的移植率非常低，且移植的人類細胞不能產(chǎn)生有功能的人免疫系統(tǒng)。限制人類細胞移植入CB17-scid 小鼠的因素：①小鼠T 和B 淋巴細胞隨著年齡增長的自發(fā)產(chǎn)生（即T 和B 淋巴細胞泄露）；②高水平的宿主NK 細胞；③其他固有免疫系統(tǒng)活性均限制了人造血組織的移植［12］。scid 基因的突變也會導致DNA 修復受損，從而導致小鼠對輻射敏感度的增加［13］。重組激活基因1（recombination-activating gene 1，Rag-1） 和重組激活基因2 （recombination-activating gene 2，Rag-2）位點的靶向突變可以抑制小鼠體內(nèi)成熟T 淋巴細胞和B 淋巴細胞的發(fā)育，同時不發(fā)生T 淋巴細胞和B 淋巴細胞泄露，或是輻射敏感度增加。但是上述小鼠體內(nèi)依然留存有高水平的NK 細胞活性，從而限制人造血干細胞的移植。

1.2 NOD-scid 小鼠

第二個突破是非肥胖型糖尿病、重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠即NOD-scid 小鼠的出現(xiàn)［14］。將不同品系小鼠的scid 基因進行交叉突變，與其他受試品系如C3H/HeJ-scid 小 鼠 和C57BL/6-scid 小 鼠 比 較，NOD-scid 小鼠可以支持更高比例人PBMCs 的移植［15］。與CB17-scid 小鼠比較，限制人類造血干細胞移植主要障礙之一的NK 細胞活性在NOD-scid小鼠中更低［14-16］。NOD-scid 小鼠自身免疫系統(tǒng)同時存在其他缺陷，使得更高比例的人造血干細胞和人PBMCs 得以存活［17-18］。隨后的研究對NOD-scid小鼠基因進行不同突變，使得人類細胞移植的范圍增加，人源化小鼠模型得以優(yōu)化。但是將人源化NOD-scid 小鼠作為對人類免疫系統(tǒng)的研究對象依然存在一定缺陷，如該小鼠的生存周期相對較短，有殘存的NK 細胞和其他自身免疫系統(tǒng)細胞的活性，從而限制了人類淋巴組織的移植。

1.3 Il2rg-/- 免疫缺陷小鼠

第三個突破是免疫缺陷小鼠純合子Il2rg 的突變［19］。與上述所有品系小鼠比較，該類小鼠能夠支持更高比例人類組織、造血干細胞和PBMCs 移植，Il2rg 是白細胞介素（interleukin，IL）-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15 和IL-21 等高親和受體的重要組成，在上述通路的信號傳導中起重要作用［18］。Il2rg 的缺陷會導致T 淋巴細胞和B 淋巴細胞成熟、發(fā)育和功能的嚴重缺陷，從而抑制NK 細胞的發(fā)育［20］。在1995 年，對小鼠Il2rg 位點進行獨立地靶向突變［20］，其中最重要的一步就是Il2rg-/-免疫缺陷小鼠的產(chǎn)生，該小鼠可以接受更高比例人類細胞和組織的移植。Il2rg-/-免疫缺陷小鼠的品系包括NOD/LtSz-scid Il2rg-/-小鼠（NSG 小鼠）、NOD/Shi-scid Il2rg-/-小 鼠（ NOG 小 鼠）、 BALB/c-Rag2-/-Il2rg-/-小鼠（BRG 小鼠） 和（H2d）-Rag2tm1FwaIl2rgtm1Krf小鼠。在上述品系的Il2rg-/-免疫缺陷小鼠中可以進行更高比例的人類細胞和組織的移植，由此可見，小鼠的品系可以明顯地影響人源化水平。目前，大體上有3 種應用Il2rg-/-免疫缺陷小鼠建立的人源化小鼠模型，具體分類如下。

1.3.1 Hu-PBL-SCID 小鼠模型 Hu-PBL-SCID小鼠模型，通過向免疫缺陷小鼠體內(nèi)注射人外周血白 細 胞 （human peripheral blood leukocytes，hPBLs） 獲得，即Hu-PBL-SCID 小鼠模型。在該模型中，第1 周即可獲得人CD3+T 細胞的成功移植，故該模型是進行人類T 淋巴細胞體內(nèi)作用研究的最佳動物模型，但是由于該模型可產(chǎn)生致死性GVHD，因此試驗周期很短，一般為4～8 周。如果受體小鼠是主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC） Ⅰ或Ⅱ類分子缺陷的NSG 小鼠，實驗周期可以有所延長。主要可以通過2 種方法構(gòu)建該模型： ①先對成年Il2rg-/-免疫缺陷小鼠進行亞致死劑量的輻照，然后注入人造血干細胞，在小鼠體內(nèi)可以產(chǎn)生多種人造血前體細胞，但很少產(chǎn)生人源T 淋巴細胞。可以采用新生Il2rg-/-免疫缺陷小鼠對移植效果進行優(yōu)化，包括NOG、 BRG 和NSG 小鼠； ②先對新生NSG、NOG 或BRG 小鼠進行亞致死劑量的輻照，然后經(jīng)肝內(nèi)注射的方式將人造血干細胞注入小鼠體內(nèi)，該方法可以使人細胞移植效果更佳，并可同時產(chǎn)生人B 淋巴細胞、T 淋巴細胞、NK 細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞。

1.3.2 Hu-SRC-SCID 小鼠模型 Hu-SRC-SCID小鼠模型通過靜脈注射或是骨髓注射的方法向免疫缺陷小鼠體內(nèi)注入人類造血干細胞獲得，造血干細胞可以來源于骨髓、臍帶血、胚胎肝臟和粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF） 動員后的外周血。該模型支持人類免疫系統(tǒng)全系的移植。在該模型中，雖然人類T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、髓系細胞和抗原提呈細胞在外周造血組織中可以產(chǎn)生，但骨髓中產(chǎn)生的粒細胞、白細胞和紅細胞在外周血中比例很低。人類T 淋巴細胞在小鼠胸腺中選擇是通過H2- 限制性的而非HLA-限制性［21］。另外，由于小鼠胸腺缺乏人類T 淋巴細胞全面發(fā)育所需的人類特異性因子，所以人類T 淋巴細胞不能充分發(fā)育［22］。

1.3.3 BLT 小鼠模型 該模型通過在小鼠腎被膜下移植人類胚胎肝臟和胸腺，同時注射入同源胚胎肝臟細胞獲得。研究［23］顯示：BLT 模型中小鼠脾臟和淋巴結(jié)增大，人T 淋巴細胞重建水平明顯提高，12 周后約為20%，同時人B 淋巴細胞和單核細胞等髓系細胞也在小鼠體內(nèi)大量存在；在小鼠脾臟中人T 淋巴細胞分布在脾中央動脈周圍，人T 淋巴細胞附近有成團人B 淋巴細胞的散在分布；在BLT 小鼠模型中不僅會產(chǎn)生人IgM，也產(chǎn)生人IgG （16 周后濃度約為150 mg·L－1），表明人T 淋巴細胞和B 淋巴細胞能夠在小鼠次級免疫組織中產(chǎn)生相互作用。同時，該項研究［23］顯示：抗體類型也可以發(fā)生轉(zhuǎn)換，從IgG1 到IgG4，轉(zhuǎn)換的時間跨度、頻率與人體內(nèi)免疫系統(tǒng)自然狀態(tài)下極其相似。該研究也是首次報道在人源化小鼠模型體內(nèi)產(chǎn)生了體液免疫反應。

在Hu-SRC-SCID 小鼠模型中，人類造血干細胞全系均可發(fā)育。在BLT 小鼠模型中，人類黏膜免疫系統(tǒng)也可以得到發(fā)育，同時人類T 細胞可以在自體人胸腺中進行選擇同時具有HLA-限制性。但是BLT 小鼠有一個缺點，即在很多實驗中該小鼠模型出現(xiàn)了類似于GVHD 的綜合征，使得實驗周期縮短。

雖然Il2rg-/-免疫缺陷小鼠的出現(xiàn)明顯提高了人類細胞、組織和免疫系統(tǒng)的移植率，全世界范圍的科學家依然致力于創(chuàng)造更多新型的可以用于人類疾病前期研究的動物模型。改善后的人源化小鼠模型可用于研究人類生理和病理反應，并可在臨床應用前期評估藥物療效和潛在治療反應。人源化小鼠在HIV 及癌癥研究領(lǐng)域的應用中嶄露頭角，在再生藥品和移植等領(lǐng)域也越來越受到重視。

2 紅細胞人源化小鼠模型的重建現(xiàn)狀

研究［24］顯示：免疫缺陷小鼠體內(nèi)的巨噬細胞是導致人紅細胞被排斥的關(guān)鍵因素，在采用氯磷酸二鈉脂質(zhì)體（Clodronate-Liposome） 清除免疫缺陷小鼠巨噬細胞后，可以優(yōu)化人源化小鼠中人紅細胞重建水平，人紅細胞在該模型中重建比例約為3%。2013 年，CHEN 等［25］應用抗體將小鼠NK 細胞中和后，每日持續(xù)輸入足量的人紅細胞使得人紅細胞持續(xù)存在，用于研究瘧疾等紅細胞相關(guān)疾病，但當撤回人紅細胞后，小鼠體內(nèi)將不再有人紅細胞產(chǎn)生，且該方法無法用于研究人源化小鼠中人造血干細胞向人紅細胞分化發(fā)育的過程。2014 年，該課題組［26］又采用了Clodronate-Liposome 清除小鼠巨噬細胞、抗體中和小鼠中性粒細胞的方法抑制小鼠對人紅細胞的排斥，同時高壓注入表達人促紅細胞生成素和IL-3 的質(zhì)粒，促進人紅細胞在人源化小鼠中的重建，進而研究瘧疾，但人紅細胞在該人源化小鼠中的重建比例較低（1.6%～4.0%）。2014 年，WIJAYALATH 等［27］應用基因編輯的手段，將HLA 適應性-人造血干細胞移植入HLADR4.RagKO.IL2RγcKO.NOD （DRAG） 小鼠中構(gòu)建人源化小鼠，人紅細胞在該人源化小鼠模型中的重建比例很低（0.2%～1.0%）。研究［28］表明：巨噬細胞、 中性粒細胞、 內(nèi)皮細胞和補體C3 在NOD/SCID 小鼠排斥人紅細胞中起重要作用；用眼鏡蛇毒因子（cobra venom factor，CVF） 消耗已經(jīng)清除巨噬細胞的小鼠血清中的補體C3 后，可以提高人紅細胞在人造血干細胞移植小鼠中的重建比例；同時應用CVF 清除小鼠補體C3 和Clodronate-Liposome 清除小鼠巨噬細胞后人紅細胞在人源化小鼠中重建比例明顯升高，為單純應用Clodronate-Liposome 清除巨噬細胞的2 倍，但是重建比例仍不理想。因此，迄今為止，人源化小鼠模型中人紅細胞的重建比例均未達到理想水平，故進一步明確人源化小鼠中人紅細胞排斥機制對開發(fā)更優(yōu)的人源化小鼠模型是十分必要的。

3 人源化小鼠中人紅細胞重建的影響因素

人源化小鼠中人紅細胞重建缺失是困擾紅細胞相關(guān)疾病研究者多年的棘手問題，對于為何人源化小鼠中人T 淋巴細胞、B 淋巴細胞和NK 細胞等髓系細胞能很好重建但紅系細胞重建缺失的機制一直不能明確。影響人源化小鼠中人紅細胞重建的主要因素是小鼠免疫系統(tǒng)對人紅細胞的排斥作用。小鼠免疫系統(tǒng)主要是指補體系統(tǒng)和天然免疫細胞，天然免疫細胞包括巨噬細胞、中性粒細胞和內(nèi)皮細胞等。研究［28］表明：小鼠巨噬細胞對人紅細胞的排斥作用是人源化小鼠中人紅細胞重建缺陷的關(guān)鍵因素，免疫缺陷小鼠中的中性粒細胞和內(nèi)皮細胞對人紅細胞的異種排斥也是導致人源化小鼠中人紅細胞重建缺陷的關(guān)鍵因素。

3.1 補 體

補體是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可以募集免疫細胞，參與抗體和吞噬細胞對外源微生物和壞死細胞的清理［29］，對于宿主的穩(wěn)態(tài)保持是不可或缺的。人體內(nèi)主要是經(jīng)過3 個傳統(tǒng)途徑對補體進行活化，包括經(jīng)典補體活化途徑、凝集素補體活化途徑和旁路補體活化途徑。3 條途徑的共同產(chǎn)物是補體C3，其在補體活化和調(diào)理過程中均起著十分重要的作用［29］。小鼠補體C3 能夠在沒有抗體的情況下直接結(jié)合在人紅細胞表面使其被小鼠吞噬細胞黏附/吞噬［28］，Clodronate- Liposome 和CVF 聯(lián)合連續(xù)注射可以提高人源化小鼠中人紅細胞重建比例，表明小鼠補體C3 對人紅細胞的調(diào)理作用在促進人紅細胞被免疫缺陷小鼠排斥過程中起重要作用。

3.2 巨噬細胞

巨噬細胞作為天然免疫細胞具有較強的吞噬功能，主要負責清理細胞碎片、凋亡細胞、壞死細胞和癌變細胞，同時巨噬細胞也參與排斥外源細胞，特別是異種來源的細胞。巨噬細胞、中性粒細胞和非成熟樹突狀細胞，三者均是專職吞噬細胞。吞噬作用通過靶細胞上配體與吞噬細胞上相應受體結(jié)合啟動，從而激活多種細胞內(nèi)信號通路進而完成吞噬過程。CD47 是一種幾乎表達于所有細胞表面的分子，可以與表達于吞噬細胞（巨噬細胞和樹突狀細胞等） 表面的信號調(diào)節(jié)蛋白α （signal regulatory protein α，SIRPα） 受體特異性結(jié)合，從而向吞噬細胞傳遞 “don’t eat me” 的免疫抑制信號［30］。當異種供體細胞上CD47 分子與受體巨噬細胞上SIRPα 分子不存在交叉反應或交叉反應性弱時，會導致巨噬細胞排斥異種供體細胞［31］。但是，不同品系小鼠的SIRPα 基因具有多態(tài)性，NOD 背景小鼠的SIRPα 分子和人CD47 存在交叉反應，導致NOD/SCID 和NOD/SCID Il2rg-/-小鼠的巨噬細胞不會排斥大多數(shù)人類有核細胞［32］。研究［31］證明：NOD/SCID 小鼠巨噬細胞會以CD47-SIRPα 非依賴的機制強烈排斥人紅細胞，利用Clodronate-Liposome 去除人源化小鼠體內(nèi)小鼠巨噬細胞就能使成熟人紅細胞在小鼠體內(nèi)進行重建。補體C3 在人源化小鼠體內(nèi)巨噬細胞排斥人紅細胞過程中起重要介導作用，Clodronate-Liposome 處理后（去除巨噬細胞） 的人源化小鼠注射CVF 清除補體C3 能進一步將其外周血中huCD235a+人紅細胞的嵌合比例提高2～3 倍［28］。上述研究表明：小鼠巨噬細胞通過補體依賴的方式排斥人紅細胞，該排斥作用是人源化小鼠中人紅細胞重建缺陷的關(guān)鍵因素。

3.3 中性粒細胞

除了巨噬細胞，同為專職吞噬細胞的中性粒細胞也具有一定的吞噬功能［33］。近期研究［28］顯示：小鼠的CD11b+F4/80－LY6G+中性粒細胞在有小鼠血清存在的情況下對人紅細胞也會產(chǎn)生黏附，當對血清進行熱休克處理后黏附現(xiàn)象消失，表明小鼠中性粒細胞通過補體依賴的方式排斥人紅細胞。

3.4 內(nèi)皮細胞

內(nèi)皮細胞在機體內(nèi)分布廣泛，從血腦屏障到肝臟、脾臟和腎臟，從心臟到最小的毛細血管，從淋巴結(jié)到淋巴管，內(nèi)皮細胞排列于整個循環(huán)系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)和重要臟器［34］。內(nèi)皮細胞除了維持機體穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)血流和交換營養(yǎng)物質(zhì)等作用外，同時還是一種非專職吞噬細胞，具有一定的黏附吞噬功能，可以黏附異常紅細胞、血小板和白細胞等［35］。當內(nèi)皮細胞功能受到損害時會引起一系列人體疾病，包括高血壓、動脈粥樣硬化、非典型溶血性尿毒綜合征和急慢性腎損傷等［36］。

內(nèi)皮細胞在機體內(nèi)不同器官和組織中的結(jié)構(gòu)和功能存在一定的差異，但一般選擇容易分離的內(nèi)皮細胞進行體外的相關(guān)實驗，研究者默認所有內(nèi)皮細胞的基本性能是相似的，以保證內(nèi)皮細胞的體外實驗與內(nèi)皮細胞的體內(nèi)活動相關(guān)［37］。機體內(nèi)肺臟和肝臟的血流供應都是不間斷的，在人源化小鼠體內(nèi)肺臟和肝臟會持續(xù)地與人紅細胞進行接觸從而產(chǎn)生排斥［23］，同時肺臟和肝臟的內(nèi)皮細胞可以表達血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1，CD106）、 內(nèi)皮- 白細胞黏附分子1（endothelial-leukocyte adhesion molecule-1 ，ELAM-1，CD62E）和細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1，CD54） 等多種內(nèi)皮細胞活化的標志物，從而對外來抗原產(chǎn)生排斥反應。肝臟是機體內(nèi)吞作用的主要場所，肝臟血竇內(nèi)皮細胞可以通過清道夫受體等識別處理抗原，同時肝臟血竇內(nèi)皮細胞在對異種紅系細胞的排斥中也起著重要的吞噬作用［38］。

機體內(nèi)正常紅細胞具有變形能力，并不黏附到靜止的內(nèi)皮細胞上，當紅細胞出現(xiàn)異常情況或是進行異種移植紅系細胞時則會出現(xiàn)內(nèi)皮細胞的活化以及內(nèi)皮細胞對紅系細胞的黏附［38］。內(nèi)皮細胞活化的標志物包括VCAM-1、 E- 選擇素（E-selectin）和ICAM-1。正常情況下的內(nèi)皮細胞處于靜止狀態(tài)（內(nèi)皮細胞的平均壽命約為1 年）［37］，但是在外來抗原出現(xiàn)或是疾病情況下，內(nèi)皮細胞會被活化，使VCAM-1、 E-selectin 和ICAM-1 等活化標志物升高，從而啟動、介導對抗原或異常細胞的排斥和黏附/吞噬［39］。同時，內(nèi)皮細胞可以借助以下通路對異常的人紅細胞進行黏附/吞噬。在鐮狀細胞疾病中，人紅細胞中的細胞間黏附分子4 （intercellular adhesion molecule-4，ICAM-4） 異常升高，可以直接與內(nèi)皮細胞上的αvβ3整合素結(jié)合，從而介導內(nèi)皮細胞對異常人紅細胞的黏附［40］。有研究［41］顯示：在鐮狀細胞病和真性紅細胞增多癥的患者中，位于人紅細胞上的Lu/BCAM 可以與內(nèi)皮細胞上層黏連蛋白5 （Laminin 5） 結(jié)合從而產(chǎn)生黏附現(xiàn)象。Lu/BCAM 在小鼠成熟紅細胞中不表達，但在人紅細胞中表達，存在著種屬差異性［41］。當人紅細胞形態(tài)出現(xiàn)異常，如發(fā)生凋亡等情況時，位于紅細胞細胞膜內(nèi)部的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS） 會暴露在紅細胞表面。PS 作為一種 “eat me”的調(diào)理信號，可以與乳凝集素（milk fat globule epidermal growth factor-8，MFG-E8） 結(jié)合，而MFG-E8 的另一端則可與內(nèi)皮細胞上的αvβ3整合素和αvβ5整合素結(jié)合，從而介導內(nèi)皮細胞對人紅細胞的黏附和吞噬［42］。MFG-E8 是一種分泌糖蛋白，可以由各種吞噬細胞產(chǎn)生，包括活化的巨噬細胞和不成熟的樹突狀細胞［42］。趨化因子（C-X-C 基元）配 體16 ［chemokine （C-X-C motif） ligand 16，CXCL16］ /結(jié)合磷酯酰絲氨酸和氧化脂蛋白的清道夫受體（scanenger receptor that binds uniquely phospatidylsedne and oxidized lipoprotein ，SR-PSOX） 作為一種趨化因子，既可以游離的形式出現(xiàn)，又可以在內(nèi)皮細胞上作為清道夫受體直接與紅細胞上的PS 結(jié)合，從而促進內(nèi)皮細胞對異常人紅細胞的黏附［43］。

4 人紅細胞疾病的相關(guān)研究及發(fā)展瓶頸

紅細胞人源化小鼠模型可以在瘧疾、鐮狀細胞病和再生障礙性貧血等諸多人紅細胞相關(guān)疾病領(lǐng)域進行應用［44-45］。瘧疾主要通過瘧原蟲感染蚊蟲叮咬人類引起傳播。瘧原蟲在人體內(nèi)的肝臟進行繁殖，釋放入血后感染人體內(nèi)紅細胞，所以一種可以同時模擬瘧原蟲繁殖釋放2 個階段的人源化小鼠模型是最優(yōu)選擇，既有人源肝臟組織又有人紅細胞重建［46］。目前，構(gòu)建人紅細胞嵌合小鼠主要采用2 種方式：人紅細胞的持續(xù)輸注和小鼠體內(nèi)人造血干細胞的移植。一般情況下，科學家將2 種方法聯(lián)合應用。有研究者［25］首先應用抗體中和小鼠巨噬細胞，之后每日持續(xù)輸入大量人紅細胞進而研究瘧疾，但一旦撤回人紅細胞，小鼠體內(nèi)將不再產(chǎn)生人紅細胞。雖然改善了人源化小鼠模型中人紅細胞重建水平，但是需要向小鼠體內(nèi)注射Clodronate-Liposome，Clodronate-Liposome 對于免疫缺陷小鼠有一定的不良反應，當大量持續(xù)輸入時會引起免疫缺陷小鼠在短時間內(nèi)死亡，觀察時間窗不夠。構(gòu)建一個能夠高比例和穩(wěn)定持續(xù)表達不同階段人紅細胞的紅細胞人源化小鼠模型迫在眉睫，也是科學家不斷努力的方向。

5 紅細胞人源化小鼠模型的未來發(fā)展方向

在過去的幾十年間，人源化小鼠模型的構(gòu)建有了很大進展，實驗操作更加簡便，同時更具經(jīng)濟價值，人源化小鼠模型已經(jīng)成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域中疾病臨床前期檢測和造福人類的重要動物模型。當然嚙齒動物與人類之間的交叉反應并不充分，所以在小鼠體內(nèi)這一異種基因環(huán)境下，人造血干細胞的發(fā)育、分化和遷移不充分，導致了人源化小鼠模型有一定的局限性。目前人源小鼠中人紅細胞重建比例仍不理想，對于免疫缺陷小鼠排斥人紅細胞的機制研究仍然是目前的研究熱點，努力構(gòu)建一種能夠穩(wěn)定、持續(xù)和高比例重建人紅細胞的人源化小鼠模型— 紅細胞人源化小鼠模型是未來的努力方向。未來的紅細胞人源化小鼠發(fā)展將更多借助基因編輯技術(shù)，如某些特定靶向基因的敲除，或是繁育出新品系的免疫缺陷小鼠。在全世界范圍內(nèi)，人源化小鼠模型研究領(lǐng)域的專家們都致力于小鼠品系及性能的優(yōu)化，以期使人源化小鼠模型在不久的將來能充分為人類造福。