吉林省長春市手足口病患者流行病學特征及腸道病毒71 型VP1 基因特征分析

張興國, 李晨光, 張智麗, 孫 宇, 崔 薇, 初 秋, 喬鳳娟, 王宇冰, 孫炳欣

（吉林省長春市疾病預防控制中心微生物檢驗所，吉林 長春 130033）

手足口病是一種常見于5 歲以下嬰幼兒及兒童的傳染性疾病，腸道病毒71 型（enterovirus 71，EV-A71）和柯薩奇病毒A組16型（Coxsackieevirus 16，Cox-A16） 是引起手足口病的主要病原體［1］，其中EV-A71 更易導致神經(jīng)系統(tǒng)重癥甚至死亡［2］。2008 年手足口病作為丙類傳染病納入我國法定傳染病管理系統(tǒng)，并按要求進行報告［3］。吉林省最早的手足口病病例報道于1984 年，感染病原體為Cox-A16［4］，2008－2009年再次出現(xiàn)流行現(xiàn)象，發(fā)病主要集中在吉林省長春地區(qū)，主要病原體轉(zhuǎn)變?yōu)镋V-A71［5］，此后也一直以EV-A71 為主［6］。由于手足口病的病原具有多樣性，而且不同血清型的病原之間常發(fā)生重組變異，導致每年的優(yōu)勢流行株發(fā)生變遷［7］。為了解吉林省長春地區(qū)手足口病流行情況，現(xiàn)對2014－2018 年收集的手足口病病例標本進行檢測，對手足口病流行特征及EV-A71 VP1 基因特征進行分析，為手足口病防控策略的制定及疫苗株的挑選提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來源

收集2014－2018 年中國疾病預防控制信息系統(tǒng)中吉林省長春地區(qū)醫(yī)療機構(gòu)報告的手足口病例的流行病學相關(guān)資料；病原學檢測數(shù)據(jù)來自吉林省長春市疾病預防控制中心手足口病網(wǎng)絡(luò)實驗室，人口資料來源于吉林省長春市統(tǒng)計局。

1.2 標本來源

2014－2018 年，經(jīng)吉林省長春市14 家縣市區(qū)疾控中心采集的，來自吉林省長春市市區(qū)及開發(fā)區(qū)的6 家醫(yī)療機構(gòu)（長春市傳染病醫(yī)院、長春市兒童醫(yī)院、吉林大學第一醫(yī)院、吉林大學第二醫(yī)院、中日聯(lián)誼醫(yī)院和長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院） 和附屬縣市區(qū)的5 家醫(yī)療機構(gòu)（榆樹市醫(yī)院、長春市雙陽區(qū)醫(yī)院、德惠市醫(yī)院、農(nóng)安縣醫(yī)院和長春市九臺區(qū)醫(yī)院） 臨床診斷的部分手足口病病例標本。

1.3 診斷標準

按照《手足口病診療指南（2018 年版）》［8］中診斷標準進行診斷。①臨床診斷病例。在流行季節(jié)發(fā)病，常見于學齡前兒童，嬰幼兒多見，發(fā)熱伴手、足、口和臀部皮疹，部分病例可無發(fā)熱。極少數(shù)重癥病例皮疹不典型，臨床診斷困難，需結(jié)合病原學或血清學檢查做出診斷。②確診病例。臨床診斷病例具有下列結(jié)果之一者即可確診： 腸道病毒（ Cox-A16 和EV-A71 等） 特異性核酸檢測陽性；分離出腸道病毒，并鑒定為Cox-A16 、EV-A71 或其他可引起手足口病的腸道病毒； 急性期和恢復期血清Cox-A16 、EV-A71 或其他可引起手足口病的腸道病毒中和抗體有4 倍以上的升高。

1.4 標本采集

按照《手足口病預防控制指南（2009 版）》要求采集吉林省長春市各縣市區(qū)醫(yī)療機構(gòu)報告的部分手足口病臨床診斷病例的標本，包括肛拭子、糞便和咽拭子等樣本，共采集2 680 例。

1.5 病毒核酸提取和實時熒光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測

所采集樣本采用全自動核酸提取儀（江蘇碩世生物科技股份有限公司） 依據(jù)說明書步驟提取核酸。采用德國QIAGEN 公司腸道病毒RT-qPCR 試劑盒（210212），對樣本中總腸道病毒、 EV-A71和Cox-A16 進行檢測，其中EV-A71 陽性標本VP1區(qū)通過RT-qPCR 進行擴增。引物序列：EV-A71-VP1-F，5′-ATAATAGCACTAGCGGCAGCC-3′；EV-A71-VP1-R，5′-CAAGATGTCGGTTGACCACTC-3′。反應(yīng)條件： 55 ℃、 30 min； 94 ℃、2 min；94 ℃、15 s，55 ℃、30 s，68 ℃、40 s，35個循環(huán)；72 ℃、10 min。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物采用毛細管電泳儀（卡夾QIAxcel，DNA Screening Cartridge）進行電泳并觀察結(jié)果，檢測到目的片段長度為1 000 bp 的標本送至生工生物工程（上海） 有限公司進行測序。

1.6 EV-A71 基因比對和進化樹的構(gòu)建

本研究采用LaserGene 軟件包中MegaAlign 軟件，對序列進行比對，截取VP1 區(qū)（891 bp） 進行后續(xù)分析。用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的EV-A71 各基因型代表株的參比序列均來自美國國立生物技術(shù)信息中 心 （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov /）GenBank 數(shù)據(jù)庫。采用鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，采用MEGA X 軟件并設(shè)置bootstrap 值為1 000。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用描述性流行病學方法對2014－2018 年吉林省長春市手足口病流行病學資料進行分析。采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)錄入和統(tǒng)計學分析。地區(qū)分布和人群分布等計數(shù)資料的描述以率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 吉林省長春市手足口病疫情概況

2014－2018 年吉林省長春市累計報告手足口病病例12 685 例，年均發(fā)病率為32.78/10 萬，累計報告重癥146 例，死亡2 例。

2.1.1 時間分布 2014－2018 年每年均有手足口病病例報告，流行趨勢基本相同呈單峰分布。報告病例從6 月份進入快速上升期，7 月份達到高峰，8 月份逐步回落，呈明顯的季節(jié)性。

2.1.2 地區(qū)分布 吉林省長春市2014－ 2018 年14 個縣區(qū)均有手足口病病例報告，年均報告發(fā)病率前3 位的地區(qū)為高新區(qū)（129.14/10 萬）、寬城區(qū)（102.17/10 萬） 和經(jīng)開區(qū)（100.98/10 萬），報告發(fā)病率最低為榆樹市（6.16/10 萬）。

2.1.3 人群分布 吉林省長春市2014－2018 年報告的手足口病例中，男性7 464 例，女性5 221 例，男女比為1.43∶1，男性高于女性?；颊咭? 歲以下兒童為主，占發(fā)病總數(shù)的93.08%。隨著患者年齡的增加，發(fā)病率呈逐漸下降趨勢。主要分布在散居兒童，占發(fā)病總數(shù)的80.77%，其次為幼托兒童（15.01%），學生占4.00%。

2.2 病原學檢測結(jié)果

對2014－2018年吉林省長春市手足口病2 680例樣本進行病原學檢測，共1 924 例核酸檢測為陽性，占病例總數(shù)的71.75%。在1 920 例核酸檢測陽性病例中，Cox-A16 陽性452 例，占陽性病例總數(shù)的23.94%；EV-A71 陽性678 例，占陽性病例總數(shù)的35.24%；其他腸道病毒陽性794 例，占陽性檢出的41.27%。其中2014 和2017 年優(yōu)勢 型別為EV-A71，分別占比63.34% 和66.20%，其他年份為其他腸道病毒高發(fā)。吉林省長春市EV-A71 陽性樣本各月份均有檢出。2014 年3－9 月手足口病病毒型別以EV-A71 為主，2015 和2016 年EV-A71 型檢出較少。2017 年5 月－2018 年5 月吉林省長春市手足口病監(jiān)測病例中檢出的手足口病病毒型別以EV-A71 為主，且呈逐漸上升的趨勢，在2018年2月和5 月達到峰值，占當月病例的100%。見圖1 和表1。

表1 2014－2018 年吉林省長春市手足口病患者的病原學構(gòu)成Tab.1 Pathogenic compositions of patients with hand-foot-mouth disease in Changchun City of Jiin Province from 2014－2018［n（η/%）］

圖1 2014－2018 年不同月份吉林省長春市手足口病患者EV-A71 陽性檢出率Fig.1 Positive detection rates of EV-A71 in patients with hand-foot-mouth disease in Changchun City of Jilin Province from 2014 to 2018

2.3 EV-A71 VP1 區(qū)基因特征分析

2.3.1 進化分析 基于VP1 區(qū)（891 bp） 對本次實驗獲的146 條EV-A71 序列及EV-A71 各基因型和亞型參考株序列進行進化分析，結(jié)果顯示：2014－2018 年手足口病病例中EV-A71 毒株相對集中，136條序列屬于C4亞型，其余10條（2017年3條，2018 年7 條） 屬于B5 亞型（圖2）。所獲得序列與EV-A71 的原型株同源性為82.3%～83.8%，與C4 亞型同源性為94.2%～97.5%，其中與C4a 亞型同源性較高，各株之間同源性為92.3%～99.8%。見圖3。

圖2 2014－2018 年吉林省長春市手足口病患者病原EV-A71 的VP1 蛋白系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of VP1 region of EV-A71 strains isolated from patients with hand-foot-mouth disease in Changchun City of Jilin Proince from 2014－2018

圖3 2014－2018 年吉林省長春市手足口病患者病原EV-A71 基于VP1 區(qū)序列同源性分析Fig.3 Homology analysis on EV-A71 of patients with hand-foot-mouth disease based on sequences of VP1 region in Changchun City of Jilin Provice from 2014-2018

2.3.2 變異位點分析 選取所獲得序列中的代表序列通過MEGA X 翻譯獲得氨基酸序列進行變異位點分析，其中VP1 區(qū)145 氨基酸位點為E ，2018 年2株（ccHFME2018008 和ccHFME2018003）檢測到VP1104D，另外3株（ccHFME2018043、 ccHFME2018044 和ccHFME2018041） 檢測到VP1218R； 與C4 亞型比較，B5 亞型有VP143E、VP158T和VP1184T3 個氨基酸位點差異，其余各株主要毒理位點和抗原性位點未發(fā)生變異。見圖4。

圖4 2014-2018 年吉林省長春市手足口病患者病原EV-A71 的VP1 區(qū)氨基酸變異位點Fig.4 Variation sites of amino acid in VP1 region of EV-A71 of patients with hand-foot-mouth disease in Changchun City of Jilin Province from 2014 to 2018

3 討 論

手足口病是一種常見于兒童的自限性急性傳染病，其傳播途徑復雜，發(fā)展速度較快，少數(shù)重癥患者可出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥，甚至危及生命［8-9］。EV-A71是一種快速傳播的病原體，會導致手足口病，在世界范圍內(nèi)造成了嚴重的疾病負擔［10-11］。

2014－2018 年，吉林省長春市累計報告手足口病病例12 685 例，年均發(fā)病率為32.78/10 萬，其中2014 和2017 年優(yōu)勢型別均為EV-A71，其他年份為其他腸道病毒高發(fā)。從時間來看，吉林省長春市手足口病陽性樣本各月份均有檢出，發(fā)病具有明顯的季節(jié)性，6～8 月病例數(shù)明顯增多，夏季高發(fā)，2014 年3－9 月和2017 年5 月－2018 年5 月，手足口病病毒型別以EV-A71 為主，呈逐漸上升的趨勢。本研究手足口病患者中，男性7 464 例，女性5 221 例，男性高于女性，男女比為1.43∶1；患者年齡分布較為集中，多數(shù)病例為5 歲以下兒童，與國內(nèi)相關(guān)報道［12-13］一致。可能是因為男孩更為活潑好動，戶外活動較多，增加了暴露和感染的風險［14］。

世界范圍內(nèi)流行的EV-A71 包括A～F 6 種不同基因型，其中主要流行型別為B 和C 型，其中B 型又包括B0～B5 6 個亞型，C 型包括C1～C5 5 個亞型，我國主要流行型別為C4 亞型［15-16］。本研究獲得的146 條序列中136 條為C4 亞型中的C4a 型，與國內(nèi)流行趨勢一致。B5 亞型為一種只在亞洲流行的型別，日本、馬來西亞、文萊和新加坡多次有暴發(fā)檢出［17-18］，近年來我國臺灣省、 江蘇省、 廈門市、重慶市和昆明市等地有檢出，此次檢出10 條序列為B5 亞型，需持續(xù)監(jiān)測。VP1 蛋白是腸道病毒分子結(jié)構(gòu)中重要的結(jié)構(gòu)蛋白［19］。通常腸道病毒的分類可以通過VP1 區(qū)域的核苷酸差異來定義［20-21］。EV-A71 VP1 蛋白包含297 個氨基酸，位于衣殼區(qū)最外部，包含重要的中和表位。EV-A71 VP1 蛋白145 位氨基酸位點是研究最多的毒力位點［22-23］，存在VP1145G、VP1145Q和VP1145E3 種類型，本次實驗所獲序列均為VP1145E，為手足口病患者中最為常見的類型。VP1N104D可能是影響感染能力的表位［24］，2018 年有2 株病毒檢測到有此變異，另外有3 條檢測到VP1K218R，可能會影響疫苗免疫效果，引起免疫后逃逸，需要密切關(guān)注并持續(xù)監(jiān)測。B5 亞型較C4 亞型多VP143E、VP158T和VP1184T3 個突變位點，其是否會引起廣泛的流行還需進一步的研究監(jiān)測。總之，對EV-A71 流行特征及變異情況進行系統(tǒng)分析并追溯其傳播規(guī)律，對手足口病防控具有重要意義。