新疆邊境地區(qū)蜱攜帶梨形蟲種類的分子鑒定

仇曉飛，林漢亮，羅 金，馬力克·艾則孜，康逢義，倪 軍，羅 毅，劉文閣，馬 站，任巧云，曹潤來，譚陽春，張高峰，刁沛文，王奇林，劉佩雯，關(guān)貴全，羅建勛，殷 宏,5，徐庚全，劉光遠(yuǎn)*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省動物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046；3.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊 830011；4.蘭州市經(jīng)濟(jì)作物試驗(yàn)推廣站，甘肅蘭州 730083；5.揚(yáng)州大學(xué)江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009)

蜱(tick)是一種專性吸血的外寄生蟲，以括兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類(包括人)的脊椎動物為宿主，可傳播諸如病毒、立克次體、螺旋體、埃立克體、巴爾通體、巴貝斯蟲、泰勒蟲等多種病原體，作為多種人獸共患病病原的傳播媒介，對人類健康及畜牧業(yè)的發(fā)展造成了重大影響[1-2]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計，僅蜱傳性血液原蟲病給全球畜牧業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失，每年高達(dá)70億美元。梨形蟲是一種寄生于紅細(xì)胞中的原生動物，形狀類似梨籽，故稱為梨形蟲[3]。梨形蟲通常包括泰勒蟲和巴貝斯蟲。截止目前，我國報道的泰勒蟲主要包括環(huán)形泰勒蟲(Theileriaannulate)、東方泰勒蟲(T.orientalis)、馬泰勒蟲(T.equi)、中華泰勒蟲(T.sinensis)、呂氏泰勒蟲(T.luwenshuni)、尤氏泰勒蟲(T.uilenbergi)、綿羊泰勒蟲(T.ovis)和泰勒蟲未定種(Theileriasp.)等；我國報道的巴貝斯蟲主要包括雙芽巴貝斯蟲(Babesiabigemina)、牛巴貝斯蟲(B.bovis)、卵形巴貝斯蟲(B.ovata)、大巴貝斯蟲(B.major)、東方巴貝斯蟲(B.orientalis)、粗糙巴貝斯蟲(B.crassa)、隱藏巴貝斯蟲(B.occultans)、田鼠巴貝斯蟲(B.microti)、犬巴貝斯蟲(B.caniscanis)、莫氏巴貝斯蟲(B.motasi)和巴貝斯蟲未定種(Babesiasp.)等。泰勒蟲和巴貝斯蟲能引起動物和人的泰勒蟲病及巴貝斯蟲病，統(tǒng)稱這兩種病為梨形蟲病。梨形蟲病在臨床上一般以急性多見，臨床癥狀為高熱、黃疸、貧血、血紅蛋白尿或體表淋巴結(jié)腫脹[4]。梨形蟲病在動物及其產(chǎn)品的國際貿(mào)易中非常重要，能給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報道，梨形蟲病對世界許多熱帶和亞熱帶地區(qū)的畜牧業(yè)造成了巨大影響[5]，蜱作為其傳播媒介，對梨形蟲病的發(fā)生起著至關(guān)重要的作用。

新疆維吾爾自治區(qū)(簡稱新疆)是我國最大的內(nèi)陸省份，占國土總面積六分之一，位于西北邊陲。截至目前，新疆報道的蜱種共有9屬45種，且主要傳播無漿體、伯氏疏螺旋體、立克次體、梨形蟲等病原[6-7]。由于新疆地理位置特殊，與蒙古、哈薩克斯坦等8個國家接壤[5]，增加了外來病原跨境傳播的風(fēng)險。作為中國五大牧區(qū)之一，新疆畜產(chǎn)品的國內(nèi)、國際貿(mào)易較為頻繁，這為蜱傳病原的跨境傳播提供了可能[1]，更有可能造成蜱傳病在新疆甚至全國蔓延。因此，有必要對新疆沿邊境廣大地域的蜱傳梨形蟲的種類及其分布特征進(jìn)行系統(tǒng)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蜱的采集 2019年本實(shí)驗(yàn)室在蜱與蜱傳病活躍季節(jié)的4月份和5月份，對新疆邊境地區(qū)的喀什市、溫宿縣、阿合奇縣、阿圖什市、烏什縣、墨玉縣、皮山縣、阿克蘇市(新疆西北邊境地區(qū))，伊寧市、新源縣、鞏留縣、霍城縣、伊寧縣、尼勒克縣、察布查爾錫伯自治縣、溫泉縣(新疆北部邊境地區(qū))，和布克賽爾蒙古自治縣、塔城市、布爾津縣、富蘊(yùn)縣、吉木乃縣、哈巴河縣、青河縣、巴里坤哈薩克自治縣及奇臺縣(新疆東北邊境地區(qū))25個縣(市)的蜱進(jìn)行采集。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 生物安全柜(BSC-1304Ⅱ A2型)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；普通PCR儀(T100型)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；核酸電泳儀(DYY-12型)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；全自動凝膠成像儀(AlphaImager HP型)，美國ProteinSimple公司產(chǎn)品；4℃離心機(jī)(5417R型)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；水浴鍋(DK-98-П A型)，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 2×EasyTaqPCR Super Mix預(yù)混酶，全式金公司產(chǎn)品；PGEMR-T Easy 載體，T4 DNA連接酶，Promega公司產(chǎn)品；Gel Extraction Kit膠回收試劑盒，OMEGA公司產(chǎn)品；DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000、大腸埃希氏菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，TaKaRa公司產(chǎn)品；組織DNA提取試劑盒，QIAGEN公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 蜱的鑒定 將采集到的蜱帶回中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.2 蜱DNA的提取 形態(tài)學(xué)鑒定后的蜱分別用于基因組DNA的提取。將蜱置于750 mL/L酒精中浸泡5 min，棄洗液后加入適量的PBS，渦旋15 s，重復(fù)操作3次。吸水紙吸干蜱表面殘留的液體，加入少許液氮充分研磨，參考組織DNA提取試劑盒的操作說明進(jìn)行基因組DNA提取，獲得的基因組DNA置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計及PCR擴(kuò)增 首先采用梨形蟲18S rRNA基因通用引物Piro1-S/Piro3-AS對所有樣品進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)一步用套式引物PIRO1-A/ PIRO-B進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增[8]。反應(yīng)體系為50 μL：預(yù)混酶25 μL，上、下游引物各1 μL，基因組DNA模板2 μL，滅菌去離子水21 μL。反應(yīng)條件是：95 ℃ 預(yù)變性3 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán);最后72 ℃終延伸 5 min。產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(陽性對照所加模板為實(shí)驗(yàn)室已有陽性樣品，陰性對照所加模板為滅菌去離子水)。所有檢測陽性樣品均進(jìn)行體外克隆、測序。參考OMEGA公司DNA膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物回收?；厥盏腄NA片段與T-easy載體16 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，將其均勻涂布在含0.1 moL/L IPTG和X-Gal的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑取單克隆菌斑于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行菌液培養(yǎng)。PCR進(jìn)行復(fù)檢，方法如上所述。陽性克隆送公司測序。

1.2.4 序列比對及進(jìn)化分析 測序正確的梨形蟲18S rRNA核苷酸序列與GenBank中已發(fā)表的相關(guān)序列(表1)進(jìn)行多序列比對。采用IQ-Tree軟件ML法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 基于梨形蟲18S rRNA相關(guān)序列信息

2 結(jié)果

2.1 蜱的鑒定及分類

本研究對采集的1 516只蜱經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定后，發(fā)現(xiàn)共有4屬9個種(新疆西北邊境地區(qū)3屬6種、新疆北部邊境地區(qū)4屬5種、新疆東北邊境地區(qū)2屬2種)，分別為革蜱屬的森林革蜱(Dermacentorsilvarum)80只、草原革蜱(D.nuttalli)301只、脛距革蜱(D.pavlovskyi)86只、邊緣革蜱(D.marginatus)48只，璃眼蜱屬的亞洲璃眼蜱(Hyalommaasiaticum)450只、麻點(diǎn)璃眼蜱(H.rufipes)99只、小亞璃眼蜱(H.anatolicum)25只，扇頭蜱屬的血紅扇頭蜱(Rhipicephalussanguineus)377只，血蜱屬的刻點(diǎn)血蜱(Haemaphysalispunctate)50只(表2)。

2.2 蜱攜帶梨形蟲的種類及分布

經(jīng)套式PCR擴(kuò)增與測序分析結(jié)果顯示，在采集的1 516只蜱中，梨形蟲的攜帶率為27.77%，不同邊境地區(qū)蜱的梨形蟲攜帶率不同，其中，新疆西北邊境地區(qū)梨形蟲的攜帶率為25.70%，新疆北部邊境地區(qū)梨形蟲的攜帶率為37.47%，新疆東北邊境地區(qū)梨形蟲的攜帶率為18.93%，且皮山縣采集的亞洲璃眼蜱梨形蟲攜帶率最高(80%)，霍城縣采集的刻點(diǎn)血蜱梨形蟲攜帶率次之(78%)，而在尼勒克縣、塔城市、布爾津縣、吉木乃縣和哈巴河縣等地區(qū)所采集的蜱中均未檢測到梨形蟲(表2)。

表2 新疆不同地區(qū)蜱攜帶梨形蟲的檢測結(jié)果

續(xù)表2

2.3 梨形蟲的進(jìn)化特征分析

通過Blast序列比對發(fā)現(xiàn)，共檢測到9種梨形蟲，包括3種泰勒蟲和6種巴貝斯蟲，分別為綿羊泰勒蟲(T.ovis)、馬泰勒蟲(T.equi)、泰勒蟲未定種(Theileriasp.)，駑巴貝斯蟲(B.caballi)、莫氏巴貝斯蟲(B.motasi)、粗糙巴貝斯蟲 (B.crassa)、隱藏巴貝斯蟲(B.occultans)、犬巴貝斯蟲(B.caniscanis)和巴貝斯蟲未定種(Babesiasp.)。進(jìn)化樹結(jié)果顯示，本研究所檢測到的蟲種均能與各自的種株聚為一支。其中，T.ovis表現(xiàn)出極高多樣性的特征，不僅新疆區(qū)域內(nèi)存在多種基因型，而且霍城株與埃及株(№KY494648.1)及意大利株(№MT242575.1)同源性為98%以上，與烏什、墨玉及伊寧等縣的同源性較低(圖1)。B.occultans富蘊(yùn)縣地方株與阿圖什市地方株位于兩個不同分支，其中，富蘊(yùn)縣地方株與中國新疆株(№KU723564.1)的同源性達(dá)100%，阿圖什市地方株與澳大利亞地方株的同源性(№MN726547.1)也達(dá)100%(圖2)。

圖1 新疆不同地區(qū)蜱攜帶的泰勒蟲分子進(jìn)化樹

圖2 新疆不同地區(qū)蜱攜帶的巴貝斯蟲分子進(jìn)化樹

3 討論

梨形蟲是一類蜱傳播性血液寄生蟲，在全國范圍廣泛流行，特別是在西部牧區(qū)對養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。本研究調(diào)查顯示，新疆邊境地區(qū)的蜱優(yōu)勢種為亞洲璃眼蜱、血紅扇頭蜱和草原革蜱，但以上蜱種的分布會伴隨氣候變化、動物遷徙等因素而發(fā)生改變，繼而蜱傳梨形蟲的種類也會相繼發(fā)生改變，給相關(guān)梨形蟲病的防控帶來了挑戰(zhàn)。之前的研究顯示，新疆蜱種主要以璃眼蜱屬和革蜱屬為主[9]，與本研究結(jié)果基本一致，但本研究發(fā)現(xiàn)血紅扇頭蜱亦是當(dāng)前新疆的優(yōu)勢蜱種之一，這可能為綿羊泰勒蟲的進(jìn)一步傳播流行提供了條件。

地理位置以及生態(tài)環(huán)境對蜱的生長繁殖起著決定性作用，可造成蜱傳病原不同地區(qū)差異的特征。新疆北部邊境地區(qū)常年氣候濕潤多雨，多以草地為主，這種環(huán)境有利于蜱的生長繁殖，也為蜱傳病原的存活創(chuàng)造了有利的條件，因而也造成了蜱傳病原攜帶率高的特點(diǎn)。本研究證實(shí)，新疆北部邊境地區(qū)蜱主要分為4個屬的5個蜱種，其梨形蟲攜帶率高達(dá)37.47%，高于本研究中27.77%的梨形蟲平均攜帶率。新疆西北邊境地區(qū)有3個屬6個蜱種的滋生，說明這種半干旱地區(qū)的氣候也適宜蜱的寄生，但這種氣候可能導(dǎo)致蜱生長繁殖的高峰期略早于本試驗(yàn)采集蜱的時間(4月份和5月份)，可能是造成該地區(qū)25.70%的梨形蟲攜帶率低于北部邊境地區(qū)37.47%的攜帶率的原因，但該攜帶率與本研究中27.77%的梨形蟲平均攜帶率相比幾乎相同，仍高于25%，依然不能否認(rèn)該地蜱梨形蟲攜帶率高的事實(shí)。新疆東北邊境地區(qū)主要包括2個蜱屬里的2個種，

該地區(qū)梨形蟲攜帶率為18.94%，低于本研究27.77%的平均攜帶率，且低于另外兩個地區(qū)，有幾地甚至未檢測到梨形蟲。該地區(qū)中幾乎所有的地方相比其他兩個地區(qū)氣候寒冷，因此蜱的生長繁殖相對略晚于另外兩個地區(qū)，這可能是造成該地區(qū)蜱梨形蟲攜帶率較低的主要原因，當(dāng)然，也不排除當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)防控措施做的較好的可能性。

本研究在新疆邊境地區(qū)蜱中共檢出了9種梨形蟲，包括3種泰勒蟲(T.ovis、T.equi、Theileriasp.)和6種巴貝斯蟲(B.caballi、B.motasi、B.crassa、B.occultans、B.caniscanis、Babesiasp.)，梨形蟲蟲種的多樣性為后期相關(guān)疾病的防控帶來了挑戰(zhàn)。本次檢測到的3種泰勒蟲，之前在新疆均有過報道，其中T.ovis致病性較弱。本研究發(fā)現(xiàn)，T.ovis18S rRNA序列多樣性特征明顯，霍城株、埃及株及意大利株處于相同的分類地位，其進(jìn)化程度早于烏什、墨玉及伊寧等地。新病原的輸入使得其為適應(yīng)環(huán)境變化而導(dǎo)致基因多樣性的出現(xiàn)，這也是造成相同蟲種不同基因型的主要原因之一。另一方面，畜禽貿(mào)易或動物遷徙亦造成了相同蟲株不同地域分布這一特征。此外，在中東等地區(qū)出現(xiàn)的Theileriasp.在本次檢測中也有檢出，說明Theileriasp.已在我國新疆有分布。

巴貝斯蟲作為另外一類重要的梨形蟲病原，其對家畜和人造成了嚴(yán)重危害。自1982年以來，在中國大陸已經(jīng)發(fā)現(xiàn)巴貝斯蟲11種[10]。其中，B.caballi呈世界性分布，在美洲、非洲、亞洲、歐洲、大洋洲均有B.caballi的相關(guān)報道[11]。本研究從森林革蜱、草原革蜱、邊緣革蜱及亞洲璃眼蜱中也檢測到了B.caballi，文獻(xiàn)報道革蜱屬、璃眼蜱屬和扇頭蜱屬是B.caballi的傳播媒介[5]，這與本研究結(jié)果一致。B.caballi在待檢地區(qū)較為普遍，這可能與當(dāng)?shù)伛R屬動物規(guī)?；B(yǎng)殖有著密切的關(guān)系。

B.occultans是一種研究尚少的巴貝斯蟲，Munir A等[12]于2014年首次在土耳其圖蘭扇頭蜱中檢測到B.occultans，Song R等[5]于2017年首次在我國新疆吉木乃縣草原革蜱中檢測到該蟲株。本試驗(yàn)則分別從新疆阿圖什市采集的小亞璃眼蜱和富蘊(yùn)縣采集的亞洲璃眼蜱中檢測到B.occultans，且分子進(jìn)化分析表明，新疆富蘊(yùn)縣地方株與中國新疆株(№KU723564.1)同源性達(dá)100%，屬于同一分類地位，而新疆阿圖什市地方株與澳大利亞地方株(№MN726547.1)屬同一分支，親緣關(guān)系更近，同源性為100%，而同為新疆區(qū)域來源的富蘊(yùn)縣地方株與阿圖什市地方株同源性為99.7%，推測親緣關(guān)系較近的不同地方株可能因?yàn)榄h(huán)境差異而導(dǎo)致序列個別堿基的突變。該研究結(jié)果擴(kuò)展了B.occultans發(fā)生地的范圍及感染蜱種的多樣性。

B.motasi不僅是一種感染羊的重要蜱傳播性梨形蟲，而且可感染人，其傳播媒介主要為刻點(diǎn)血蜱和囊形扇頭蜱[13]。 Hong S H等[14]于2019年從韓國1例死亡病例的人血中檢測出巴貝斯蟲病，最終鑒定該巴貝斯蟲屬于B.motasi；本研究在草原革蜱及麻點(diǎn)璃眼蜱中檢測到B.motasi。賈娜等[15]于2018年在中國東北地區(qū)肩突硬蜱(Ixodespersulcatus)、嗜群血蜱 (Haemaphysalisconcinn)以及蜱叮咬后患者血液中檢測到B.crassa。B.crassa是另外一種可能感染人的巴貝斯蟲，本次在脛距革蜱中檢測到了該蟲種。

值得注意的是，本研究從血紅扇頭蜱、刻點(diǎn)血蜱及麻點(diǎn)璃眼蜱中檢測到T.ovis，而之前的報道顯示，T.ovis的傳播媒介僅為囊形扇頭蜱、森林革蜱和小亞璃眼蜱等[16]。本研究還從草原革蜱中檢測到B.caniscanis，已有研究證實(shí)網(wǎng)蚊革蜱是犬巴貝斯蟲的傳播媒介[17]。這些尚未證實(shí)的媒介體內(nèi)檢測到的相關(guān)梨形蟲可能為未來新的媒介的發(fā)現(xiàn)提供一定的線索，但因本次所采集的蜱均為半飽血或飽血狀態(tài)，所以也不排除這一結(jié)果可能是蜱機(jī)械性攜帶造成的，究竟它們之間是否為實(shí)際意義上的生物學(xué)傳播媒介尚待后續(xù)研究證實(shí)。

本研究通過對新疆邊境地區(qū)蜱中攜帶梨形蟲的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蜱攜帶梨形蟲的情況在當(dāng)?shù)睾芷毡?，特征明顯，攜帶率較高，且存在同時攜帶2種梨形蟲的現(xiàn)象。因環(huán)境或者人為因素造成的蜱種群的改變，可能會引發(fā)新病原的流行。新疆邊境廣大區(qū)域作為我國重要的畜牧業(yè)發(fā)展基地，因其氣候的多樣性及地理位置的特殊性，致使其蜱傳病原具有多樣性的特點(diǎn)。本研究結(jié)果為新疆邊境地區(qū)蜱傳梨形蟲的進(jìn)一步防控以及相關(guān)措施的制定提供了依據(jù)。