電針“委中”穴調(diào)節(jié)PGC-1α及相關(guān)影響因子對腰多裂肌損傷大鼠線粒體功能的影響

李霞 呂巧巧 徐菁 陳莉 田圓 張莉 劉通

腰多裂肌是從腰背部一直跨越至骶部的肌肉，其在維持腰椎穩(wěn)定中提供70%力量[1]，也是腰椎術(shù)后疼痛綜合征發(fā)病的重要原因之一[2-3]。因此，恢復腰多裂肌結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。腰多裂肌屬于骨骼肌，骨骼肌損傷修復的機制與線粒體功能的變化緊密相關(guān)。線粒體功能正常一方面可減少活性氧(reactive oxygen species,ROS)等氧化應(yīng)激對骨骼肌的傷害[4]；另一方面,促進肌衛(wèi)星細胞成肌分化，幫助骨骼肌再生[5]。過氧化物酶體增殖物活化受體γ共刺激因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α,PGC-1α)主要調(diào)節(jié)線粒體生物合成和抗氧化活性，在線粒體有氧磷酸化過程中發(fā)揮重要作用[6]。大量研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α受Ca2+信號通路調(diào)控[7]。鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(Ca2+/calmodulin dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)可被Ca2+和鈣調(diào)蛋白激活，導致自身磷酸化，磷酸化CaMKⅡ可活化PGC-1α并促進其表達，提高線粒體生物發(fā)生水平[8]。不僅如此，激活的CaMKⅡ還可直接活化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)，CREB磷酸化后可啟動PGC-1α基因表達，上調(diào)PGC-1α蛋白水平[9]。因此，鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶、CREB與PGC-1α對線粒體功能的影響具有重要意義，其可能是促進損傷骨骼肌線粒體功能恢復的機制。

課題組既往研究通過注射布比卡因制備大鼠多裂肌損傷模型，以電針“委中”為干預(yù)手段，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)肌漿網(wǎng)腫脹，線粒體大小不一、結(jié)構(gòu)異常，而針刺能夠改善這一現(xiàn)象并促進多裂肌的損傷修復[10]。本研究擬通過多時間點觀察，電針“委中”是否通過調(diào)節(jié)PGC-1α及相關(guān)影響因子的表達，減少線粒體功能損害，促進骨骼肌的損傷修復，從而闡釋電針修復骨骼肌損傷的部分機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量200～250 g，由北京斯貝福實驗動物中心提供[許可證號：SYXK(京)2019～0010]。在北京中醫(yī)藥大學動物房(清潔級)喂養(yǎng)，自然照明，自由攝食、飲水。整個實驗過程中對動物的各種處理均遵照中華人民共和國科技部2006年頒布的有關(guān)動物的使用及倫理學規(guī)定。

1.2 實驗分組

將動物隨機分為正常組、模型組、電針組，每組24只。每組再根據(jù)干預(yù)天數(shù)隨機分為1天、2天、3天和7天，4個亞組。其中左側(cè)組織置于多聚甲醛浸泡，用于蘇木精—伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)，右側(cè)組織迅速置于液氮中，進蛋白免疫印跡(Western blot，WB)、聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)生化法檢測。

1.3 主要儀器和試劑

HANS-100 A電針儀，南京濟生醫(yī)療科技有限公司；倒置顯微鏡及成像系統(tǒng)，日本尼康；全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)，美國Bio-Rad；酶標儀，M2型，芬蘭Labsystems Multiskan M2；布比卡因鹽酸鹽，美國Sigma；HE染色試劑盒(G1120，北京索萊寶生物技術(shù)有限公司)；TOMM20抗體(11802-1-AP，proteintech)；鈣離子測試盒(C004-2-1，南京建成生物工程研究所)；SOD測試盒(A001-3，南京建成生物工程研究所)；超微量總ATP酶測試盒(A070-1-2，南京建成生物工程研究所)；RNA提取試劑盒(R4115，Magen)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(K1622，Thermo)；熒光染料(A25472，Thermo)。

1.4 大鼠腰多裂肌損傷模型的制備

大鼠稱重后用20%烏拉坦(0.5 mL/100 g)腹腔注射麻醉。腰背部備皮，操作過程保持無菌。在雙側(cè)脊椎L4、L5水平的多裂肌注射布比卡因溶液(100 μL，0.5%)，使用一次性4號針頭注射器抽取布比卡因溶液，針頭緊貼棘突旁進入肌肉，直到接觸關(guān)節(jié)突和乳突所在的骨面回抽套管1 mm，無血，表明針頭已到達多裂肌后開始注射，注射時間不得小于3秒，以利于藥物的吸收。共有四個注射點(L4、L5水平旁邊各兩點)，共計400 μL(100 μL×4)。單次注射造模完成。通過HE染色進行模型評價，以鏡下見炎性細胞浸潤，肌肉組織間隙增大，肌纖維斷裂為造模成功。

1.5 電針治療方法

將大鼠固定在特制的固定器上，暴露后肢。采用華佗牌0.30 mm×13 mm一次性針灸針，針刺后連接韓式電針儀HANS-100 A，2/15 Hz的疏密波，電流強度2 mA，持續(xù)30分鐘，1次/天?！拔小毖ǘㄎ粎⒄铡秾嶒炨樉膶W》常用動物針灸穴位及圖譜，定位于膝關(guān)節(jié)正后方凹陷中。模型組同時也在固定器中固定，但不做針刺干預(yù)。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 HE染色 左側(cè)多裂肌4%多聚甲醛固定24小時，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度5 μm，置于37℃烘箱一夜，將切片置于二甲苯脫蠟2次，各5分鐘；梯度酒精(100%、95%、80%、70%)各2分鐘，蒸餾水2分鐘，蘇木素10分鐘，自來水沖洗1分鐘，分化液10秒，自來水浸泡15分鐘，伊紅50秒，自來水沖洗1分鐘，梯度脫水(95%、95%、100%、100%)各2秒，二甲苯透明2次各1分鐘，中性樹脂封片。在顯微鏡下進行觀察拍照。

1.6.2 Western blot進行TOMM20檢測 從-80℃冰箱取出凍存組織，稱取適量的肌肉，按照1 mg組織加入6 μL RIPA裂解液，在研磨機上進行充分研磨，裂解完成后離心，收集上清，通過BCA試劑盒進行蛋白定量，剩余上清加入5× loading buffer，95℃沸水煮5分鐘后，置于-20℃冰箱，用于后續(xù)上樣。制備5%濃縮膠和10%分離膠，每孔上樣5 μL，濃縮膠60V 15分鐘，分離膠80V 90分鐘。跑膠完成后以400 mA進行電轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用10%的牛奶封閉2小時，敷一抗，放置-4℃冰箱過夜。室溫回溫10分鐘后，TBST洗膜3遍，二抗室溫孵育2小時，TBST洗膜3遍，在全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)滴加超敏ECL曝光。最終通過Image-lab進行條帶分析。

1.6.3 PCR運用PCR檢測PGC-1α mRNA、CaMKⅡ mRNA和CREB mRNA，稱取20 mg新鮮組織，按照制造商的說明用RNA提取試劑盒提取RNA，并通過核酸紫外光譜法測定RNA濃度。根據(jù)試劑盒制造商的說明，在20 μL系統(tǒng)中將RNA反向轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物序列及長度見表1。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

1.6.4 生化法 稱取組織，按重量(g)：體積(mL)=1∶9的比例，加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿，3500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上清液進行待測。按照Ca2+、SOD、ATP酶試劑盒說明書進行檢測。為了消除樣品制備時由于蛋白量的差異而造成的誤差，用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定試劑盒測定樣品種的蛋白濃度，然后把濃度換算成nmol/mg蛋白的形式。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察形態(tài)學變化

通過HE染色觀察1天、2天、3天、7天,正常組、模型組和電針組的形態(tài)學變化。發(fā)現(xiàn)正常組肌纖維排列緊密整齊，細胞核均勻排布且靠近肌膜，未見炎性細胞浸潤。干預(yù)1 天后，模型組肌纖維間隙增大，間隙中分布炎性細胞浸潤，肌纖維開始壞死斷裂；電針組較模型組肌間隙縮短，炎性細胞浸潤較少。干預(yù)2天后，模型組肌纖維大片壞死、斷裂，肌細胞間隙增寬，大量炎性細胞浸潤；電針組肌間隙內(nèi)炎性細胞浸潤較模型組少。干預(yù)3天，模型組與電針委中組仍可見較多新生的中央核纖維生成，但模型組仍可見較多炎性細胞浸潤，而電針委中組的炎性細胞較少。干預(yù)7天，模型組仍可見炎性細胞與大量新生肌纖維，肌纖維細胞核位于中央，肌間隙變小，而電針委中組較多的新生肌纖維的細胞核已經(jīng)逐漸遷移至細胞邊緣，肌間隙縮小，炎性細胞浸潤少。見圖1。

注：A 正常組；B-E 模型組亞組：1天、2天、3天、7天；F-I 電針組亞組：1天、2天、3天、7天。

2.2 多裂肌Ca2+、CaMKⅡ mRNA、CREB mRNA表達含量

為評價電針后多裂肌損傷后Ca2+的含量的變化，課題組進行了多時間點多裂肌Ca2+含量檢測。與同一時間點正常組相比，模型組2天、3天亞組Ca2+含量升高(P均<0.05)；與同一時間點模型組相比，電針組2天、3天亞組Ca2+含量降低(P<0.01，P<0.05)；同一時間點，模型組和電針組1天、7天亞組均高于正常組(P<0.01，P<0.05)。與同一時間點模型組相比，電針組1天、7天亞組無顯著差異。見表2。

表2 不同時間點各組大鼠多裂肌Ca2+含量的變化比較

為評價電針對多裂肌損傷后CaMKⅡ mRNA表達的變化，課題組進行了各時間點多裂肌CaMKⅡ mRNA含量的檢測。與同一時間點正常組比較，模型組和電針組2天、3天、7天亞組CaMKⅡ mRNA表達高于正常組(P<0.05)；與同一時間點模型組比較，電針組2天、3天、7天亞組含量明顯低于模型組(P<0.01)。1天時，三組無明顯差異(P>0.05)。見表3。

表3 不同時間點各組大鼠多裂肌CaMKⅡ mRNA表達含量的變化比較

為評價電針對多裂肌損傷后CREB mRNA表達的變化，同樣進行了各時間點多裂肌CREB mRNA含量的檢測。與同一時間點正常組比較，模型組和電針組1天、2天、3天、7天亞組均高于正常組(P<0.01)；與同一時間點模型組比較，電針組2天、3天、7天亞組均高于模型組(P<0.01)。1天時則無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表4。

表4 不同時間點各組大鼠多裂肌CREB mRNA表達含量的變化比較

2.3 PGC-1αmRNA表達含量

為評價電針對多裂肌損傷后PGC-1α mRNA含量表達的變化，進行了各時間點PGC-1α mRNA含量的檢測。與同一時間點正常組比較，模型組和電針組2天、3天、7天亞組均高于正常組(P<0.01)；與同一時間點的模型組相比，電針組2天、3天亞組含量明顯低于模型組(P<0.05)，7天時，電針組和模型組比較無差異(P>0.05)，1天時，三組含量表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表5。

表5 不同時間點各組大鼠多裂肌PGC-1α mRNA表達含量變化比較

2.4 線粒體功能指標TOMM20、SOD與ATP酶表達情況

為檢測多裂肌損傷后線粒體功能我們進行了TOMM20含量的檢測。與同一時間點正常組比較，1天、2天、3天、7天時電針組與模型組均低于正常組(P<0.01)；與同一時間點模型組比較，2天時電針組高于模型組(P<0.05)；1天、3天、7天時電針組與模型組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見圖2、表6。

注：N 正常組；M模型組；D 電針組。

表6 不同時間點各組大鼠多裂肌TOMM20蛋白含量的變化比較

為檢測多裂肌損傷后線粒體功能進行了SOD含量的檢測。發(fā)現(xiàn)與正常組、模型組和電針組在1天、7天時SOD含量表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；2天時模型組含量明顯低于正常組，但是電針組明顯高于正常組(P<0.05)；與同一時間點模型組相比，電針組含量明顯高于模型組(P<0.01)。3天時模型組明顯低于正常組(P<0.05)，電針組與正常組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。與同一時間點模型組相比，電針組明顯高于模型組(P<0.01)。見表7。

表7 不同時間點各組大鼠多裂肌內(nèi)SOD含量表達的變化比較

為檢測多裂肌損傷后線粒體功能進行了ATP酶含量的檢測。與同一時間點正常組比較，1天、2天、3天時模型組低于正常組(P<0.01)，但7天時無顯著差異(P>0.05)；2天、3天時電針組低于正常組(P<0.05，P<0.01)，1天、7天時無顯著差異(P>0.05)。與同一時間點模型組相比，1天、3天時電針組含量明顯高于模型組(P<0.05)，2天、7天時無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表8。

表8 不同時間點各組大鼠多裂肌ATP酶含量的變化比較

3 討論

“腰背委中求”針刺委中治療腰背痛已廣泛在臨床應(yīng)用[11]。Dar等[12]人研究發(fā)現(xiàn)針刺可顯著改善腰多裂肌的功能，有課題組前期運用布比卡因注射進行多裂肌損傷大鼠模型，以電針“委中”為干預(yù)手段，通過1天、3天、7天多時間點進行多裂肌損傷大鼠的觀察，發(fā)現(xiàn)多裂肌的損傷修復存在時間關(guān)聯(lián)[13]，并且發(fā)現(xiàn)針刺可以增加肌源性轉(zhuǎn)錄因子(paired box7，Pax-7)、成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen，MyoD)和磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，P-AKT)蛋白表達的影響促進肌衛(wèi)星細胞的增殖，且有促進成肌分化的趨勢[14]。線粒體作為細胞的能量提供者,與肌肉能量代謝關(guān)系緊密,線粒體功能正常則促進衛(wèi)星細胞成肌分化[5]，而線粒體異常將抑制成肌分化。因此，促進線粒體功能的恢復，是促進成肌分化，幫助骨骼肌損傷修復的第一步。文獻研究顯示骨骼肌損傷2天時，線粒體功能影響最嚴重，這與先前的研究存在關(guān)聯(lián)。因此，在本研究中，課題組通過布比卡因注射液誘導的大鼠多裂肌損傷模型，設(shè)置1天、2天、3天、7天的四個時間點進行觀察，著力于研究對腰多裂肌損傷大鼠線粒體功能改變的相關(guān)機制，探討電針的起效的具體機制。

HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組肌纖維破壞，肌間隙增寬，炎性細胞浸潤提示造模成功。干預(yù)后電針加速了新生肌纖維的融合，減少炎性細胞的浸潤，幫助多裂肌的恢復。PGC-1α是調(diào)節(jié)線粒體生物合成的關(guān)鍵性信號分子,可以通過活化線粒體功能、提高骨骼肌氧化代謝能力[15]。當骨骼肌受到缺血、缺氧、低溫、收縮及運動等刺激下, 可導致其表達增加, 進而啟動線粒體DNA復制和轉(zhuǎn)錄而誘導線粒體生物合成[16]。因此，通過PCR進行PGC-1α mRNA表達變化的檢測，發(fā)現(xiàn)造模后電針組與模型組損傷多裂肌內(nèi)PGC-1α均較正常組增加，并且在模型組3天含量表達最多，而電針組則在2天含量表達最多，并且電針組的最高表達量明顯低于模型組。張靜等[17]發(fā)現(xiàn)PGC-1α mRNA的增加，可以顯著提高SOD與ATP酶活性，以此幫助細胞改善線粒體能量代謝和減輕氧化應(yīng)激。TOMM20已被證實是線粒體膜復合物易位酶的一個重要亞基，負責識別線粒體蛋白并將其從細胞溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體中[17]，降低提示線粒體丟失，可以反映線粒體的相對數(shù)量[18]。為進一步了解PGC-1α含量的增加對線粒體功能的影響，課題組通過檢測TOMM20、ATP酶含量以及SOD的含量變化。結(jié)果顯示，在造模后TOMM20、ATP酶、SOD的含量均減少，與同一時間點比較，電針能提高線粒體功能。值得注意的是模型組3天 PGC-1α含量表達最多，但線粒體功能反而受到抑制[19]。似乎PGC-1α含量的在一定范圍內(nèi)的增加會增加線粒體功能，但是PGC-1α的過表達會抑制線粒體功能。劉長華[20]研究認為，適當?shù)腜GC-1α表達增加可以改善心臟收縮功能、促進心肌能量代謝、改善心力衰竭預(yù)后，但是在PGC-1α超表達的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)卻發(fā)現(xiàn)該類動物心肌細胞過度肥大、線粒體過度增殖、三羧酸循環(huán)相關(guān)的酶系大量表達，從而引起心臟過度的肥厚及擴張。研究發(fā)現(xiàn)，成年小鼠PGC-1α過表達會造成線粒體生物合成過度激活，線粒體結(jié)構(gòu)排列紊亂和心肌病的發(fā)生[20]。因此，應(yīng)抑制PGC-1α表達的過度激活，而PGC-1α的適當增加會促進線粒體功能。本研究電針似乎通過減輕了PGC-1α的過度的激活，促進線粒體功能的恢復。

CaMKⅡ的磷酸化對PGC-1α的激活有至關(guān)重要的影響。當骨骼肌損傷，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激釋放大量的Ca2+，細胞內(nèi)鈣離子濃度突然升高，CaMKⅡ會發(fā)生快速磷酸化作用，此時CaMKⅡ被激活, 這種激活方式也會使CaMKⅡ產(chǎn)生最大活性[21]。激活的CaMKⅡ可直接活化CREB, CREB磷酸化后可與PGC-1α mRNA上游啟動子區(qū)中的CRE序列結(jié)合，從而啟動PGC-1α基因表達，上調(diào)PGC-1α蛋白水平[7]。CREB對PGC-1α調(diào)控障礙是導致線粒體損傷的重要病理事件。LIU等[22]發(fā)現(xiàn)布比卡因誘導的SH-SY5Y細胞氧化損傷中CREB磷酸化升高，用siCaMK2α或KN93抑制CaMKⅡα活性可降低CREB磷酸化。此外，Wrighet等[23]發(fā)現(xiàn)咖啡因激活CaMK后，PGC-1α mRNA表達顯著升高，且CaMK抑制劑KN93抑制了這種增加，提示CaMK同樣參與調(diào)控PGC-1α mRNA的表達。因此，CaMKⅡ直接或間接的影響PGC-1α的表達。課題組檢測各時間點多裂肌內(nèi)的Ca2+、CaMKⅡ mRNA和CREB mRNA，發(fā)現(xiàn)造模后模型組Ca2+、CaMKⅡ mRNA和CREB mRNA在3天達到表達高峰，而電針組Ca2+、CaMKⅡ mRNA的表達在2天已經(jīng)達到高峰，CREB mRNA在3天達到表達高峰。值得注意的是電針組Ca2+、CaMKⅡ mRNA和CREB mRNA表達最高量明顯低于模型組的最高表達量。這與PGC-1α變化趨勢一致。因此，課題組大膽推測，由于造模后損傷多裂肌Ca2+、CaMKⅡ mRNA和CREB mRNA的過度表達，導致PGC-1α的過度激活，抑制了線粒體功能，電針通過抑制降低Ca2+、CaMKⅡ mRNA和CREB mRNA的表達，減輕對PGC-1α的過度激活，保護線粒體功能，進而促進骨骼肌的損傷修復。

綜上，課題組通過復制腰多裂肌損傷模型，設(shè)置1天、2天、3天、7天四個時間點，檢測PGC-1α以及PGC-1α相關(guān)因子，評估電針對損傷多裂肌線粒體功能的影響，發(fā)現(xiàn)電針可以減輕PGC-1α過度激活。較模型組而言，電針似乎加快了線粒體功能的恢復進程，促進骨骼肌快速修復。