阿爾茨海默病患者載脂蛋白E 3種分型方法的比較*

王 琪，李 穎，秦 偉，魏一平，曹淑曼，賈建平

首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)疾病高創(chuàng)中心，北京 100051

阿爾茨海默病(AD)是一種遺傳度很高的疾病，而載脂蛋白E(APOE)是AD最為明確的風(fēng)險(xiǎn)基因[1-2]。APOE有3種主要亞型，分別為APOEε2、ε3 和ε4。這3種亞型由APOE基因兩個(gè)鄰近位點(diǎn)rs429358 (C > T)和rs7412 (C > T)的共同多態(tài)性導(dǎo)致，對(duì)AD的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生不同影響。APOEε3是人群中最常見(jiàn)的類型，APOEε4是AD的主要遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素，而APOEε2是AD發(fā)病的保護(hù)因素[3-5]。因此，APOE分型成為AD研究中不可或缺的重要手段。目前受到普遍認(rèn)可并被廣泛使用的APOE分型方法主要包括Sanger測(cè)序法、Taqman探針?lè)ǖ龋謩e存在通量低、時(shí)效差或價(jià)格高昂等缺點(diǎn)[6]。因此，建立高效、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)的中、高通量APOE分型方法具有極其重要的意義。競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(KASP)法和單堿基末端延伸(SNaPshot)法都是得到認(rèn)可的中、高通量單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測(cè)方法，尤其是近年來(lái)興起的KASP法，由于通量高、成本低、更具SNP位點(diǎn)適用性，已經(jīng)成為國(guó)際上SNP分析的主流方法之一，但初期主要應(yīng)用于植物育種[7-8]，在人類基因分型中尚鮮見(jiàn)應(yīng)用。本研究旨在建立基于KASP、SNaPshot法，更為高效、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)的中、高通量APOE分型方法，為AD患者APOE分型研究提供更多方法選擇。

1 材料與方法

1.1材料來(lái)源 48份已確定APOE分型的DNA樣本來(lái)源于2017-2019年于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院進(jìn)行APOE分型檢測(cè)的AD或輕度認(rèn)知障礙(MCI)患者，該部分樣本均采用普通PCR聯(lián)合Sanger測(cè)序法確定APOE分型。為保證新建立檢測(cè)方法的穩(wěn)定性和可靠性，選取的48份樣本覆蓋6種常見(jiàn)的APOE分型，包括2/2型5份，2/3型6份，2/4型6份，3/3型11份，3/4型12份，4/4型8份。進(jìn)一步收集2019年10-12月于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院就診的AD、MCI患者的全血樣本共107份，對(duì)所建立的方法進(jìn)行擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證。本研究獲得首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)為臨研審[2017]004號(hào)。

1.2方法

1.2.1外周血白細(xì)胞基因組DNA提取 所有全血樣本均采用鹽析法提取基因組DNA，并經(jīng)紫外分光光度儀定量。

1.2.2基于KASP法的APOE分型檢測(cè) 根據(jù)APOE變異位點(diǎn)序列信息，使用Primer5軟件設(shè)計(jì)能夠特異性識(shí)別APOE基因分型的2個(gè)關(guān)鍵SNP位點(diǎn)rs429358和rs7412的引物，見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增目的片段，10 μL體系如下：HiGeno 2X Probe mix(北京嘉程基因技術(shù)有限公司)5 μL，Primer mix 1 μL(北京睿博興科科技有限公司)，DNA 1 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，61 ℃→55 ℃(-0.6 ℃/cycles)45 s，10個(gè)循環(huán)；95 ℃ 20 s，55 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)。ABI7500(ABI)上機(jī)采集FAM和VIC熒光信號(hào)，將檢測(cè)得到的原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入到TaqMan Genotyper Software Version 1.3分析軟件中進(jìn)行分析。上述引物合成及產(chǎn)物檢測(cè)由北京睿博興科科技有限公司完成。

表1 基于KASP法的APOE分型引物序列

1.2.3基于SNaPshot法的APOE分型檢測(cè) 根據(jù)APOE變異位點(diǎn)序列信息，使用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物。預(yù)擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s×35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃ ∞。30 μL預(yù)擴(kuò)增體系包括Ruibio 2×Taq 15 μL，F(xiàn)orward primer(10 μmol/L) 0.5 μL，Reverse primer(10 μmol/L) 0.5 μL，DNA 1 μL，ddH2O 13 μL，預(yù)擴(kuò)增引物見(jiàn)表2。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后延伸。采用SNaPshot試劑盒(ABI)對(duì)樣本延伸，5 μL延伸體系包括Ready Reaction Mix 0.4 μL，5×seq Buffer，純化后PCR產(chǎn)物2.5 μL，檢測(cè)引物(10 μmol/L)各0.1 μL，ddH2O 0.9 μL，檢測(cè)引物見(jiàn)表2。延伸程序?yàn)?6 ℃ 2 min；96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；14 ℃ ∞。Applied Biosystems 3730-XL測(cè)序儀(ABI)上機(jī)檢測(cè)，將檢測(cè)得到的原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入到分析軟件中進(jìn)行分析。上述引物合成及產(chǎn)物檢測(cè)由北京睿博興科科技有限公司完成。

表2 基于SNaPshot法的APOE分型引物序列

1.2.4普通PCR結(jié)合Sanger測(cè)序法進(jìn)行APOE分型驗(yàn)證 使用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物為5′-AGA CGC GGG CAC GGC TGT CCA AGG A-3′，下游引物為5′-CCC TCG CGG GCC CCG GCC TGG TAC AC-3′。反應(yīng)體系均為50 μL，含100 ng DNA模板，上下游引物濃度為0.5 μmol/L，dNTP(TAKARA)終濃度為200 μmol/L，10×PCR緩沖液(TAKARA)5 μL，rTaq酶(TAKARA)終濃度為50 000 U/L，DMSO 5 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，主循環(huán)30次(變性95 ℃ 30 s、退火60 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 30 s)，72 ℃再延伸7 min。反應(yīng)產(chǎn)物Applied Biosystems 3730-XL測(cè)序儀(ABI)進(jìn)行測(cè)序，Chromas2.23軟件分析測(cè)序結(jié)果。上述引物合成及產(chǎn)物檢測(cè)由北京睿博興科科技有限公司完成。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用特異度和靈敏度評(píng)價(jià)KASP、SNaPshot法判斷APOE分型的準(zhǔn)確性，采用χ2檢驗(yàn)檢測(cè)3種APOE分型方法有無(wú)差異，采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1基于KASP法的APOE分型 KASP法通過(guò)對(duì)產(chǎn)物中熒光信號(hào)的識(shí)別，可以很好地進(jìn)行APOE分型，見(jiàn)圖1。圖1A是位點(diǎn)rs429358的分型結(jié)果，左上藍(lán)色圓形聚集點(diǎn)為FAM熒光信號(hào)，識(shí)別的是T堿基；右下紅色圓形聚集點(diǎn)為VIC熒光信號(hào)，識(shí)別的是C堿基；圖1B是位點(diǎn)rs7412的分型結(jié)果，F(xiàn)AM熒光信號(hào)識(shí)別C堿基，VIC熒光信號(hào)識(shí)別的是T堿基；兩圖中間綠色圓形聚集點(diǎn)為同時(shí)有FAM和VIC熒光信號(hào)，同時(shí)識(shí)別到T和C堿基，這些樣本在該位點(diǎn)是雜合型；靠近坐標(biāo)軸原點(diǎn)的淺藍(lán)色正方形點(diǎn)是空白對(duì)照，無(wú)熒光信號(hào)，代表未識(shí)別到T或C堿基。對(duì)已確定APOE分型的全血核酸樣本48份進(jìn)行檢測(cè)及打亂順序重復(fù)檢測(cè)，其結(jié)果與樣本已知分型一致，其靈敏度和特異度均為100%。進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量對(duì)107例AD、MCI患者樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢出2/3型4份，2/4型1份，3/3型59份，3/4型40份，4/4型3份。

注：A為位點(diǎn)rs429358；B為位點(diǎn)rs7412；①為FAM熒光信號(hào)，②為VIC熒光信號(hào)，③為同時(shí)有FAM和VIC熒光信號(hào)，④為無(wú)熒光信號(hào)。

2.2基于SNaPshot法的APOE分型 SNaPshot法根據(jù)峰的移動(dòng)位置確定產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的SNP位點(diǎn)，根據(jù)峰的顏色可得知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的APOE基因型，見(jiàn)圖2。

注：A～F依次為2/2、3/2、3/3、4/2、4/3、4/4分型測(cè)序圖。

圖2為APOE基因6種分型的測(cè)序圖，其中第1個(gè)峰為rs429358位點(diǎn)，第2個(gè)峰為rs7412位點(diǎn)。對(duì)已確定APOE分型的全血核酸樣本48份進(jìn)行檢測(cè)及打亂順序重復(fù)檢測(cè)，其結(jié)果與樣本已知分型一致，其靈敏度和特異度均為100%。對(duì)107例AD、MCI患者進(jìn)行擴(kuò)大樣本檢測(cè)，與KASP法結(jié)果一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.00)。

2.3Sanger測(cè)序法進(jìn)行APOE分型驗(yàn)證 將上述樣本用普通PCR擴(kuò)增并Sanger測(cè)序后分析，結(jié)合每個(gè)樣本2個(gè)SNP位點(diǎn)上的堿基情況得出的APOE分型數(shù)據(jù)與KASP法分型結(jié)果及SnaPshot法分型結(jié)果完全一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.00)。見(jiàn)圖3。

圖3 Sanger測(cè)序法APOE分型測(cè)序圖

3 討 論

1973年HAVEL等[9]發(fā)現(xiàn)了一種“富含精氨酸”的蛋白質(zhì)，1975年UTERMANN等[10]將這種蛋白質(zhì)被命名為載脂蛋E，1982年ZANNIS等[11]明確了它的3種主要亞型，并命名為APOEε2、ε3 和ε4。這3種亞型在112位和158位氨基酸的變化，驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)中的結(jié)構(gòu)域相互作用，影響其生物學(xué)功能。隨著APOEε4等位基因的數(shù)量增加，AD的患病風(fēng)險(xiǎn)增加，發(fā)病年齡減小；隨著APOEε2等位基因數(shù)量的增加，AD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低，發(fā)病年齡增大[3-5]。因此，APOE分型在AD的基礎(chǔ)或臨床研究領(lǐng)域都成為不可或缺的重要手段。

近年來(lái)，隨著各種新技術(shù)的涌現(xiàn)，APOE分型方法有了越來(lái)越多的選擇，較為經(jīng)典的有聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段多態(tài)性(PCR-RFLP)法、Sanger測(cè)序法和TaqMan探針?lè)ǖ萚6]。PCR-RFLP法因所需材料設(shè)備簡(jiǎn)單，在早期得到廣泛應(yīng)用，但步驟煩瑣且需對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行第2次操作，現(xiàn)應(yīng)用減少；Sanger測(cè)序也稱一代測(cè)序，常作為基因序列檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”和APOE分型的驗(yàn)證方法，但通量低，成本略高，時(shí)效性較差；TaqMan探針?lè)ㄐ矢?，耗時(shí)短，但由于需合成特異性探針引物，成本高昂。因此，本研究通過(guò)建立基于KASP法和SNaPshot法的APOE分型方法，希望能在滿足大樣本、中高通量APOE分型需求的同時(shí)降低檢測(cè)成本。

KASP法是近年來(lái)新興的一種高通量SNP檢測(cè)技術(shù)，是在等位基因特異性PCR基礎(chǔ)上，再加入通用熒光探針，通過(guò)設(shè)計(jì)2個(gè)SNP PCR引物，其3′端各對(duì)應(yīng)一個(gè)SNP的等位基因，5′端是一段特定的序列，與通用熒光探針序列一致，然后通過(guò)直接識(shí)別熒光信號(hào)來(lái)對(duì)SNP進(jìn)行雙等位基因判斷。該技術(shù)初期在植物育種方面應(yīng)用較多，隨著技術(shù)的發(fā)展成熟，現(xiàn)已被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[12-13]。它與TaqMan探針?lè)ㄔ眍愃疲恍枰總€(gè)SNP位點(diǎn)都合成特異熒光引物，所有位點(diǎn)檢測(cè)最終都可以使用通用熒光引物進(jìn)行擴(kuò)增，大大降低了成本。KASP法對(duì)DNA樣本的濃度和純度要求不高，且每天可檢測(cè)SNP及樣本數(shù)均可達(dá)數(shù)萬(wàn)以上，具有精度高、靈敏度高、靈活性強(qiáng)、轉(zhuǎn)換速度快、SNP位點(diǎn)適用性更好的特點(diǎn)，已經(jīng)成為國(guó)際上SNP分析的主流方法之一。與APOE分型相關(guān)的SNP位點(diǎn)只有2個(gè)，因此，在本研究中KASP法的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在大樣本量分型檢測(cè)時(shí)的檢測(cè)效率和單位成本上。當(dāng)一次需要檢測(cè)上千甚至上萬(wàn)的樣本時(shí)，KASP法可作為優(yōu)先選擇，比本研究中涉及的其他兩種方法更加高效和節(jié)約成本。但目前利用KASP法進(jìn)行APOE分型檢測(cè)的研究尚不多見(jiàn)。

SNaPshot法是基于熒光標(biāo)記單堿基延伸原理的分型技術(shù)，也稱小測(cè)序，是中等通量SNP分型較為適用的一種方法[14-15]。它不受SNP位點(diǎn)多態(tài)特性限制，雜合、插入或缺失多態(tài)都可一個(gè)體系檢測(cè)，一個(gè)反應(yīng)可檢測(cè)1～10個(gè)SNP位點(diǎn)，因此適用于檢測(cè)兩個(gè)SNP位點(diǎn)的APOE分型。該方法適合樣本數(shù)目在幾十到1 000的項(xiàng)目，相較于Sanger測(cè)序法可以極大地提高效率、降低成本，并且可以直接得到位點(diǎn)的堿基組成，結(jié)果更加直觀，具有一定優(yōu)勢(shì)。

使用本研究建立的APOE分型的KASP法及SNaPshot法對(duì)已知分型的48份樣本進(jìn)行檢測(cè)及重復(fù)試驗(yàn)，其結(jié)果完全相符。進(jìn)一步對(duì)新收集的107份樣本采用KASP法、SNaPshot法、Sanger測(cè)序法檢測(cè)APOE分型，3種方法所得結(jié)果完全一致，共檢出2/3型4份，2/4型1份，3/3型59份，3/4型40份，4/4型3份，其比例亦與中國(guó)大陸散發(fā)AD患者APOE分型比例相符[16]。因此，本研究所建立的方法，不僅被基因序列檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”Sanger測(cè)序法驗(yàn)證，同時(shí)在KASP法和SNaPshot法結(jié)果之間也得到互相印證，再通過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)、分型比例比較等手段，進(jìn)一步證實(shí)了其準(zhǔn)確性、可靠性和可重復(fù)性。同時(shí)，本研究所使用的作為驗(yàn)證“金標(biāo)準(zhǔn)”的APOE分型的Sanger測(cè)序法，巧妙地將兩個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)在一個(gè)測(cè)序反應(yīng)內(nèi)，這也較常規(guī)針對(duì)兩個(gè)位點(diǎn)分別擴(kuò)增的方法簡(jiǎn)化了步驟，且節(jié)約了成本，在樣本量不大，時(shí)效性要求不太高，或作為其他分型手段的驗(yàn)證時(shí)均可優(yōu)先選擇應(yīng)用。

綜上所述，本研究采用KASP法及SNaPshot法進(jìn)行APOE分型檢測(cè)，靈敏度和特異度高，與Sanger測(cè)序法相比，結(jié)果更直觀和易判讀，尤其在檢測(cè)中、高通量樣本時(shí)效率更高，成本更低，其中近年來(lái)新興的KASP法更適合高通量檢測(cè)，SNaPshot法更適合中等通量檢測(cè)，這為不同的研究需求提供了更優(yōu)方法選擇。