雜交構(gòu)樹青貯對(duì)務(wù)川白山羊瘤胃微生物區(qū)系的影響

李世歌 ， 陳光吉 ，2， 李小冬 ， 鄒曉敏 ， 何潤(rùn)霞 ， 張 坤 ，尚以順 ， 張 蓉 ， 熊先勤 ，2 ， 王子苑 ， 冉 賢

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，貴州貴陽(yáng) 550006；2.貴州陽(yáng)光草業(yè)科技有限責(zé)任公司，貴州獨(dú)山 558200；3.務(wù)川仡佬族苗族自治縣畜牧水產(chǎn)服務(wù)中心，貴州務(wù)川564300；4.貴州務(wù)川科華生物科技有限公司，貴州務(wù)川564300）

近年來(lái)，我國(guó)居民對(duì)畜禽產(chǎn)品的消費(fèi)量需求增長(zhǎng)強(qiáng)勁， 特別是牛羊肉在飲食結(jié)構(gòu)中比例增加，促進(jìn)了畜牧業(yè)，尤其是牛羊產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，加之新冠肺炎疫情和中美貿(mào)易摩擦影響，國(guó)際大宗飼草飼料價(jià)格上漲，使我國(guó)飼草和蛋白質(zhì)飼料資源缺乏問(wèn)題愈顯突出。因此，開發(fā)新型蛋白質(zhì)粗飼料資源，發(fā)展節(jié)糧型畜牧業(yè)已是迫在眉睫。 構(gòu)樹（Broussonetia papyrifera）又名楮桃，被子植物門雙子葉植物綱蕁麻目?？茦?gòu)樹族構(gòu)屬的落葉喬木。中科院通過(guò)種間雜交育種培育的雜交構(gòu)樹，具有速生、抗逆強(qiáng)、輪伐期短、高產(chǎn)的特點(diǎn)（王麗，2019），是目前在我國(guó)推廣種植較為廣泛的新品種。 雜交構(gòu)樹營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，含有豐富的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、氨基酸、維生素和微量元素，其葉片粗蛋白質(zhì)含量高達(dá)19.22%~26.10%，全樹綜合利用枝葉混合物粗蛋白質(zhì)含量為17%左右（張紅等，2020；劉祥圣等，2019；左鑫等，2018），與苜蓿干草相當(dāng)。 此外，構(gòu)樹葉中含有黃酮類化合物、生物堿、揮發(fā)油類、不飽和脂肪酸等生物活性物質(zhì)，可在動(dòng)物體中發(fā)揮抗菌、抗炎、增強(qiáng)免疫力、抗氧化等功能性作用（Dong 等，2020；Park 等，2016）?？梢?，雜交構(gòu)樹是一種極具開發(fā)價(jià)值的高蛋白質(zhì)非常規(guī)木本飼料。

瘤胃是反芻動(dòng)物特有的消化器官， 內(nèi)含大量的瘤胃微生物， 其使反芻動(dòng)物能夠高效消化利用植物性蛋白、多糖和纖維素等，為機(jī)體提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（崔浩然等，2021；楊艷等，2020）。瘤胃微生物的種類和豐度受動(dòng)物的品種、年齡、飼料、生理階段、健康狀況等多種因素影響，其中飼糧組成和結(jié)構(gòu)是瘤胃微生物最大的影響因素之一 （馬健等，2020）。董春曉等（2019）研究表明，不同粗飼料改變了湖羊的瘤胃細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)， 相比于玉米秸稈、玉米芯和葵花籽殼，油菜秸稈使瘤胃微生物的物種豐富度和多樣性更高。 李希等（2021）的研究結(jié)果顯示， 適量提高日糧中纖維水平能夠促進(jìn)羔羊瘤胃中部分纖維降解菌的增殖。 陳麗娟等（2020）在不同比例的苜蓿和構(gòu)樹為底物的瘤胃液體外發(fā)酵試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)， 高比例構(gòu)樹提高了變形桿菌門的豐度，高比例苜蓿提高了廣古菌門豐度。圣平等（2021）在日糧中添加雜交構(gòu)樹飼喂湖羊，其瘤胃中擬桿菌門的相對(duì)豐度升高， 厚壁菌門的相對(duì)豐度則降低。研究表明，瘤胃微生物的變化與瘤胃發(fā)酵和生產(chǎn)效率密切相關(guān) （Li 等，2019； 王海榮，2006；Shabat 等，2016）。然而，不同比例雜交構(gòu)樹青貯和青貯玉米的混合日糧對(duì)肉羊瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)的影響還鮮見報(bào)道。 本試驗(yàn)旨在研究雜交構(gòu)樹青貯替代不同比例的青貯玉米對(duì)務(wù)川白山羊的瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)的影響， 為雜交構(gòu)樹青貯在肉羊養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 雜交構(gòu)樹由務(wù)川縣桃符構(gòu)樹產(chǎn)業(yè)孵化園提供， 刈割高度1.5 m 左右， 留茬高度20 cm 左右，第一茬刈割，粉碎至2 ~ 3 cm，制作為裹包青貯于常溫條件下發(fā)酵60 d 后逐包取用，每包重約50 kg。 試驗(yàn)羊采購(gòu)自務(wù)川縣養(yǎng)殖企業(yè)，系貴州地方山羊品種。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取64 只4 月齡體重為（12.40±2.00）kg 的健康務(wù)川白山羊， 隨機(jī)分為 4組，每組 16 只羊（公母各半，分開飼養(yǎng)）。CS 組（對(duì)照組）不添加雜交構(gòu)樹青貯；LBP 組雜交構(gòu)樹青貯替代20%青貯玉米；MBP 組雜交構(gòu)樹青貯替代50%青貯玉米；BPS 組雜交構(gòu)樹青貯替代100%青貯玉米。各組日糧精粗比一致，雜交構(gòu)樹青貯和青貯玉米的比例為唯一變量。 日糧組成與營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)） %

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)羊采用高床羊舍舍飼，人工飼喂。試驗(yàn)前對(duì)羊舍全面清掃消毒，試驗(yàn)羊逐只稱重、驅(qū)蟲、打耳標(biāo)。 每天 8：00 和 17：00 定時(shí)飼喂，精料和粗料混合均勻后飼喂，自由飲水，每天記錄各組飼糧添加量和前一天剩料量。 預(yù)飼期15 d，試驗(yàn)期172 d。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 瘤胃液的采集與處理 正式期最后1 d 晨飼前，每組隨機(jī)選擇6 只試驗(yàn)羊（公母各3 只），用真空泵瘤胃液采集器（2XZ-1，上海凱清）經(jīng)口腔采集瘤胃液20 mL，經(jīng)4 層無(wú)菌紗布過(guò)濾后，-80 ℃冷凍保存用于瘤胃微生物區(qū)系測(cè)定。

1.4.2 務(wù)川白山羊瘤胃微生物基因組DNA 提取和PCR 擴(kuò)增 按照腸道內(nèi)容物、糞便基因組提取試劑盒說(shuō)明書對(duì)試驗(yàn)樣品進(jìn)行DNA 提取，提取的DNA 采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，使用引物 341F，5‘-CCTACGGGNGGCWGCAG-3‘，805R，5‘ -GACTACHVGGGTATCTAATCC -3‘ 對(duì)16S rDNA 可變區(qū)（V3+V4）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。 PCR 擴(kuò)增采用 25 μL 程序：Pusion Hot start flex 2X Master Mix 12.5 μL，1 μmol/L 的上、 下游引物各 2.5 μL，DNA 模板 50 ng，補(bǔ)加雙蒸水（ddH2O）至 25 μL；擴(kuò)增條件：98 ℃持續(xù) 40 s 后進(jìn)行 32 個(gè)循環(huán)， 依次為98 ℃ 30 s、98 ℃ 10 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，最后在72 ℃下延長(zhǎng)10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收，回收采用AMPure XT beads 回收試劑盒。

1.4.3 Miseq 測(cè)序 將樣品送至聯(lián)川生物技術(shù)有限公司運(yùn)用Illumina MiSeq 平臺(tái)進(jìn)行Miseq 測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用EXCEL 2010初步處理后， 并采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），Duncan’s 法進(jìn)行多重比較，以P ＜0.05 作為差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 OTU 水平分析 基于 OTU 的 Venn 圖顯示，16S rDNA 基因測(cè)序共獲得 6861 個(gè) OTUs，4組之間共有 4413 個(gè) OTUs，CS、LBP、MBP 及 BPS組特有的 OTUs 分別為 63、34、33、91（圖 1）。

圖1 基于OTU 水平的Venn 圖

2.2 Alpha 多樣性分析 由表2 可知， 按照97%的序列相似度水平， 各處理組的OTU 數(shù)目和α-多樣性指數(shù)各異。 其中BPS 組、MBP 組務(wù)川白山羊瘤胃微生物的 OTU 數(shù)量分別比 CS 組高20.99%和 13.14%（P ＜ 0.05），Chao1 指數(shù)分別比CS 組高 20.83%和 12.15%（P ＜ 0.05）；BPS 組的Observed_species 指數(shù)和Shannon 指數(shù)分別比CS組高 27.23%和 9.73%（P ＜ 0.05）， 比 LBP 組高14.17%和 8.11%（P ＜ 0.05）；其他組間差異不顯著（P ＞0.05）。 覆蓋度反映樣品的測(cè)序深度，所有樣品覆蓋度均在0.98 以上，表明本次測(cè)序結(jié)果可以反映樣本的真實(shí)情況。

表2 瘤胃液細(xì)菌OTU 數(shù)目及Alpha 多樣性指數(shù)

2.3 聚類分析 基于Unweighted UniFrac 的加權(quán)主坐標(biāo)分析，主成分1（PCo1）貢獻(xiàn)率為12.99%，主成分 2（PCo2）貢獻(xiàn)率為 10.17%，CS 組和 BPS 組山羊瘤胃微生物菌群組成差異明顯，飼喂相同日糧山羊的瘤胃微生物菌群可以很好的聚合在一起，微生物群落相似度較高（圖2）；基于OTU 分析結(jié)果，利用非加權(quán)組平均法構(gòu)建UPGMA 聚類樹， 結(jié)果顯示，LBP 組和 MBP 組細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較相似，CS 組和BPS 組細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大（圖3）。

圖2 基于非加權(quán)距離的PCoA 分析

圖3 基于非加權(quán)距離UPGMA 聚類樹分析

2.4 瘤胃細(xì)菌群落組成分析

2.4.1 雜交構(gòu)樹青貯對(duì)務(wù)川白山羊瘤胃菌群門水平結(jié)構(gòu)的影響 由表3 可知， 共檢測(cè)到20 種菌門，包括擬桿菌門、厚壁菌門、疣微菌門、變形菌門、未分類菌門、黏膠球形菌門、絲狀桿菌門、螺旋體門、暫定螺旋體門、迷蹤菌門、藍(lán)藻菌門、軟壁菌門、互養(yǎng)菌門、浮霉菌門、放線菌門、廣古菌門、SR1 門、綠彎菌門、酸桿菌門、裝甲菌門。各組山羊瘤胃細(xì)菌主要為擬桿菌門、厚壁菌門、疣微菌門和變形菌門，4 種菌門合計(jì)占總細(xì)菌的91.37% ~92.26%。 與CS 組相比，隨著雜交構(gòu)樹青貯比例的增加， 擬桿菌門的相對(duì)豐度呈先升高后降低的趨勢(shì)， 且BPS 組的擬桿菌門相對(duì)豐度分別比CS 組和 MBP 組低 15.89%和 20.17%（P ＜ 0.05），MBP組暫定螺旋體門的相對(duì)豐度分別比CS、LBP 和BPS 組低 55.95%、48.61%和 44.78%（P ＜ 0.05）；LBP 組、MBP 組和BPS 組瘤胃液中酸桿菌門的相對(duì)豐度顯著高于 CS 組（P ＜ 0.05）。 其他各組菌門的相對(duì)豐度無(wú)顯著差異（P ＞0.05）。

表3 雜交構(gòu)樹青貯對(duì)務(wù)川白山羊瘤胃細(xì)菌群落門水平相對(duì)豐度的影響 %

2.4.2 雜交構(gòu)樹青貯對(duì)務(wù)川白山羊瘤胃細(xì)菌屬水平結(jié)構(gòu)的影響 由表4 可知，4 組山羊瘤胃液菌群共包含230 個(gè)屬，其中有13 個(gè)菌屬相對(duì)比例均占總菌數(shù)的1%以上，分別為普雷沃菌屬、未分類擬桿菌屬、未分類瘤胃球菌科、位置未定的亞門5屬、未分類紫單胞菌科、未分類的擬桿菌目、理研菌屬、未分類細(xì)菌、梭菌屬、解琥珀酸菌屬、瘤胃球菌屬、克里斯滕森菌屬、未分類的毛螺菌科。 BPS組瘤胃液中的普雷沃菌屬相對(duì)豐度分別比CS 組和 MBP 組低 39.86%和 39.25%（P ＜ 0.05）；LBP、MBP 和BPS 組的未分類毛螺菌科相對(duì)豐度分別比 CS 組低 29.49%、44.70%和 38.25%（P ＜ 0.05）。

表4 雜交構(gòu)樹青貯對(duì)務(wù)川白山羊瘤胃細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度的影響 %

3 討論

作為反芻動(dòng)物的重要消化器官， 瘤胃主要依靠各類瘤胃微生物的代謝活動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)飼料的消化和營(yíng)養(yǎng)代謝。 瘤胃微生物的群落結(jié)構(gòu)受多種因素影響， 其中日糧的變化是影響瘤胃微生物區(qū)系的重要因素。 Alpha-多樣性反映微生物群落的豐富度和多樣性，Observed_species 指數(shù)和Chao1 指數(shù)反映樣本中菌群豐富度，數(shù)值越大，豐富度越高；Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)則用于估計(jì)瘤胃微生物的豐富度，Shannon 指數(shù)越大，Simpson 指數(shù)越低， 說(shuō)明微生物群落多樣性越高。 本試驗(yàn)中，MBP 組和 BPS 組的 OTU 數(shù)目、Observed_species指數(shù)和 Chao1 指數(shù)顯著高于 CS 組，BPS 組的Shannon 指數(shù)顯著高于 CS 組和 LBP 組， 而 LBP組和CS 組間的Alpha-多樣性指標(biāo)無(wú)顯著差異，表明低比例的雜交構(gòu)樹青貯對(duì)務(wù)川白山羊的瘤胃微生物菌群多樣性無(wú)顯著影響， 但隨著雜交構(gòu)樹青貯比例的提高， 瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)更高的多樣性。圣平等（ 2021）在青貯雜交構(gòu)樹替代花生秸稈飼喂湖羊的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)， 瘤胃中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性未見顯著差異， 結(jié)果與本研究不同， 這可能是基礎(chǔ)日糧組成和動(dòng)物品種不同所致，說(shuō)明雜交構(gòu)樹青貯的應(yīng)用研究尚不充分。Beta多樣性和聚類分析反映了各組樣本間的相似性，分析可知， 各個(gè)樣本大致根據(jù)試驗(yàn)處理不同而相互聚集在一起，CS 組與雜交構(gòu)樹青貯各組在主坐標(biāo)分析圖上距離較遠(yuǎn)， 說(shuō)明高比例的雜交構(gòu)樹青貯改變了瘤胃細(xì)菌多樣性。

反芻動(dòng)物瘤胃中的優(yōu)勢(shì)菌門是擬桿菌門和厚壁菌門（Malaník 等，2020；Niu 等，2016）。 本試驗(yàn)中各組的擬桿菌門為第一優(yōu)勢(shì)菌群， 厚壁菌門的總量位居第二， 兩者豐度之和占瘤胃微生物總量的80%以上，與前人研究結(jié)果一致（陳麗娟等，2020；李與琦等，2020）。 擬桿菌門主要參與蛋白質(zhì)和非纖維素植物多糖的分解（Pitta 等，2014），厚壁菌門是反芻動(dòng)物瘤胃中降解纖維素的主要微生物（Klieve 等，2016）。本研究中，隨著日糧中雜交構(gòu)樹青貯比例的提高，擬桿菌門的相對(duì)豐度隨之提高，以MBP 組最高，這是由于雜交構(gòu)樹青貯比例的提高使瘤胃發(fā)酵底物中的粗蛋白質(zhì)含量隨之增加，進(jìn)而誘導(dǎo)擬桿菌門豐度上升， 但當(dāng)粗飼料全部為雜交構(gòu)樹青貯時(shí)（BPS 組），擬桿菌門的相對(duì)豐度顯著降低，這可能是由于隨著構(gòu)樹比例提高，飼料中單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子濃度持續(xù)增加， 抗?fàn)I養(yǎng)成分過(guò)多會(huì)抑制擬桿菌門的增殖或活性 （Abdullah 等，2018）。 本研究中，雜交構(gòu)樹青貯替代基礎(chǔ)飼糧中的青貯玉米對(duì)瘤胃液中厚壁菌門的豐度無(wú)顯著影響， 說(shuō)明飼喂雜交構(gòu)樹青貯未改變瘤胃對(duì)植物纖維的降解能力，這一結(jié)果與日糧中ADF 和NDF 含量隨雜交構(gòu)樹青貯比例的增加變化幅度較小相一致。 疣微菌門的一些細(xì)菌在動(dòng)物的胃腸道消化屏障作用、代謝炎癥和免疫耐受方面起重要作用（韓偉等，2019； 李美鋒等，2017；De Vos 等，2011），其在腸道的定植可減緩脂肪沉積 （Axling 等，2012），此外， 疣微菌門的一些成員還具有多糖水解酶活性（孫佳麗等，2020）。 本研究中疣微菌門的相對(duì)豐度位居第三， 與前人多個(gè)研究結(jié)果不同 （陳鳳梅等 ，2020；Dias 等 ，2018；Chaucheyras-Durand 等 ，2014），推測(cè)其在提高務(wù)川白山羊的免疫力和減少機(jī)體脂肪沉積方面有積極影響， 但究其原因是否與飼喂雜交構(gòu)樹青貯有關(guān)尚需進(jìn)一步研究。

從屬水平上來(lái)看，普雷沃菌屬是反芻動(dòng)物瘤胃中數(shù)量最多的一類擬桿菌門普雷沃氏菌科有益微生物菌屬，主要參與蛋白質(zhì)、淀粉及木聚糖和果膠的降解（金鹿等，2021），在碳水化合物的代謝中起關(guān)鍵作用 （孫佳麗等，2020）。 Pitta 等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，普雷沃菌屬的相對(duì)豐度與日糧中NDF 水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。 本試驗(yàn)中， 日糧的NDF 水平隨雜交構(gòu)樹青貯比例增加而提高，但普雷沃式菌屬的相對(duì)豐度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，與前述擬桿菌門相對(duì)豐度的變化一致，說(shuō)明雜交構(gòu)樹青貯主要通過(guò)影響普雷沃式菌屬的數(shù)量改變擬桿菌門的相對(duì)豐度，推測(cè)普雷沃菌屬的相對(duì)豐度受NDF 水平和單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子的共同作用。未分類的毛螺菌科是瘤胃中的一類半纖維降解菌，普宣宣等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，卡拉庫(kù)爾羊瘤胃中未分類的毛螺菌科相對(duì)豐度隨日糧NFC 水平的增高呈先升高后下降的趨勢(shì)，這與本研究結(jié)果不同。本試驗(yàn)中添加雜交構(gòu)樹青貯降低了務(wù)川白山羊瘤胃未分類毛螺菌科的相對(duì)豐度，可能是由于粉碎后雜交構(gòu)樹較為粗硬的樹枝部分在采食時(shí)更容易被剩下，使肉羊?qū)嶋H攝入的半纖維素和木質(zhì)素水平較青貯玉米更低，從而誘導(dǎo)未分類的毛螺菌科數(shù)量減少，但本試驗(yàn)中日糧的NFC 水平是否與未分類毛螺菌科相對(duì)豐度的變化有關(guān)有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

高比例雜交構(gòu)樹青貯顯著提高了務(wù)川白山羊瘤胃微生物的豐富度；在門和屬兩個(gè)水平上，日糧中添加雜交構(gòu)樹青貯導(dǎo)致與蛋白質(zhì)、 淀粉和非纖維植物多糖降解有關(guān)的擬桿菌門和普雷沃菌屬有升高趨勢(shì)， 以替代50%青貯玉米時(shí)相對(duì)豐度最高， 雜交構(gòu)樹青貯替代100%青貯玉米時(shí)則抑制相關(guān)菌群的增殖； 添加雜交構(gòu)樹青貯未對(duì)纖維降解菌的數(shù)量造成不良影響。