超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定飼料中維生素D3

程傳民 ， 李 云 ， 谷 明 ， 徐定慧 ， 鄺婷婷 ，王宇萍 ， 馮 波 ， 趙立軍 ， 張 靜 ， 童 琪

（1.四川省飼料工作總站，四川成都 610041；2. 阿壩藏族羌族自治州農業(yè)農村局種子站，四川阿壩藏族羌族自治州 624009；3.四川省草原科學研究院，四川成都 611731）

維生素D3的基本功能是參與體內鈣、 磷代謝，促進腸道鈣、磷吸收，調整鈣、磷吸收比例，促進骨的鈣化和正常發(fā)育（Cashman 和Kiely，2016；Spiro 和 Buttriss，2015；Jetter 等 ，2014；Cashman等，2012；Borradake 和 Kimlin，2009）。 缺乏維生素D3，即使鈣、磷充足，也不能在骨骼中很好的沉積；維生素D3過量可產生過多癥（Martinez 等，2017；Rodeny 等 ，2017；Zhou 等 ，2016；Hines 等 ，2013；Lauridsen 等，2010），表現(xiàn)為血鈣過多，組織、器官鈣鹽沉積，骨骼易折（劉亞楠等，2020；徐宏建等，2020；Duffy 等 ，2018；Ren 等 ，2018；Rodney 等 ，2018；Duffy 等，2017）。 因此準確檢測飼料中維生素D3十分必要。

現(xiàn)行的飼料中維生素 D3檢測方法（GB/T 17818—2010）為液相色譜法，出峰時間有其他物質干擾，無法準確定量；需要進行色譜柱的二次分離，檢測效率較低；且該方法檢出限較高不適用于飼料原料中維生素D3的檢測。 本研究擬采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜檢測內標法解決上述問題。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 1290/6495 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀（配有電噴霧源，美國Aglient 公司）；維生素D3、維生素D2標準品（德國 Dr. Ehrenstorfer 公司）；甲醇（色譜純，美國 Fisher Scientific 公司）； 甲酸 （色譜純，F(xiàn)luka 公司），Bond Elut ENN固相萃取柱 （美國Agilent 公司）、Bond Elut Plexa固相萃取柱 （美國 Agilent 公司）；Captiva EMRLipid 凈化柱（美國 Agilent 公司）

飼料樣品：豬配合飼料、禽配合飼料、濃縮飼料、飼料原料。

1.2 溶液配制 維生素D3標準儲備液：稱取10 mg維生素D3（膽鈣化醇）標準品于50 mL 棕色容量瓶中， 用色譜純無水乙醇溶解并稀釋至刻度，混勻，-20 ℃保存。該儲備液濃度為 200 μg/mL，有效期3 個月。

標準中間液： 取1.00 mL 儲備液用色譜純無水乙醇定容到100 mL 容量瓶，-20 ℃保存， 該中間液質量濃度2.0 μg/mL，有效期1 個月。

維生素D2內標工作液： 稱取100 mg 維生素D2（鈣化醇）標準品于100 mL 棕色容量瓶中，用色譜純無水乙醇溶解并稀釋至刻度，混勻，該液濃度為 1.0 mg/mL。 用甲醇稀釋 10 倍，配制成 100 μg/mL內標工作液。

標準系列溶液：準確吸取維生素D3標準中間液 0.10、0.20、0.50、2.50、5.00、12.50 mL 于 100 mL棕色容量瓶中， 各加入維生素D2內標工作溶液1.00 mL，用甲醇定容至刻度，混勻。此標準系列工作液濃度分別為 2.0、4.0、10.0、50、100、250 μg/L。

1.3 色譜和質譜條件 Thermo BDS HYPERSIL C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.4 μm）；柱溫：35 ℃；進樣體積：2 μL；流速：300 μL/min；流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

離子源：電噴霧離子源；掃描模式：正模式；毛細管電壓：正模式3500 V；負模式：3000 V；干燥氣溫度：250 ℃；干燥器流速：10 L/min；霧化氣壓力：35 psi；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速 11 L/min；EMV：300 V。監(jiān)測離子對（m/z）和其他參考條件參見表2。

表2 質譜選擇反應監(jiān)控參數(shù)

1.4 樣品前處理條件 稱取2 g 試樣于50 mL具塞離心管中， 加入100 μL 維生素D2內標工作溶液（100 μg/mL）和 0.4 g 抗壞血酸，加入 6 mL約 40 ℃溫水，渦旋 1 min，加入 12 mL 乙醇，渦旋30 s，再加入 6 mL 氫氧化鉀溶液（500 g/L），渦旋30 s 后， 放入恒溫振蕩器中，80 ℃避光恒溫水浴振蕩30 min，取出放入冷水浴降溫。

向冷卻后的皂化液中加入20 mL 正己烷，渦旋提取3 min，7000 r/min 條件下離心3 min。轉移上層清液到50 mL 離心管，加入25 mL 水，輕微晃動30 次，在7000 r/min 條件下離心3 min，取上層有機相在40 ℃下氮氣吹干， 加入體積分數(shù)80%的甲醇溶液5.0 mL，備用。

用體積分數(shù)80%甲醇水溶液2 mL 活化凈化小柱Bond Elut Plexa，全部樣液上柱，再用80%的甲醇水溶液2 mL 淋洗小柱， 抽干，4 mL 丙酮洗脫，40 ℃氮氣吹干，1 mL 甲醇復溶，過膜，供 LCMS/MS 檢測。

2 結果與討論

2.1 皂化和提取條件的研究 目前， 維生素D3檢測過程中影響檢測效率的主要因素是皂化和提取過程，本研究在不改變皂化原理的前提下，通過將回流改成水浴振蕩，乙醚提取改成正己烷提取，減少提取次數(shù)和洗滌次數(shù)， 采用實際樣品與標準方法比較提取效率，結果能夠滿足要求。

2.2 凈化條件的優(yōu)化 根據(jù)維生素D3的化學性質，選取吸附特性為非極性的凈化小柱Bond Elut ENN 和Bond Elut Plexa。 同時比較了吸附雜質性固相萃取柱Captiva EMR-Lipid?？疾靸艋≈幕厥章省?其中，Bond Elut ENN 小柱回收率低于50%，Captiva EMR-Lipid 凈化效果不明顯，通過優(yōu)化固相小柱凈化條件，Bond Elut Plexa 凈化小柱回收率達可到90%左右，通過液相考察維生素D3色譜峰峰型對稱，峰純度高，由此可見，Bond Elut Plexa 小柱可以實現(xiàn)飼料中維生素D3的凈化。

2.3 基質效應考察 基質常常對分析物的分析過程有顯著的干擾（陳小華和汪群杰，2009）?；|效應主要是由質譜檢測器的離子化過程產生的，在電噴霧時， 基質內的組分與目標化合物共同流出噴霧針，影響目標物的霧化、揮發(fā)、分裂、化學反應及帶電過程，致使進入質譜的離子減少或增加，從而影響定量分析的可靠性和準確性 （蘇萌和艾連峰，2014；王立琦等，2011）。通過實驗發(fā)現(xiàn)，基質對目標化合物響應存在明顯的增強作用， 因此在實際檢測過程中， 用標準曲線定量會對回收率造成影響。 在液相色譜-串聯(lián)質譜法中，補償基質效應的方法有基質匹配標準溶液的校正、 同位素標記法、加入分析保護劑、優(yōu)化進樣技術等（劉洪斌等，2011；蔣施等，2010），本實驗基質抑制效應明顯，因此采用維生素D2作為內標進行定量，在經濟條件較好的情況下，可以采用維生素D3的同位素內標。

2.4 色譜柱的選擇 維生素D3在一般的C18 色譜柱上有較好的保留，本方法比較了Waters ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1 mm ×50 mm，1.7 μm）、Agilent SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）和Thermo BDS HYPERSIL C18 （2.1 mm× 100 mm，2.4 μm）色譜柱，經使用標準工作液對各規(guī)格色譜柱進樣分離得色譜質譜圖。由實驗結果可見，在本研究的液相條件下，Thermo BDS HYPERSIL C18（2.1 mm×100 mm，2.4 μm） 色譜柱峰型和靈敏度較好。 標準液的特征離子流圖見圖1。

圖1 維生素D3 和維生素D2 標準品的特征離子色譜圖（MRM）

2.5 流動相選擇 為了實現(xiàn)VD3峰型對稱、響應高的要求，本研究采用常用的甲醇-水做流動相，為增加VD3的離子化效率，在水相中加入體積分數(shù)0.2%的甲酸，經比較使用不同比例的甲醇進行洗脫，甲醇比例為95%（V：V）時最為理想，且能夠在較短時間內得到很好的峰型； 甲醇比例更高時響應明顯下降。本方法最終確定用0.2%的甲酸和甲醇做流動相（表1）。

2.6 方法學考察

2.6.1 方法的線性、檢出限和定量限 維生素D3在MRM 方式下的靈敏度除取決于本身的結構原因外， 主要與離子化的效率有關。 本方法采用以空白樣品加標實驗的3 倍信噪比（S/N）為方法的檢出限；將特定濃度的維生素D3加入到空白樣品中，然后按本方法對樣品預處理。 經質譜檢測，得本方法的定量限。具體曲線方程、檢出限和定量限見表3。

表3 線性方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限和定量限

2.6.2 方法準確度與精密度 為考察方法的準確度和精密度，采用不同樣品基質進行了添加實驗，按照定量限、 中間濃度和實際添加濃度進行3 個梯度的添加，所得實驗結果如表4 所示。平均回收率為70.1% ~ 93.6%，批內相對標準偏差為3.8% ~8.3%，批間相對標準偏差為5.1% ~ 6.9%，表明該方法具有較好的準確度和精密度。

表4 方法精密度與準確度

2.6.3 實際樣品檢測 選擇5 份含有維生素D3的仔豬配合飼料， 按本方法優(yōu)化條件進行前處理后分別上液相和LC-MS/MS 測定，液相色譜峰保留時間處未見雜質峰干擾， 可見本研究前處理方法也可用于液相檢測。 液相結果和LC-MS/MS 結果相對偏差小于10%， 均在理論含量偏差范圍內。表明本方法具有實驗結果可比性，檢測結果準確、可靠。

3 結論

本研究采用更加便捷的皂化法提取， 用固相萃取法進行凈化，內標法定量分析，建立了液相色譜-串聯(lián)四級桿質譜檢測飼料中維生素D3含量的分析方法。 實驗結果表明， 該方法的檢出限為2.0 μg/kg，定量限為 5.0 μg/kg；在 2 ~ 250 μg/kg定量范圍內線性關系良好（r>0.995）；添加回收率為 70.1% ~ 93.6%；RSD＜10%。 方法批量操作性強，靈敏度高，具有較好的精密度與準確度。