紫外分光光度法測定飼料中的噁唑烷硫酮

張鳳枰 ， 雷寶良 ， 楊發(fā)樹 ， 宋 濤 ， 吳 芳 ， 盧加文

（1.宜賓學(xué)院，四川宜賓 644000；2.四川威爾檢測技術(shù)股份有限公司，四川成都 610041；3.通威股份有限公司水產(chǎn)畜禽營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖農(nóng)業(yè)農(nóng)村部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610093；4.通威股份有限公司水產(chǎn)健康養(yǎng)殖四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610093）

噁唑烷硫酮由R 基團(tuán)上帶有β-羥基的硫葡萄糖苷經(jīng)酶解再環(huán)化而形成， 是十字花科植物及其近緣植物白花菜科中（如油菜、西蘭花、甘藍(lán)等）大量存在的硫代葡萄糖苷的酶解產(chǎn)物 （李鮮等，2006）。 油菜是世界第三大油料作物，2019 年我國油菜籽總產(chǎn)量為1348.47 萬t， 油菜籽制油后產(chǎn)生大約760 萬t 的菜籽餅粕。菜籽餅粕是優(yōu)良的飼料蛋白質(zhì)資源，是飼料中硫代葡萄糖苷的主要來源，硫代葡萄糖苷的含量限制了菜籽餅粕的有效利用。 噁唑烷硫酮具有水溶性，但沒有揮發(fā)性，其能誘發(fā)動(dòng)物碘缺乏及甲狀腺、肝和腎腫大，降低動(dòng)物的采食量和生長率，高劑量甚至可以引起死亡。 反芻動(dòng)物、豬、兔、家禽和魚對(duì)飼糧中硫代葡萄糖苷總量的耐受量分別為 1.50 ~ 4.22、0.78、7.00、5.40 μmol/g 和 3.60 μmol/g （董曉芳和佟建明，2013；Martland 等，1984），長期攝入含硫代葡萄糖苷的菜籽粕可造成動(dòng)物生殖功能受損（Taljaard，1993）。為保證養(yǎng)殖動(dòng)物健康和生產(chǎn)、人類健康及環(huán)境安全，歐洲議會(huì)和歐盟理事會(huì)第2002/32/EC 指令、《GB 13078-2017 飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》 規(guī)定了飼料原料和飼料產(chǎn)品中噁唑烷硫酮的限量標(biāo)準(zhǔn)。 因此，噁唑烷硫酮的快速準(zhǔn)確定量檢測對(duì)于菜籽餅粕安全高效利用、保障飼料質(zhì)量安全具有非常重要的意義。 本文根據(jù)菜籽及其加工產(chǎn)品、禽配合飼料、水產(chǎn)配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料的特點(diǎn)，從白芥子酶用量、酶解條件、樣品質(zhì)量、測定波長的選擇、方法學(xué)考察等方面開展系統(tǒng)研究， 旨在建立紫外分光光度法測定飼料中的噁唑烷硫酮檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和樣品

1.1.1 儀器 Lambda 35 紫外可見分光光度計(jì)（PerkinElmer 公司）；CP224S 電子分析天平（Sartorius 公司）；WH-3 微型漩渦混合儀 （上海滬西分析儀器有限公司）；DZKW-4 恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；ZHWY-2112F 恒溫振蕩器 （上海智城分析儀器制造有限公司）；Allegra 64R 冷凍離心機(jī)（Beckman Coulter 公司）。

1.1.2 試劑 石油醚（沸程30 ~ 60 ℃）、二氯甲烷、無水乙醇、檸檬酸、磷酸氫二鈉、鹽酸、氫氧化鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；商品白芥子酶 （Sigma 公司）；5-乙烯基-噁唑-2-硫酮對(duì)照品（HPLC≥98%）（源葉生物公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q Gradient 超純水。

1.1.3 樣品 白芥種子、油菜籽、菜餅、菜籽粕、池塘養(yǎng)魚配合飼料、草魚配合飼料、魚用膨化配合飼料、肉小雞配合飼料、蛋雞配合飼料、肉大鴨配合飼料、乳豬配合飼料、草蝦膨化配合飼料、產(chǎn)蛋雞濃縮飼料、蛋雞濃縮飼料、奶牛精料補(bǔ)充料、肉羊精料補(bǔ)充料、肉牛精料補(bǔ)充料、成貓糧等樣品，由通威股份有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白芥子酶的制備 稱取50 g 白芥（Sinapis alba L.）種子（按照 GB/T 5520 做發(fā)芽率實(shí)驗(yàn)，72 h內(nèi)發(fā)芽率須大于85%，保存期不超過兩年）粉碎后，置于500 mL 燒杯中，加入100 mL 石油醚（沸程30 ~ 60 ℃），攪拌 2 min，靜置，棄去上層液體，重復(fù)脫脂10 次，使脂肪含量低于2%，置通風(fēng)櫥內(nèi)使溶劑揮干，然后再粉碎一次，80%通過0.28 mm實(shí)驗(yàn)篩，裝在密閉容器中，置于－18 ℃ 以下保存，有效期為6 個(gè)月。為保證白芥子酶活性，制備過程中環(huán)境溫度須保持在30 ℃以下， 兩次粉碎注意少量多次，防止粉碎機(jī)過熱。

1.2.2 試樣溶液制備 平行做兩份實(shí)驗(yàn)。 準(zhǔn)確稱取預(yù)先于（103±2）℃干燥至恒重的試樣 0.2 g（精確到 0.0001 g） 置于 10 mL 離心管中， 加入 100 mg 白芥子酶、2.0 mL pH 7.0 緩沖溶液，渦旋混合1 min，置于（35±1.0）℃恒溫水浴中酶解反應(yīng) 120 min； 取出冷卻至室溫， 準(zhǔn)確加入2.5 mL 二氯甲烷，渦旋混合1 min，室溫下200 次/min 振蕩提取30 min，于 20 ℃下 5000 r/min 離心 20 min。 準(zhǔn)確移取6 mL 無水乙醇于具塞試管中， 用微量移液器準(zhǔn)確移取離心管下層有機(jī)相溶液50 μL， 加入到裝有無水乙醇的具塞試管中，蓋上塞，渦旋混合1 min，將具塞試管放入恒溫水浴中，（50±1.0）℃下加熱反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，所得溶液為試樣溶液。 同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)，除不加試樣外，空白實(shí)驗(yàn)采用與試樣完全相同的步驟。

1.2.3 測定 在儀器最佳條件下， 將試樣溶液加入10 mm 比色皿中，以空白實(shí)驗(yàn)溶液為空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)分別于235、245 nm 和255 nm波長處測定試樣溶液的吸光度值。

1.2.4 結(jié)果計(jì)算 試樣中噁唑烷硫酮的含量w以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，單位為mg/kg（以干基計(jì)），按下式計(jì)算：

式中：A235、A245、A255分別為試樣溶液在 235、245、255 nm 處的吸光度值；m 為試樣的質(zhì)量；4.42為單位校正吸光度值所代表的5-乙烯基-2-噁唑烷硫酮的質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 白芥子酶添加量的選擇 為考察白芥子酶添加量對(duì)測定結(jié)果的影響， 選用噁唑烷硫酮含量較高的菜籽粕樣品， 按照1.2.2 制備的白芥子酶、商品白芥子酶（Sigma 公司，批號(hào)：T4528-200UN）開展酶解效果比較實(shí)驗(yàn)， 白芥子酶的添加量分別為 20、40、60、80 mg 和 100 mg，結(jié)果見表 1。 添加量分別為60、80、100 mg 芥子酶的測定結(jié)果基本一致，白芥子酶和商品酶（Sigma）的酶解后噁唑烷硫酮測定結(jié)果基本一致。

表1 不同添加量白芥子酶酶解后菜籽粕樣品的噁唑烷硫酮測定結(jié)果 mg/kg

為進(jìn)一步確定白芥子酶的添加量， 選取181006 和181008 批次白芥種子制備芥子酶，繼續(xù)用噁唑烷硫酮含量高的菜籽粕開展酶解效果實(shí)驗(yàn)， 白芥子酶的添加量分別為 20、40、60、80 mg和100 mg。 酶解效果實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。 白芥子酶添加量為20 ~ 60 mg 時(shí)， 菜籽粕樣品的噁唑烷硫酮測定結(jié)果隨著添加量的增多呈增長趨勢，可能白芥子酶添加量不夠，酶解不完全，不能將菜籽粕中硫代葡萄糖苷全部酶解； 芥子酶添加量為60 ~ 100 mg 時(shí)，菜籽粕樣品噁唑烷硫酮測定結(jié)果基本一致，RSD 在0.54% ~ 3.02%， 表明芥子酶添加量充足、酶解完全，菜籽粕中硫代葡萄糖苷已完全分解。

表2 不同批次、不同添加量白芥子酶酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果

白芥子酶的酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 樣品中硫代葡萄糖苷含量不同，若要酶解完全，所需要芥子酶添加量不同，含量越高，所需白芥子酶的添加量越大?？紤]不同來源白芥種子酶活性有所差異，為確保菜籽及其加工產(chǎn)品、 禽配合飼料、 水產(chǎn)配合飼料、 濃縮飼料和精料補(bǔ)充料樣品硫代葡萄糖苷酶解完全， 保證實(shí)際飼料樣品中噁唑烷硫酮檢測結(jié)果準(zhǔn)確，最終確定白芥子酶的添加量為100 mg。

2.2 酶解溫度的選擇 溫度是影響酶解效果的重要因素，使用181002 批次白芥子酶，選擇中、高噁唑烷硫酮含量的菜籽粕樣品，選擇15、25、35 ℃進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)， 測定噁唑烷硫酮含量， 結(jié)果見表3。 25、35 ℃下測定結(jié)果基本一致，為保證酶解效果，最終選擇酶解溫度為35 ℃。

表3 不同溫度酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 酶解時(shí)間的確定 酶解時(shí)間也是影響酶解效果的重要因素， 繼續(xù)使用181002 批次白芥子酶，選擇中、高噁唑烷硫酮含量的菜籽粕樣品，選擇酶解時(shí)間為60、120、180 min 進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，測定菜籽粕樣品中的噁唑烷硫酮含量，結(jié)果見表4。酶解60、120、180 min 測定結(jié)果基本一致，為保證酶解效果，最終選擇酶解時(shí)間為120 min。

表4 不同時(shí)間酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 不同產(chǎn)地白芥子酶的酶解效果比較 分別采集四川、河北、黑龍江、甘肅、遼寧、內(nèi)蒙古、安徽等地產(chǎn)的白芥種子，制備白芥子酶，測定中、高噁唑烷硫酮含量的菜籽粕、 池塘養(yǎng)魚配合飼料中噁唑烷硫酮含量，結(jié)果見表5 ~ 表7。 使用不同產(chǎn)地的白芥子酶，中、高噁唑烷硫酮含量的菜籽粕、池塘養(yǎng)魚配合飼料的噁唑烷硫酮測定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.88% ~ 6.07%，測定結(jié)果基本一致，不同產(chǎn)地的白芥子酶均滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表5 中含量菜籽粕噁唑烷硫酮測定結(jié)果比較實(shí)驗(yàn)

表6 高含量菜籽粕噁唑烷硫酮測定結(jié)果比較實(shí)驗(yàn)

表7 池塘養(yǎng)魚配合飼料噁唑烷硫酮測定結(jié)果比較實(shí)驗(yàn)

2.5 樣品質(zhì)量的選擇 Wetter 和 Youngs（1976）、戈蘭英等（1985 ）、佘珠花等（2003）均稱取 0.1 g油菜籽、菜籽粕樣品測定，考慮配合飼料、濃縮飼料和精料補(bǔ)充料中添加的菜籽粕較少， 飼料產(chǎn)品中的噁唑烷硫酮含量較低，應(yīng)適當(dāng)提高稱樣量。參照NY/T 1799-2009《菜籽餅粕及其飼料中噁唑烷硫酮的測定 紫外分光光度法》， 分別稱取0.2、0.3、0.4、0.5 g 菜籽粕、池塘養(yǎng)魚配合飼料樣品，考察不同稱樣量噁唑烷硫酮的測定結(jié)果。結(jié)果表明，0.2、0.3、0.4、0.5 g 稱樣量的測定結(jié)果基本一致，最終確定稱樣量為0.2 g（表8 和表9）。

表8 中含量菜籽粕不同稱樣量噁唑烷硫酮測定結(jié)果比較

表9 池塘養(yǎng)魚配合飼料噁唑烷硫酮測定結(jié)果比較

2.6 空白實(shí)驗(yàn) 為考察白芥子酶、樣品空白對(duì)測定結(jié)果的影響，取白芥子酶置于（103±2）℃烘箱中4 h 滅活，分別選用白芥子酶、滅活白芥子酶、菜籽粕、池塘養(yǎng)魚配合飼料、產(chǎn)蛋雞配合飼料樣品，按照上述實(shí)驗(yàn)步驟， 分別測定 235、245、255 nm處吸光度，結(jié)果見表10。

表10 空白實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，在規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件下，白芥子酶、滅活白芥子酶、菜籽粕、池塘養(yǎng)魚配合飼料、產(chǎn)蛋雞配合飼料等在235、245、255 nm 處均有一定的吸收， 但校正吸光度為0 或負(fù)值， 且絕對(duì)值非常低， 不會(huì)對(duì)噁唑烷硫酮的測定結(jié)果造成影響，因此，空白實(shí)驗(yàn)確定為：同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)，除不加實(shí)樣外，空白實(shí)驗(yàn)采用與試樣完全相同的實(shí)驗(yàn)步驟。

2.7 測定波長的選擇 根據(jù) 《ISO 5504:1992 菜籽餅粕中總異硫氰酸酯含量和乙烯基噁唑烷硫酮含量的測定》， 噁唑烷硫酮測定波長為220 ~ 280 nm， 最大吸收波長大約在 250 nm 處。 Wetter 和Youngs（1976）用二氯甲烷萃取硫甙酶解產(chǎn)物，取定量的二氯甲烷萃取液，加95%乙醇水浴生成噁唑烷硫酮， 然后在紫外區(qū) 235、245、255 nm 處測定其吸光度，校正吸光度，以5-乙烯基-2-噁唑烷硫酮表示噁唑烷硫酮的含量。 戈蘭英（1985）采用硫脲改良法測定油菜籽中的噁唑烷硫酮， 油菜籽不殺活，pH 7.0、40 ℃酶解 1 h， 用二氯甲烷萃取硫甙酶解產(chǎn)物，離心，用95%乙醇衍生，于235、245、255 nm 處測定其吸光度，校正吸光度，計(jì)算得到噁唑烷硫酮的含量， 與Wetter 和Youngs 方法測定結(jié)果一致。

使用5-乙烯基-噁唑-2-硫酮對(duì)照品（HPLC≥98%）， 用無水乙醇配制成 9.4 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液， 同時(shí)按照上述試樣前處理步驟制備試劑空白、菜籽粕、草魚配合飼料試樣溶液，在200 ~350 nm 波段掃描吸光度，結(jié)果見圖1。

圖1 試劑空白（a）、菜籽粕（b）、草魚配合飼料（c）試樣溶液和5-乙烯基-噁唑-2-硫酮標(biāo)準(zhǔn)溶液（d）200 ~ 350 nm 紫外吸收光譜圖

結(jié)果表明，空白溶液、菜籽粕、水產(chǎn)配合飼料在200~280 nm 波段均有吸收，且在200~220 nm波段吸光度均較高；9.4 μg/mL 5-乙烯基-噁唑-2-硫酮標(biāo)準(zhǔn)溶液在215 ~ 250 nm 波段均有吸收，且在 235 nm 處吸光度最強(qiáng)。 根據(jù) Wetter 和Youngs（1976）和華欲飛（1994）等研究成果，由于菜籽粕、使用菜籽粕的飼料中含有蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)影響，考慮飼料、菜籽粕其他物質(zhì)的吸收干擾和試劑的吸收干擾， 實(shí)際測定的吸光度為噁唑烷硫酮和蛋白質(zhì)、脂肪等所有物質(zhì)的吸光度之和，且測定的目標(biāo)化合物為噁唑烷硫酮系列物質(zhì)， 綜合ISO 5504-1992、NY/T 1799-2009 和文獻(xiàn)（佘珠花等，2003；華欲飛，1994；戈蘭英等，1985；Wetter 和Youngs，1976），需要測定 235、245、255 nm 的吸光度， 并依據(jù)校正吸光度消除雜質(zhì)干擾原理， 采用235 nm 和255 nm 吸光度之和的一半作為基線，實(shí)現(xiàn)245 nm 處的吸光度消除雜質(zhì)干擾，即為：

2.8 精密度實(shí)驗(yàn) 按照上述確定的條件， 選擇菜餅和魚用膨化配合飼料樣品完成8 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表11。 菜餅的水產(chǎn)配合飼料測定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.23%和5.89%，測定結(jié)果重復(fù)性好。

表11 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.9 回收率和定量限 選擇乳豬配合飼料（未使用菜籽粕）、蛋雞配合飼料和菜籽粕樣品，配制適當(dāng)濃度的5-乙烯基-噁唑-2-硫酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，稱取0.2 g 試樣后，分別添加3 個(gè)濃度梯度5-乙烯基-噁唑-2-硫酮標(biāo)準(zhǔn)溶液， 按照上述確定方法完成回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表12。

表12 乳豬配合飼料、蛋雞配合飼料和菜籽粕回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，在150~600 mg/kg，乳豬配合飼料中噁唑烷硫酮的平均回收率為92.4%~116.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.16%~8.03%； 在200~800 mg/kg，蛋雞配合飼料中噁唑烷硫酮的平均回收率為99.9%~109.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.34%~2.70%；在800~3200 mg/kg， 菜籽粕中噁唑烷硫酮的平均回收率為86.1%~116.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.27%~3.75%。

為確定本方法的定量限， 選擇未使用菜籽粕的乳豬配合飼料、草蝦膨化配合飼料，配制適當(dāng)濃度的5-乙烯基-噁唑-2-硫酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，稱取0.2 g試樣后，分別添加 100、150、200、250 mg/kg 4 個(gè)濃度梯度5-乙烯基-噁唑-2-硫酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述確定方法完成回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表13。

表13 乳豬配合飼料和草蝦膨化配合飼料回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，乳豬配合飼料、草蝦膨化配合飼料加標(biāo)濃度100 mg/kg 的平均回收率分別為173.3%和169.5%， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為7.25%和4.66%， 這可能是因?yàn)?-乙烯基-噁唑-2-硫酮標(biāo)準(zhǔn)溶液添加濃度較低， 由于樣品基質(zhì)存在一定的干擾，導(dǎo)致試樣溶液吸光度值偏高，最終導(dǎo)致加標(biāo)100 mg/kg 濃度時(shí)的回收率偏高。 在150 ~ 250 mg/kg， 乳豬配合飼料噁唑烷硫酮的平均回收率為91.7% ~ 112.9%， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.48%~4.66%；在150~250 mg/kg，草蝦膨化配合飼料噁唑烷硫酮的平均回收率為96.9%~120.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.23%~4.11%， 說明5-乙烯基-噁唑-2-硫酮標(biāo)準(zhǔn)溶液添加濃度在150 mg/kg 以上時(shí)，樣品基質(zhì)干擾不足以影響加標(biāo)回收率，加標(biāo)回收率均能滿足實(shí)驗(yàn)要求，綜合考慮兩次回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定本方法的定量限為150 mg/kg，與Wetter和 Youngs（1976）研究結(jié)果一致。

2.10 水產(chǎn)配合飼料中添加菜籽粕驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為進(jìn)一步驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性、可信度，采用未添加菜籽粕的草蝦膨化配合飼料，粉碎后，添加噁唑烷硫酮含量較高的菜粕， 分別按照10%、20%、30%比例添加至草蝦膨化配合飼料中，充分混合均勻，測定添加菜籽粕后草蝦膨化配合飼料樣品中噁唑烷硫酮的含量，結(jié)果見表14。

表14 水產(chǎn)配合飼料菜籽粕添加實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明， 添加菜籽粕后草蝦膨化配合飼料噁唑烷硫酮實(shí)際測定值與理論值比值為99.1% ~111.9%，進(jìn)一步證明本次修訂的標(biāo)準(zhǔn)方法測定結(jié)果可信度高。

2.11 實(shí)際樣品測定結(jié)果 實(shí)際樣品測定結(jié)果見表15。

表15 菜籽餅粕、配合飼料、濃縮飼料和精料補(bǔ)充料實(shí)際樣品測定結(jié)果

3 結(jié)論

試樣中的硫代葡萄糖苷在pH 7.0 緩沖液中，在白芥子酶作用下水解生成異硫氰酸酯，用二氯甲烷萃取后， 帶羥基的異硫氰酸酯與乙醇反應(yīng)，環(huán)化生成噁唑烷硫酮，使用紫外分光光度法測定，方法的定量限為150 mg/kg，平均回收率為86.1% ~ 116.9%，適用于菜籽及其加工產(chǎn)品，以及含有菜籽及其加工產(chǎn)品的配合飼料、 濃縮飼料和精料補(bǔ)充料中噁唑烷硫酮的測定， 方法重復(fù)性好、可信度高。