均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化提高羽毛粉消化率的研究

喬 羽 ， 陳華彬 ， 王興吉 ， 王克芬 ， 肖 靜

（1.山東隆科特酶制劑有限公司，山東臨沂 276400；2.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東濟(jì)南 250000）

羽毛素有“天然蛋白質(zhì)之冠”之稱，蛋白質(zhì)含量高達(dá)85%以上，但羽毛中的蛋白質(zhì)是一種不溶性的角蛋白， 其是一種以ɑ-螺旋和β-折疊構(gòu)成的超螺旋多肽鏈， 內(nèi)部的半胱氨酸二硫鍵作為連接橋形成復(fù)雜的交聯(lián)網(wǎng)， 此外羽毛外層被一層脂質(zhì)覆蓋使角蛋白親水性降低， 這進(jìn)一步增加了角蛋白對蛋白酶水解的抗性， 所以羽毛不易被動物直接消化利用吸收（李爽等，2017；陳忱等，2015；劉玉芬等，2010）。 近些年養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展加大了對蛋白質(zhì)飼料的需求， 羽毛粉的開發(fā)利用不僅能緩解生產(chǎn)蛋白質(zhì)種類飼料原料的緊缺， 也使廢棄羽毛變廢為寶。

目前國內(nèi)大多采用導(dǎo)熱油高溫高壓水解法生產(chǎn)羽毛粉， 即采用導(dǎo)熱油水解罐將羽毛水解烘干一次完成。 這種生產(chǎn)工藝簡單，投資少，但羽毛粉的品質(zhì)難以保證，胃蛋白酶消化率普遍偏低。為了提高羽毛粉營養(yǎng)價值， 促進(jìn)羽毛粉在動物體內(nèi)的消化利用， 近些年不少專家學(xué)者以羽毛為原料進(jìn)行試驗(yàn)探究。 楊波等（2007）采用高溫過氧乙酸法處理雞毛發(fā)現(xiàn)，在溫度 128 ℃，料液比1:5，加入25%過氧乙酸濃度， 反應(yīng)20 min， 羽毛溶解率達(dá)90%，體外胃蛋白消化率可提高至82.87%。 郝魯江等（2016）在羽毛粉中加入角蛋白酶0.03 g，35 ℃酶解36 h，羽毛分解率達(dá)到50.5% ，酶解液可溶性蛋白含量為225.7 mg/L， 而酶解羽毛蛋白粉的胃蛋白酶體外消化率為23%；單春喬等（2016）使用 0.7%的氫氧化鈉溶液90 ℃預(yù)處理150 min，再使用 0.8%的角蛋白酶55 ℃酶解8 h，最終產(chǎn)品中的肽含量達(dá)73.0%；陳明等（2020）選取 4 種不同加工方式（普通、水解、酶解、酵解）的羽毛粉發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過酵解加工方式處理的羽毛粉品質(zhì)最好。 通過這些研究發(fā)現(xiàn)， 提高羽毛粉的分解消化率一般需要較高濃度的化學(xué)試劑或較長的酶解時間， 這在一定程度上造成了資源浪費(fèi)并提高了生產(chǎn)成本。

通過前期的研究發(fā)現(xiàn)單純使用蛋白酶酶解羽毛存在酶解時間長、效率低的缺點(diǎn)，但通過使用低濃度的羽毛預(yù)處理劑浸泡后，酶解效率大大提高。本試驗(yàn)以白雞毛為試驗(yàn)材料， 采用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化羽毛粉的加工工藝， 旨在提高羽毛粉成品的胃蛋白酶消化率，提升羽毛粉的營養(yǎng)吸收價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 白雞毛、羽毛粉，取自羽毛粉加工廠。羽毛預(yù)處理劑、堿性蛋白酶、脂肪酶，山東隆科特酶制劑有限公司；1:10000 胃蛋白酶， 生工生物工程（上海）股份有限公司；相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)： 細(xì)胞色素 C （Mr 12355）、 抑肽酶（Mr 6515）、桿菌肽（Mr 1450）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（Mr 451）、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（Mr 189），美國 sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備 恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （ZXRDA5210，上海智城分析儀器制造有限公司）；全自動定氮儀（KDN-1000，上海昕銳儀器儀表有限公司）；恒溫鼓風(fēng)干燥箱（ZXRD-A5210，上海智城分析儀器制造有限公司）；顯微鏡（BM-1000，南京江南永新光學(xué)有限公司）； 高效液相色譜儀（Agilent1260，安捷倫科技（中國）有限公司）；液相色譜分析柱（TSKgel G2000SWXL，日本島津株式會社）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 羽毛前處理準(zhǔn)備 將羽毛在加入0.8%濃度的羽毛預(yù)處理劑中常溫浸泡30 min，撈出羽毛擠壓瀝水后置于130 ℃下處理30 min，粉碎得到羽毛漿。

1.3.2 酶解工藝的研究 單因素試驗(yàn)： 探究堿性蛋白酶與脂肪酶配比（1:1、2:1、3:1、1:2、1:3），反應(yīng)pH （6、7、8、9、10）， 反 應(yīng) 溫度（30、40、50、60、70℃），酶添加量（0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%，以堿性蛋白酶基準(zhǔn)記），酶解時間（0、2、4、6、8 h），對胃蛋白酶消化率和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響，確定各單因素的范圍值。 初始試驗(yàn)設(shè)定值為堿性蛋白酶添加量0.3%，反應(yīng)pH 7.0，反應(yīng)溫度50 ℃，酶解2 h。

1.3.3 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化酶解工藝 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上， 以羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量和胃蛋白酶消化率為評價指標(biāo)，選取反應(yīng)pH（X1）、反應(yīng)溫度（X2）、酶添加量（X3）及酶解時間（X4）為考察因素，每個因素設(shè)計(jì)5 個水平，每個水平重復(fù)一次，采用 DPS 7.05 進(jìn)行 U10（104）均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化酶解工藝條件， 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表1。

表1 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

1.3.4 測定的指標(biāo) 可溶性蛋白質(zhì)含量的測定：采用考馬斯亮藍(lán)法（喬羽等，2019）測定羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量。

胃蛋白酶消化率的測定（GB/T 6432-1994）：取1 g 羽毛粉置于250 mL 的錐形瓶中， 加入150 mL的20 UI/mL 胃蛋白酶溶液，蓋塞，45 ℃恒溫恒速保溫酶解消化16 h，過濾，烘干至恒重，測定羽毛粉消化前后剩余的粗蛋白質(zhì)含量， 并計(jì)算其消化率， 其他具體試驗(yàn)步驟參考 《動物性蛋白質(zhì)飼料胃蛋白酶消化率的測定過濾法 （GB/T 17811-2008）》（中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)疫總局，2008），粗蛋白質(zhì)含量的測定參考《GB/T 6432飼料中粗蛋白測定方法》。

1.3.5 凝膠過濾色譜測定酶解羽毛粉的相對分子質(zhì)量分布 （中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)疫總局，2008）。

相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的配制： 分別用流動相配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的不同相對分子質(zhì)量肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1:1:1:1:1 等體積比混合，用孔徑為0.22 μm 濾膜過濾后備用。

色譜條件： 色譜柱 TSK-GEL G2000SWXL（300 mm×7.8 mm，5 μm）， 流動相為乙腈-水-三氟乙酸（45:55:0.1，V/V）；流速 0.5 mL/min；柱溫 30 ℃；進(jìn)樣體積20 μL；檢測波長220 nm；檢測時間30 min。

樣品處理： 取0.1 g 羽毛粉加入5 mL 流動相，超聲10 min，使樣品充分溶解混勻，取1 mL上清液用孔徑為0.22 μm 聚四氟乙烯過濾膜過濾后，上機(jī)進(jìn)樣。其他步驟參考《GB/T22729-2008 海洋魚低聚肽粉》。

1.3.6 羽毛粉鏡檢 采用四分法取羽毛粉樣品，選取少量羽毛粉代表性樣品置于載玻片中間，用取樣針將羽毛粉攤平分散開。 使用生物顯微鏡在合適的放大倍數(shù)下觀察羽毛粉的顆粒狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性蛋白酶與脂肪酶配比對酶解效果的影響 由圖1 可知， 不同堿性蛋白酶與脂肪酶的配比對酶解羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量及胃蛋白酶消化率存在一定的影響， 脂肪酶占比越高，羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量和胃蛋白酶消化率越低， 當(dāng)堿性蛋白酶與脂肪酶配比為3:1 時，酶解羽毛粉的可溶性蛋白質(zhì)含量和胃蛋白酶消化率相對都達(dá)到最高。這可能與羽毛表層的蠟脂有關(guān)，由于羽毛外層被一層脂質(zhì)覆蓋，降低了角蛋白的親水性，并在一定程度上阻礙堿性蛋白酶與角蛋白的直接接觸（王德山等，2016）。 加入脂肪酶可以通過酶解羽毛表面的脂質(zhì)層，提高堿性蛋白酶的酶解效率。綜上選擇堿性蛋白酶與脂肪酶配比為3:1。

圖1 堿性蛋白酶與脂肪酶配比對可溶性蛋白質(zhì)含量及胃蛋白酶消化率的影響

2.2 反應(yīng)pH 對酶解效果的影響 酶解過程中的pH 會影響最終羽毛粉的可溶性蛋白質(zhì)含量和胃蛋白酶消化率。由于使用堿性蛋白酶與脂肪酶復(fù)合酶解羽毛粉，當(dāng)酶解pH 過高，會影響脂肪酶的酶活力， 導(dǎo)致酶解效率降低， 當(dāng)酶解pH過低， 脂肪酶和堿性蛋白酶酶解能力受到影響。由圖2 可知，隨著pH 的增大，羽毛粉的胃蛋白酶消化率逐步趨于穩(wěn)定，可溶性蛋白質(zhì)的含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當(dāng)酶解過程中的pH 為8.0 時， 酶解羽毛粉的可溶性蛋白質(zhì)含量和胃蛋白酶消化率都達(dá)到最高，綜上選擇復(fù)合酶解過程中的 pH 為 8.0。

圖2 反應(yīng)pH 對可溶性蛋白質(zhì)含量及胃蛋白酶消化率的影響

2.3 反應(yīng)溫度對酶解效果的影響 脂肪酶和堿性蛋白酶的最適反應(yīng)溫度不同， 復(fù)合酶解時的溫度也會影響羽毛最終的酶解效果。如圖3 所示，在30 ~ 70 ℃，隨著酶解溫度的升高，羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量和胃蛋白酶消化率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。 當(dāng)酶解溫度為50 ℃時，羽毛酶解效果最好，初步定50 ℃為最適酶解溫度。

圖3 反應(yīng)溫度對可溶性蛋白質(zhì)含量及胃蛋白酶消化率的影響

2.4 酶添加量對酶解效果的影響 酶處理過程中加酶量并不是添加越多效果越好，如圖4 所示，在0.3% ~ 0.9%，隨著加酶量的增大，羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量也越大，但當(dāng)加酶量超過0.9%時，羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量開始下降，可能是酶解過程中產(chǎn)生了競爭性抑制作用 （梁玥等，2016）， 導(dǎo)致羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量下降。綜合羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量和胃蛋白酶消化率，酶添加量初步定為0.9%。

圖4 酶添加量對可溶性蛋白質(zhì)含量及胃蛋白酶消化率的影響

2.5 反應(yīng)時間對酶解效果的影響 酶解時間關(guān)系著最終羽毛粉的產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)周期， 如圖5所示， 羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢， 而胃蛋白酶消化率升高到一定高度后，在此值范圍內(nèi)上下浮動。 當(dāng)酶解4 h 時，羽毛粉的胃蛋白酶消化率和可溶性蛋白質(zhì)含量達(dá)到最大，因此酶解時間初步定為4 h。

圖5 酶解時間對可溶性蛋白質(zhì)含量及胃蛋白酶消化率的影響

2.6 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化酶解工藝

2.6.1 工藝優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定均勻設(shè)計(jì)因素水平（表2）。根據(jù)均勻設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表3。 以羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量（Y1）和胃蛋白酶消化率（Y2）為響應(yīng)值，利用 DPS7.0 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析， 得到4 個因素的多元回歸方程。

表2 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

表3 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

以可溶性蛋白質(zhì)含量為響應(yīng)值，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析， 得回歸方程為Y1=2214.549401-80.65020661X2-12.268269481X1X1+0.4420199222X2X2-1.3107131072X4X4+4.064112090X1X2-2.5480299694X1X4+0.6275776043X2X4-1.7147225711X3X4，對模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，其中相關(guān)系數(shù)R=0.9999，F(xiàn) 值=1081.09，顯著水平 P=0.0235（<0.05），方程顯著，說明該模型擬合程度較好，模型預(yù)測最佳工藝參數(shù)即反應(yīng)pH 7.39， 反應(yīng)溫度46 ℃， 酶添加量0.92%，酶解時間3.49 h，預(yù)測可溶性蛋白質(zhì)含量最優(yōu)結(jié)果165.05 mg/g。

以胃蛋白酶消化率為響應(yīng)值， 對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸分析，得到回歸方程為Y2=168.7741174+0.08892878258X2-176.94330551X3+117.57496705X3X3-0.19109925296X4X4-0.6254987871X2X3+2.4554021423X3X4， 對模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，其中相關(guān)系數(shù) R=0.9999，F(xiàn) 值=3274.05， 顯著水平P=0.0001（<0.01），方程顯著，說明該模型擬合程度好，模型預(yù)測最佳工藝參數(shù)即反應(yīng)pH 7.50，反應(yīng)溫度46 ℃，酶添加量0.7%，酶解時間 4.3 h，預(yù)測胃蛋白酶消化率90.33%。

通過試驗(yàn)結(jié)果可知， 兩個評價指標(biāo)下對應(yīng)的最佳工藝參數(shù)并不完全一致， 其中酶添加量和酶解時間相差較大， 考慮到實(shí)際生產(chǎn)周期和生產(chǎn)便捷性，在兩者最優(yōu)工藝參數(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行微調(diào)，調(diào)整后的工藝參數(shù)為反應(yīng)pH 7.5， 反應(yīng)溫度46 ℃，酶添加量0.9%，酶解時間3.5 h。

2.6.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 以市售水解羽毛粉作為對照，將均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化后的參數(shù)應(yīng)用于羽毛酶解工藝中，對得到的酶解羽毛粉進(jìn)行測定。 結(jié)果如表4 所示，酶解羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量為157.35 mg/g，胃蛋白酶消化率為90.07%， 與預(yù)測結(jié)果基本吻合。 優(yōu)化工藝后的酶解羽毛粉比市售水解羽毛粉中的可溶性蛋白質(zhì)含量提高了1224.49%，胃蛋白酶消化率提高了57.85%。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.7 羽毛粉感官及組成指標(biāo)評價

2.7.1 羽毛粉感官評價 經(jīng)酶解處理得到的羽毛粉與市售水解羽毛粉進(jìn)行對比。 從外觀和氣味上來看， 酶解羽毛粉呈淡黃色， 顆粒大小均一，粉質(zhì)細(xì)膩均勻，基本無腥味；市售羽毛粉顆粒粗糙，腥味較重。 鏡檢結(jié)果顯示，市售羽毛粉視野中存在大量未被水解的羽毛桿， 說明羽毛水解不徹底； 酶解羽毛粉視野中顆?；玖６染鶆?，結(jié)團(tuán)膠粒較少。

2.7.2 優(yōu)化工藝后羽毛粉中多肽分子量分布 采用凝膠過濾色譜測定優(yōu)化后羽毛粉與市售羽毛粉中肽分子質(zhì)量分布，結(jié)果如表5 所示，經(jīng)酶解后的羽毛粉中多肽和寡肽占比升高，其中<5000 Da 的多肽占比達(dá) 92.42% ， 遠(yuǎn)高于市售羽毛粉（63.17%），經(jīng)優(yōu)化酶解工藝處理后的羽毛粉中絕大多數(shù)角蛋白已被酶解成多肽和氨基酸。

表5 羽毛粉中分子質(zhì)量分布峰面積占比 %

3 小結(jié)

本處理工藝使用低濃度的羽毛預(yù)處理劑浸泡， 配合短時間的高溫處理打開角蛋白間的二硫鍵，以復(fù)合酶解的方式酶解羽毛表層的脂質(zhì)，使角蛋白與堿性蛋白酶充分接觸， 最終不僅提高了羽毛粉的胃蛋白酶消化率， 而且加快了酶解時間，提高了生產(chǎn)效率。 目前市售品質(zhì)較好的國產(chǎn)魚粉胃蛋白酶消化率為80%左右， 經(jīng)優(yōu)化工藝處理后的羽毛粉體外胃蛋白酶消化率達(dá)到了90.07%， 在一定程度上可作為優(yōu)質(zhì)的蛋白飼料源替代魚粉。

本研究通過單因素試驗(yàn)和均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化提高胃蛋白酶消化率的羽毛粉加工工藝， 確定最優(yōu)的酶解工藝為反應(yīng)pH 7.5，反應(yīng)溫度46 ℃，堿性蛋白酶添加量0.9%，脂肪酶添加量0.3%，酶解時間3.5 h，此時可溶性蛋白質(zhì)含量為157.35 mg/g，胃蛋白酶消化率為90.07%。 該工藝處理下的羽毛粉顆粒均勻， 無腥味， 小于5000 Da 的多肽占比達(dá)92.42%。 該工藝對酶解羽毛粉的生產(chǎn)提供了參考，也對開發(fā)高附加值的羽毛肽粉具有重要的意義。