尼泊爾酸模根部多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

李欣燃， 陳玉萍， 石云麗， 王緒英， 翁貴英

（六盤水師范學院生物科學與技術學院，貴州六盤水 553000）

尼泊爾酸模（Rumex nepalensis Spreng）為廖科酸模屬多年生草本植物，具有抗菌、消炎、通便、抗?jié)兊榷喾N藥理作用（Woretaw 等，2021；文樂等，2019；Lopamudra 等，2003；Ghosh 等，2003），在我國主要分布于云、貴、川以及西藏等地（彭毅，2013），是一種傳統中草藥。 鑒于酸模屬植物具有一定的飼用價值（閻宏等，2002；霍貴成等，1997），因此， 尼泊爾酸模亦可作為飼料加以開發(fā)利用。多酚類化合物是植物體內重要的次級代謝產物，其應用于飼料中可改善動物生產性能， 提高動物的抗炎及免疫力以及改善常見畜禽的肉品質 （蔣步云等，2014）。目前，對于尼泊爾酸模多酚類化合物的提取工藝及其抗氧化活性尚鮮見報道。

本研究通過超聲輔助的提取方法分別檢測尼泊爾酸模根、莖及葉三個部位總多酚的含量，并采用響應面法對多酚含量最高的部位進行提取工藝優(yōu)化， 同時通過檢測羥自由基和DPPH 自由基的清除率來對多酚提取物的抗氧化活性進行評價，以期為該植物的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 本試驗所用材料采自六盤水市水城區(qū)， 經鑒定為廖科酸模屬草本植物尼泊爾酸模，樣品經洗凈、風干、粉碎后，過40 目篩備用。沒食子酸 （純度≥99%）， 生工生物工程有限公司；DPPH（純度>97%），北京索萊寶科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與試劑 TD5 離型心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；UV-2100B 型紫外分光光度計， 北京東西分析儀器有限公司；GL2204B 型電子天平， 上海佑科儀器儀表有限公司；SB-800DT型超聲波清洗機，寧波新芝生物有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的構建 稱取沒食子酸標準品0.125 g 于 250 mL 容量瓶中， 用蒸餾水定容至刻度，混勻備用，得到濃度為0.5 mg/mL 的沒食子酸標準液。 移液器準確吸取標準品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 于 25 mL 容量瓶中，依次加入蒸餾水5 mL，酒石酸亞鐵溶液5 mL 后，再用pH 7.5 的磷酸鹽緩沖液補齊至25 mL，混勻、靜置15 min 后于540 nm 波長測量上述各標準品吸光度，得到標準曲線 y=14.704x-0.0227（R2=0.9971）。 其尼泊爾酸模多酚得率計算公式如下：

尼泊爾酸模多酚得率/%=提取液中多酚質量/待測樣品質量×100。

1.3.2 根莖葉含量比較 取尼泊爾酸模根、莖、葉三個部位樣品各1 g，在超聲時間40 min，乙醇體積分數 50%，料液比 1∶100（g/mL）的條件下分別進行超聲提取，檢測并比較各部位多酚得率，選取得率最高的部位進行后續(xù)試驗。

1.3.3 單因素試驗 選取尼泊爾酸模多酚含量最高部位依次進行單因素試驗。 當乙醇體積分數為50%，料液比為 1∶100（g/mL），分別檢測超聲時間為 20、30、40、50、60、70 min 時尼泊爾酸模選取部位的多酚得率；當料液比為 1∶100（g/mL），超聲時間為40 min， 分別檢測乙醇體積分數為 30%、40%、50%、60%、70%、80%時尼泊爾酸模選取部位的多酚得率；當超聲時間為40 min，乙醇體積分數為 50%，分別檢測料液比為 1∶70、1∶80、1∶90、1∶100、1∶110、1∶120（g/mL）時尼泊爾酸模選取部位的多酚得率。

1.3.4 響應面法試驗 依據單因素試驗結果，以多酚得率為響應值， 結合Box-Behnken 設計原理，進行響應面優(yōu)化試驗，并進一步對其進行工藝驗證。

1.3.5 抗氧化活性檢測 將尼泊爾酸模選取部位的多酚提取液進行梯度稀釋，依次為0.6、0.5、0.4、0.3 mg/mL 以及0.2 mg/mL，并對各濃度提取液進行羥自由基清除試驗和DPPH 清除試驗， 同時以抗壞血酸作為平行對照。

2 結果與分析

2.1 尼泊爾酸模中各部位多酚得率 由圖1 可知，分別將尼泊爾酸模根、莖及葉各部位多酚得率進行比較后發(fā)現，根部多酚得率為6.92%，顯著高于莖部（4.37%）和葉部（5.99%）多酚得率，故后續(xù)試驗選取尼泊爾酸模根部作為研究對象， 進行多酚提取條件的優(yōu)化。

2.2 單因素試驗結果 選取尼泊爾酸模根部進行單因素試驗。 對于超聲時間而言（圖2），當達到40 min 時，多酚得率最高，為6.95%，隨著超聲時間延長，多酚得率略微有所下降，可能是由于超聲時間的延長會導致少量多酚類化合物的破壞；對于料液比而言（圖 3），當比例為 1∶80（g/mL）時，多酚得率達到最高，為6.95%，隨著料液比的增加，多酚得率基本不變， 說明在此條件下多酚化合物已基本析出； 對于乙醇體積分數而言 （圖4），在50%時多酚得率達到最高，為6.90%，隨著乙醇體積分數的增加，多酚得率反而降低，可能是此時有機溶劑與多酚類化合物的極性最接近， 多酚得率最高。

圖2 超聲時間對多酚得率的影響

圖3 料液比對多酚得率的影響

圖4 乙醇體積分數對多酚得率的影響

2.3 多酚提取工藝優(yōu)化

2.3.1 Box-Behnken 設計結果 根據尼泊爾酸模根部多酚提取的單因素試驗結果， 采用Box-Behnken 設計原理對影響其多酚得率三個因素進行響應面優(yōu)化，具體結果見表1。

表1 Box-Behnken 試驗設計與結果

2.3.2 回歸模型及方差分析 通過Design-Expert.8.0.6 對表1 中尼泊爾酸模根部多酚得率相關數據進行分析，得到多元回歸擬合方程為Y =-141.51550 +0.21948A +2.63588B +0.25100C +2.35000×10-3AB+3.67500×10-3AC-8.25000×10-4BC-8.04500×10-3A2-0.013345B2-4.42000×10-3C2。

由表2 可知，該模型P < 0.05，差異極顯著，失擬誤差無顯著差異， 表明該模型與實際擬合度較好。 模型中 B、A2和 B2表現為差異極顯著，C 表現為差異顯著，A、AB、AC、BC 和 C2表現為無差異， 三個因素對尼泊爾酸模根部多酚得率的影響大小因素依次為B＞C＞A， 即料液比＞乙醇體積分數＞提取時間。

表2 響應面試驗結果方差分析表

2.3.3 響應面圖形分析 各因素交互作用對尼泊爾酸模根部多酚得率的影響情況詳見圖5。 可以發(fā)現各響應面坡度變化較為平緩， 說明時間和料液比、時間和乙醇體積分數、料液比和乙醇體積分數之間交互作用對尼泊爾酸模根部多酚影響作用不顯著。

圖5 各交互因素對多酚得率影響的響應面

2.3.4 驗證試驗 根據響應面法得到尼泊爾酸模根部多酚的最佳提取工藝為：超聲時間41.50 min，料液比 1∶104.13（g/mL），乙醇體積分數 55.37%，其多酚得率的預測值為7.21%。 為方便實際生產試驗過程中應用操作，將以上操作條件簡化為：超聲時間 42 min，料液比 1：104（g/mL），乙醇體積分數55%，進行三次平行操作取平均值，得到尼泊爾酸模根部多酚的平均得率為7.24%， 其與預測值（7.21%）的標準偏差為0.41%。

2.4 抗氧化活性檢測 尼泊爾酸模根部多酚提取液抗氧化活性檢測結果如圖6 所示。 羥自由基清除能力和DPPD 自由基清除能力與Vc 的變化趨勢基本一致，隨著多酚含量的減少清除率降低。同時多酚提取液的清除活性略低于Vc。 經過計算， 尼泊爾酸模根部多酚的羥自由基和DPPH 自由基的清除率IC50值分別為0.36 mg/mL 和0.28 mg/mL，表明其具有較好的抗氧化活性。

圖6 多酚提取物和抗壞血酸對羥自由基及DPPH 自由基清除試驗

3 結論

尼泊爾酸模根部多酚提取的最佳條件為超聲時間 42 min，料液比 1∶104（g/mL），乙醇體積分數55%，此時多酚得率為7.24%，與預測得率7.21%的標準偏差為0.41%，說明優(yōu)化的工藝可靠。提取物對羥自由基和DPPH 自由基的清除率IC50值分別為0.36 mg/mL 和0.28 mg/mL，表明其具有較好的抗氧化活性。 研究結果可為尼泊爾酸模的進一步開發(fā)利用提供理論參考。