調(diào)衡方對Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤組織與肺組織Foxp3、IL-10、TGF-β表達(dá)的影響

譚芷芬，張宏方，于鵬龍，王志航，徐洋洋，王媛媛，張怡敏

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046)

中藥方劑多靶點調(diào)節(jié)免疫抗腫瘤的機(jī)制日益成為研究的熱點，復(fù)方中藥(方劑)在惡性腫瘤治療方面顯示出諸多優(yōu)勢并已得到醫(yī)學(xué)界的公認(rèn)。近年來研究表明腫瘤微環(huán)境中CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平明顯升高，該細(xì)胞與相關(guān)免疫抑制因子共同構(gòu)建的免疫抑制微環(huán)境與腫瘤的進(jìn)展存在密切關(guān)系[1]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞既可調(diào)節(jié)抑制周圍免疫細(xì)胞，又可產(chǎn)生白細(xì)胞介素-10(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等免疫細(xì)胞抑制因子，造成瘤組織中免疫細(xì)胞不作為，尤其是TGF-β調(diào)節(jié)抑制作用最為明顯，其可誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+Treg細(xì)胞，且可降低其周圍環(huán)境中所有免疫細(xì)胞的增殖與分化。而IL-10抑制免疫系統(tǒng)的作用可通過多重機(jī)制產(chǎn)生[2]。有研究表明轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是CD4+CD25+Treg細(xì)胞最可靠的特征性標(biāo)記，它介導(dǎo)了胸腺和外周CD4+CD25+Treg細(xì)胞的發(fā)育，無論是胸腺還是外周起源的CD4+CD25+Treg細(xì)胞都能特異性地表達(dá)Foxp3，因此Foxp3可以作為衡量人體中CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量多少的一個重要指標(biāo)[3]。經(jīng)典名方理沖湯源于清代張壽甫《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，調(diào)衡方為加減取舍了理沖湯的個別藥味而化裁出有抑瘤與調(diào)節(jié)荷瘤體免疫功能的方藥[4-10]。該方的粗多糖不僅可提升樹突狀細(xì)胞提呈抗原的能力，還可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞與紅細(xì)胞免疫功能[4-6]。但調(diào)衡方對荷瘤體免疫抑制性細(xì)胞的作用影響仍不清楚，故本實驗以小鼠血清、瘤組織與肺組織中Foxp3、IL-10、TGF-β的表達(dá)為靶點，從調(diào)控荷瘤體免疫抑制性細(xì)胞活性等途徑切入，探討調(diào)衡方對荷瘤體免疫抑制性細(xì)胞調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 雄性C57BL/6小鼠，潔凈級二級，體重(20±2)g，鼠齡6～8周，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，合格證號：SCXK(陜)2018-009，在陜西中醫(yī)藥大學(xué)生物技術(shù)與免疫實驗中心飼養(yǎng)(二級潔凈實驗室)。所有實驗操作均符合動物倫理學(xué)要求。

1.2細(xì)胞株、試劑和主要儀器 Lewis肺癌細(xì)胞株購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI1640(Gibco)，胎牛血清(FBS，購自美國omiga)，胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)含酚紅購于武漢普諾賽生命科技有限公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)干粉購于北京索萊寶科技有限公司，兔抗小鼠Foxp3、兔抗小鼠TGF-β、兔抗小鼠IL-10均購于武漢博士德生物工程有限公司。即用型SABC-POD(兔IgG)試劑盒、DAB顯色試劑盒(黃)購于武漢博士德生物工程有限公司，TGF-β、IL-10 ELISA試劑盒購于江蘇晶美生物科技有限公司。CCB-150型CO2培養(yǎng)箱(BinDer公司)，S200倒置顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司)，酶標(biāo)儀(美國BioTeK Epoch公司)，L530離心機(jī)(賽特湘儀公司)，賽多利斯電子天平(made by Sartorius)，SW-CJ-2FD單人雙面超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，HH-S2s數(shù)顯恒溫水浴箱(金壇市大地自動化儀器廠)，DHG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海-恒科技有限公司)，pH值測定儀(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，培養(yǎng)細(xì)胞用培養(yǎng)瓶與培養(yǎng)板(Coming公司)，細(xì)胞計數(shù)板(上海市求精生化試劑儀器有限公司)，ImagePro plus 6.0型半定量圖形分析版軟件(MediaCybernetic公司)。

1.3實驗用藥 經(jīng)理沖湯加減化裁的調(diào)衡方組方:花旗參15 g、生黃芪30 g、莪術(shù)10 g、水蛭3 g、白花蛇舌草30 g、生山藥30 g、天花粉12 g、川天冬10 g、生雞內(nèi)金10 g。各味中藥經(jīng)陜西中醫(yī)大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科主任中藥師王凡鑒定，均符合2015版《中國藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。按中藥煎藥規(guī)定要求，將調(diào)衡方組方加工制成流浸膏(3 g生藥/mL)，分裝滅菌置2～10 ℃冰箱備用。貞芪扶正膠囊,甘肅新蘭藥藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字J201810501。給藥劑量用人與小鼠體表面積折算公式換算。

1.4分組、模型制備及干預(yù)方法 采用體重隨機(jī)分組法將C57BL/6小鼠分為正常組、荷瘤組、貞芪組、調(diào)衡方低劑量組、調(diào)衡方中劑量組、調(diào)衡方高劑量組，每組10只。取生長旺盛的Lewis肺癌細(xì)胞，將細(xì)胞濃度為6.5×106個/mL的瘤細(xì)胞0.2 mL接種于每只小鼠的右側(cè)腋窩皮下。接種24 h后，貞芪組給予貞芪扶正膠囊41.5 g/kg(生藥量為0.83 g)灌胃，調(diào)衡方低、中、高劑量組分別給予調(diào)衡方流浸膏12.5 g/kg、25 g/kg、50 g/kg灌胃，荷瘤組給予等容量生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)8 d。

1.5樣本的收集與處理 實驗結(jié)束后脫頸處死各組小鼠，經(jīng)心臟取血，隨后將血液樣本靜置2h，3 000 r/min室溫離心15 min，取上清液待檢；取小鼠瘤組織與肺組織，使用4%多聚甲醛固定24 h，用于后續(xù)HE染色與免疫組織化學(xué)染色檢查。

1.6觀察指標(biāo)及方法

1.6.1瘤組織與肺組織HE染色觀察 取制備好的瘤組織與肺組織石蠟切片，置于烘箱中60 ℃烤1～2 h，常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水，蘇木精5 min染色，染色時間依據(jù)具體情況而定，流水沖洗并去余色。0.7%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，返藍(lán)，隨后伊紅染色、脫水：常規(guī)二甲苯透明，中性樹脂封片，避免氣泡。光鏡下觀察。

1.6.2血清IL-10、TGF-β水平檢測 取待檢血清，按ELISA試劑盒說明書操作，使用酶標(biāo)儀(BioTeK Epoch)，在450 nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。

1.6.3瘤組織與肺組織中Foxp3、IL-10、TGF-β表達(dá)免疫組化檢測 將制備好的組織樣本置于二甲苯中，脫臘至水，加EDTA 抗原修復(fù)緩沖液(pH 9.0)，在修復(fù)盒中進(jìn)行抗原修復(fù)， 置于3%過氧化氫溶液中避光孵育25 min，PBS緩沖液洗滌。滴加SABC試劑，37 ℃恒溫箱中靜置20 min，甩去多余的液體。分別加配置好的一抗Foxp3(1∶200稀釋)、IL-10(使用濃度為10 μg/mL)、TGF-β(1∶200稀釋)，37 ℃，1 h；PBS液(pH 7.2～7.6)每次2 min。洗滌 3次，滴加對應(yīng)的二抗，室溫下50 min，PBS液(pH 7.2～7.6)每次2 min。洗滌 3次，滴加DAB顯色液，蘇木素輕度復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明、封片，室溫下干燥，顯微鏡下觀察Foxp3、TGF-β、IL-10表達(dá)情況并拍照，出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性表達(dá)，用半定量圖形分析軟件ImagePro plus 6.0計算其面積陽性表達(dá)率。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠瘤組織中瘤細(xì)胞形態(tài) HE染色顯示：荷瘤組瘤細(xì)胞壞死面積很少，有少量的凋亡瘤細(xì)胞；調(diào)衡方各組多處瘤細(xì)胞核固縮、瘤細(xì)胞凋亡與壞死，且見瘤細(xì)胞膜嚴(yán)重變形，其胞膜皺縮不完整，膜上有許多突起，在瘤組織小血管周圍與瘤組織邊緣處癌細(xì)胞殘留壞死物隨處可見，尤其是調(diào)衡方高、中劑量組明顯；貞芪組凋亡瘤細(xì)胞與壞死瘤細(xì)胞面積較調(diào)衡方各組少，但多于荷瘤組。見圖1。

圖1 荷瘤各組小鼠瘤組織HE染色表現(xiàn)(×400)

2.2各組小鼠肺組織細(xì)胞形態(tài) HE染色顯示：正常組小鼠肺泡邊界輪廓清楚，未見腫瘤灶；荷瘤組小鼠肺組織可見細(xì)胞排列混亂的腫瘤轉(zhuǎn)移灶，細(xì)胞形狀不規(guī)則，分布集中，細(xì)胞核大、染色深，病理性的核分裂較多，染色較深，腫瘤實、間質(zhì)間邊緣不清；調(diào)衡方低劑量組肺組織可見腫瘤細(xì)胞，有腫瘤轉(zhuǎn)移灶形成跡象，調(diào)衡方中、高劑量組未見明顯的腫瘤細(xì)胞聚集，且隨給藥劑量的增大肺泡邊界越發(fā)清晰，細(xì)胞排列與正常肺組織形態(tài)越接近；貞芪組肺泡邊界輪廓較清楚，偶見腫瘤轉(zhuǎn)移灶，較荷瘤組少，較調(diào)衡方中、高劑量組稍多。見圖2。

圖2 正常組和荷瘤各組小鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×400)

2.3各組小鼠血清IL-10、TGF-β水平比較 荷瘤組血清IL-10、TGF-β水平均明顯高于正常組(P均<0.05)；貞芪組和調(diào)衡方各組血清IL-10、TGF-β水平均明顯低于荷瘤組(P均<0.05)，調(diào)衡方高劑量組均明顯低于調(diào)衡方低、中劑量組(P均<0.05)；調(diào)衡方各組血清IL-10水平與貞芪組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，調(diào)衡方高劑量組血清TGF-β水平明顯低于貞芪組(P<0.05)。見表1。

表1 正常組和荷瘤各組小鼠血清IL-10、TGF-β水平比較

2.4各組小鼠瘤組織中Foxp3、IL-10、TGF-β表達(dá)情況 免疫組化染色顯示，F(xiàn)oxp3蛋白表達(dá)多呈彌散性分布，少數(shù)局灶性，IL-10和TGF-β蛋白陽性定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿或胞膜及間質(zhì)中；貞芪組和調(diào)衡方各組Foxp3、IL-10、TGF-β蛋白表達(dá)陽性率均明顯低于荷瘤組(P均<0.05)，調(diào)衡方高劑量組均明顯低于調(diào)衡方低劑量組和貞芪組(P均<0.05)。見圖3～6。

圖3 荷瘤各組小鼠瘤組織中Foxp3表達(dá)情況(免疫組化染色，×400)

圖4 荷瘤各組小鼠瘤組織中IL-10表達(dá)情況(免疫組化染色，×400)

圖5 荷瘤各組小鼠瘤組織中 TGF-β表達(dá)情況(免疫組化染色，×400)

圖6 荷瘤各組小鼠瘤組織中Foxp3、IL-10、TGF-β陽性表達(dá)率比較

2.5各組小鼠肺組織中Foxp3、IL-10、TGF-β表達(dá)情況 正常組顯示Foxp3蛋白表達(dá)極少，細(xì)胞胞漿或胞膜及間質(zhì)中未見明顯IL-10和TGF-β蛋白陽性表達(dá)。荷瘤組肺組織中Foxp3、IL-10、TGF-β陽性表達(dá)率明顯高于正常組(P均<0.05)；貞芪組和調(diào)衡方各組Foxp3、IL-10、TGF-β陽性表達(dá)率均明顯低于荷瘤組(P均<0.05)，且調(diào)衡方高劑量組Foxp3、IL-10、TGF-β均明顯低于調(diào)衡方低劑量組(P均<0.05)。見圖7～10。

圖7 正常組和荷瘤各組小鼠肺組織中Foxp3表達(dá)情況(免疫組化染色，×100)

圖8 正常組和荷瘤各組小鼠肺組織中IL-10表達(dá)情況(免疫組化染色，×100)

圖9 正常組和荷瘤各組小鼠肺組織中TGF-β表達(dá)情況(免疫組化染色，×100)

圖10 正常組和荷瘤各組小鼠肺組織中Foxp3、IL-10、TGF-β陽性表達(dá)率比較

3 討 論

腫瘤歸屬中醫(yī)“癥瘕”“積聚”“瘤”“巖”“惡瘡”“癌毒”等范疇，正氣虧虛為癌毒起病、發(fā)展的必要條件，癌毒內(nèi)結(jié)為腫瘤發(fā)生的重要病機(jī)和物質(zhì)基礎(chǔ)。復(fù)方中藥調(diào)衡方具有益氣生血養(yǎng)陰、清熱解毒、活血祛瘀之功效，“益氣解毒化瘀”能增加機(jī)體的“正氣”；“益氣”可直接扶助正氣；“解毒”能減少邪氣對正氣的耗傷；“化瘀活血”能夠祛除局部瘀血阻滯，消除積聚或癥瘕，恢復(fù)病灶的血液循環(huán)，使瘀血去，新血生，化生正氣[11]。本實驗以Lewis肺癌細(xì)胞建立轉(zhuǎn)移性癌瘤模型，進(jìn)一步探討了調(diào)衡方對荷瘤體免疫抑制性細(xì)胞調(diào)節(jié)作用及其分泌抑制性細(xì)胞因子的影響。

肺癌等惡性腫瘤體周圍免疫細(xì)胞及腫瘤微環(huán)境中各種免疫細(xì)胞功能低下，尤其是Treg等抑制性細(xì)胞增多與其釋放的抑制性細(xì)胞因子 IL-10、TGF-β等分泌增加，是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的主要原因之一。Treg等抑制性免疫細(xì)胞可促進(jìn) IL-10、TGF-β等抑制性細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)一步抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞對腫瘤的免疫應(yīng)答，從而加速腫瘤的病理進(jìn)展[12-14]；Treg細(xì)胞也可通過與腫瘤干細(xì)胞(CSCs)相互作用增強(qiáng)腫瘤免疫耐受，促進(jìn)腫瘤發(fā)展[15]。細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是CD4+CD25+Treg的自然標(biāo)志物，并控制其生成與功能的發(fā)揮[16]，CD4+CD25+Treg可以促進(jìn)CTLA4和PD-L1、IL-10、TGF-β等抑制性因子高表達(dá)而發(fā)揮免疫抑制作用。多個研究證實IL-10與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)[17-18]。另外從癌變前的腫瘤發(fā)展成轉(zhuǎn)移性疾病通常伴隨著TGF-β的激活或表達(dá)增加[19]，發(fā)揮全身免疫抑制作用，癌癥晚期階段TGF-β可誘發(fā)許多活動促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增長、入侵和轉(zhuǎn)移[20]。隨著腫瘤的進(jìn)展，機(jī)體所產(chǎn)生的CD4+CD25+Treg增多，進(jìn)而釋放大量的炎性介質(zhì)，隨之而來的是瘤細(xì)胞組織對周圍正常細(xì)胞器官的擠壓及瘤細(xì)胞新生血管的大量增生，惡病質(zhì)增多，腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞不作為而致的免疫功能低下及紊亂。本實驗發(fā)現(xiàn)，調(diào)衡方能夠下調(diào)荷瘤小鼠瘤組織與肺組織中Foxp3的表達(dá)，從而有效抑制CD4+CD25+Treg對機(jī)體的免疫抑制作用，改善腫瘤微環(huán)境中免疫抑制情況，從而達(dá)到抗腫瘤的目的。調(diào)衡方各組血清IL-10、TGF-β水平及瘤組織、肺組織中二者陽性表達(dá)率均明顯低于荷瘤組，表明調(diào)衡方能抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠肺臟轉(zhuǎn)移，其抗瘤抑瘤作用與下調(diào)抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，調(diào)衡方對Lewis肺癌荷瘤體的作用可能與其下調(diào)Foxp3、IL-10、TGF-β表達(dá)，改善腫瘤微環(huán)境中免疫抑制狀況有關(guān)，這為腫瘤免疫治療開辟了新的途徑。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。