遺傳密碼子擴展技術在蛋白質及多肽類藥物中的應用*

高曉威 韋思平 王 欽

（西南醫(yī)科大學藥學院，瀘州 646000）

蛋白質參與包括細胞骨架、生物催化、信號轉導、轉錄調控、物質運輸?shù)仍趦鹊乃猩飳W過程，其幾乎全部由20 種天然氨基酸（canonical amino acids，cAAs）組成［1］。蛋白質功能的多樣性由20種cAAs的排列組合及側鏈間的相互作用共同決定。在自然界中通過對蛋白質進行翻譯后修飾（如甲基化、乙酰化、磷酸化、糖基化等），可向蛋白質中引入新的化學基團進一步豐富蛋白質的功能；同時，一些蛋白質只有在輔酶存在或者結合金屬離子的情況下才能發(fā)揮正常的生物學功能［2］，這表明20種cAAs提供的有限化學基團在某些情況下并不能夠完全滿足蛋白質功能的需求，而引入新的化學基團有望豐富蛋白質的物理化學性質，產生新的生物學功能。

非天然氨基酸（noncanonical amino acids，ncAAs）種類繁多，其結構與性質的多樣性遠超cAAs。通過插入ncAAs 來提高蛋白質或者多肽的生物化學特性已見諸許多報道［3］。鑒于ncAAs 在蛋白質研究和應用中的巨大潛力，研究人員目前已開發(fā)出多種向蛋白質或多肽中插入ncAAs 的技術。其中固相肽合成（solid?phase peptide synthesis）可用于合成不超過50個氨基酸殘基的含ncAAs多肽；通過內含肽（intein）技術將合成的短肽共價相連可獲得較大分子質量的含ncAAs 蛋白質［4］。無細胞翻譯系統(tǒng)（cell?free translation systems）亦可用來合成含ncAAs 的蛋白質，該技術的關鍵在于首先要在體外制備能被核糖體識別的裝載有ncAAs的氨酰tRNA［5］。研究表明，有些與cAAs 結構類似的ncAAs能夠在胞內被相應的氨酰tRNA合成酶（aminoacyl tRNA synthetase，aaRS）識別并裝載到特定tRNA上［6］。在某種cAA營養(yǎng)缺陷型菌株的培養(yǎng)基中加入該cAA 的結構類似物（ncAA），菌體內的翻譯系統(tǒng)可將其錯誤地插入到整個蛋白質組中［7］。該方法有可能擾亂菌體內一些關鍵蛋白質的功能，存在細胞毒性，降低目標蛋白產量。上述方法盡管均可有效制備含ncAAs 的蛋白質或多肽，但都具有各自的局限性，比如非位點特異性、不可持續(xù)且生產成本高、只能應用于cAAs 結構類似物等。遺傳密碼子擴展技術（genetic code expansion）能夠有效克服上述局限性，實現(xiàn)在生物體內向蛋白質或多肽中位點特異性插入各種ncAAs［2］。

遺傳密碼子擴展技術首次由美國Scripps 研究所Peter G Schultz 教授領導的研究組建立起來［8］。研究人員目前已可利用該技術將200多種含有不同功能側鏈基團的ncAAs位點特異性地插入到各類蛋白質中［2］。遺傳密碼子擴展技術已被廣泛應用于生物醫(yī)藥、蛋白質工程、合成生物學、結構生物學等諸多生物學領域，為一些重大生命科學問題的研究與解決提供了極大便利。本文將重點關注遺傳密碼子擴展技術的前沿進展及其在各類抗體、細胞因子以及抗菌肽等蛋白質及多肽類藥物中的應用，同時也對其衍生的新型生物治療手段進行簡單闡述。

1 遺傳密碼子擴展技術

1.1 原理

遺傳密碼子擴展技術是指通過在生物體內引入外源正交aaRS/tRNA 對，借助特殊密碼子（如UAG、UAGA 等）向目的蛋白中位點特異性插入ncAAs（圖1）［8］。目前應用較為廣泛的外源aaRS/tRNA 對包括來源于古生菌詹氏甲烷球菌（Methanococcus jannaschii）的酪氨酰aaRS/tRNA對（MjTyrRS/tRNA）、巴氏甲烷八疊球菌（Methanosarcina barkeri）的吡咯賴氨酰aaRS/tRNA 對（MbPylRS/tRNA），以及來源于大腸桿菌（E.coli）的酪氨酰aaRS/tRNA對（EcTyrRS/tRNA）和亮氨酰aaRS/tRNA 對（EcLeuRS/tRNA）（表1）［9］。其中MjTyrRS/tRNA 對可在原核生物中應用，EcTyrRS/tRNA 對和EcLeuRS/tRNA 對可在真核生物中應用，而MbPylRS/tRNA對在原核生物和真核生物中均可應用。以野生型外源aaRS/tRNA對為基礎，通過構建突變體庫并在宿主細胞中進行基于特定ncAAs 的正負篩選，獲得與內源性aaRS/tRNA 對和cAAs 不存在交叉反應且能特異性識別ncAAs 的突變體是遺傳密碼子擴展技術的關鍵所在［8］。遺傳密碼子擴展技術首次在E.coli中獲得成功，目前其應用已實現(xiàn)從單細胞到多細胞、從低等到高等物種的跨越［10］。研究人員已經(jīng)能夠利用遺傳密碼子擴展技術在乳酸乳球菌、結核分支桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、委內瑞拉鏈霉菌、哺乳動物細胞、人造血干細胞、線蟲、果蠅、斑馬魚、擬南芥、小鼠等物種中定點插入ncAAs（表1）。盡管遺傳密碼子擴展技術應用潛力巨大，但其自身仍有多方面的局限性需要突破才能實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)應用。

Fig.1 Principles of genetic code expansion and its applications in protein and peptide related drugs圖1 遺傳密碼子擴展技術原理及其在蛋白質、多肽相關藥物中的應用

Table 1 Orthogonal tRNA/synthetase pairs used in different hosts表1 不同物種中使用的外源正交aaRS/tRNA對

1.2 提高ncAAs整合效率

目前在遺傳密碼子擴展技術中使用頻率最高的密碼子為琥珀密碼子（UAG），該密碼子在蛋白質翻譯過程中被釋放因子1（release factor 1，RF1）所識別，介導新生多肽鏈的翻譯終止［41］。正交aaRS/tRNA對需要在蛋白質翻譯的過程中與RF1競爭性識別mRNA 上的UAG 密碼子才能獲得含ncAAs的全長蛋白質，因此含ncAAs蛋白質的表達量一般只有野生型的10%～20%［10］。為了解決這一問題，研究人員嘗試了采用不同的方法敲除RF1基因，避免RF1 對UAG 密碼子識別導致翻譯提前終止。通過將E.coli中7 個必需基因（coaD、had、hemA、mreC、murF、lolA和lpxK）的終止密碼子UAG 替換為UAA，Sakamoto 課題組［42］成功敲除了RF1基因。通過將框內UAG 自調節(jié)元件（in?frame UAG autoregulation element）失活并將RF2中的T246 突變?yōu)锳，Wang 課題組［43］同樣也成功敲除了RF1基因。利用RF1 敲除菌株作為表達宿主，含ncAAs 蛋白質的產量，尤其是多位點插入ncAAs蛋白質的產量，得到了顯著提高。但值得注意的是，這兩種RF1敲除菌株的生長速率都明顯下降。利用多元自動化基因組編輯技術（multiplex automated genome engineering）和基因組接合組裝技術（conjugative assembly genome engineering），Isaacs 課題組［44］將E.coliMG1655 中所有已知UAG密碼子全部替換成了UAA并將RF1基因進行了敲除，成功構建了菌株E.coliC321.ΔA。在菌株E.coliC321.ΔA 中，UAG 已不再作為終止密碼子發(fā)揮功能而是成為了一個空白密碼子。以E.coliC321.ΔA作為表達宿主，可將含ncAAs蛋白質的產量提高至與野生型相當。我們近期從轉錄組和蛋白質組學的角度分析了UAG 密碼子重排對E.coli生理特性的影響，并通過向基因組中整合T7 RNA聚合酶系統(tǒng)進一步提高了E.coliC321.ΔA 菌株含ncAAs蛋白質的表達能力［45］。

由于遺傳密碼子擴展技術使用的正交aaRS/tRNA 對均為外源性的，其在宿主細胞中的活性往往偏低。通過增加正交aaRS/tRNA對在細胞內的基因拷貝數(shù)和調整啟動子強度，提高正交aaRS/tRNA對的表達量，可在一定程度上提高含ncAAs蛋白質的產量［46］。Isaacs 課題組［47］在E.coli中利用多元自動化基因組編輯技術對正交aaRSs進行了定向進化，顯著提高了酶活性和特異性，將含ncAAs蛋白質的產量提高了25 倍。他們利用進化后的aaRS/tRNA 對獲得了最多含有30 個ncAAs 插入的蛋白質。Liu 課題組［48］利用噬菌體輔助的連續(xù)進化技術（phage assisted continuous evolution）分別對PylRS 和TyrRS 進行定向進化，顯著提高了酶的催化效率和底物特異性。類似地，S?ll 課題組［49］利用噬菌體輔助的非連續(xù)進化技術（phage assisted noncontinuous evolution）對PylRS 進行了定向改造，獲得了活性和特異性顯著提高的突變體。通過不同策略提高ncAAs在宿主細胞內的濃度（如過表達宿主細胞的氨基酸轉運酶、將ncAAs以二肽的形式添加至培養(yǎng)基等），亦可增加含ncAAs 蛋白質的產量［50］。氨?；膎cAA?tRNA 需要延伸因子（elongation factor thermo?unstable，Ef?tu）輔助才能進入核糖體參與蛋白質的合成。然而ncAA?tRNA并不是Ef?tu的天然底物，這導致二者的識別和結合效率偏低。通過對Ef?tu 進行工程化改造提高其對非天然底物的親和力可有效提高含ncAAs蛋白質的產量［51］。

1.3 同一多肽鏈中整合不同ncAAs

遺傳密碼子擴展技術一般只能向蛋白質中插入單種ncAA，這主要是由兩方面的原因造成的：a.缺乏相互正交的外源aaRS/tRNA對；b.缺乏介導不同ncAAs 插入的密碼子。前期研究表明，MjTyrRS/tRNA對與PylRS/tRNA對相互正交，可用于向同一多肽鏈中插入兩種不同ncAAs［18］。Chatterjee 課題組［52］和Chin 課題組［53］分別采用不同的方法獲得了三重正交aaRS/tRNA對，實現(xiàn)了向同一多肽鏈中插入3種不同ncAAs。從頭設計產生多重相互正交的aaRS/tRNA 對亦獲得了一定突破［54］。最近，Lin 課題組［55］通過蛋白質工程將MbPylRS/tRNA對中賦予其正交性的結構元件轉移至E.coliHisRS/tRNA 對中，獲得了新的正交嵌合aaRS/tRNA對，為正交aaRS/tRNA對的構建提供了新的思路。要想實現(xiàn)向同一多肽鏈中插入多種ncAAs，除需要多重相互正交的aaRS/tRNA 對之外，還需要更多介導ncAAs插入的密碼子。受菌株E.coliC321.ΔA的啟發(fā)，目前多個研究小組正通過不同的基因組工程技術將E.coli基因組中編碼特定cAAs的密碼子進行同義替換，從而實現(xiàn)對64個三堿基密碼子進行壓縮和重排，產生更多的空白密碼子用于ncAAs的插入［56?57］。截止目前，在E.coli基因組中已有7個三堿基密碼子實現(xiàn)了同義替換，并被用于介導ncAAs 的插入［58］。通過設計四堿基密碼子介導ncAAs的插入亦見諸多報道，將四堿基密碼子廣泛應用于遺傳密碼子擴展技術可有效解決介導ncAAs插入密碼子數(shù)量不足的問題，然而宿主細胞中的翻譯系統(tǒng)對四堿基密碼子的識別效率較低且無法避免對四堿基密碼子中前三個堿基的錯誤識別。Chin課題組［59］通過對核糖體進行工程化改造獲得了正交核糖體Ribo?Q，顯著提高了含ncAAs蛋白的產量，同時也為工程化改造獲得有效解碼四堿基密碼子的正交核糖體提供了研究思路。通過向E.coli基因組中引入非天然堿基（X，Y）獲得自然界中不存在的密碼子，并將其用于遺傳密碼子擴展技術介導ncAAs的插入同樣也獲得了成功［60］。

1.4 原位合成ncAAs

現(xiàn)階段遺傳密碼子擴展技術主要依賴于人為外源添加ncAAs 才能獲得含相應ncAAs 的蛋白質。若某些ncAAs 價格昂貴則勢必會增加含ncAAs 蛋白質的生產成本。通過蛋白質工程（protein engineering）或代謝通路工程（metabolic pathway engineering）改造宿主細胞原位合成ncAAs，并將其直接用于蛋白質合成可有效解決這一問題。Xiao課題組［61］通過引入來源于委內瑞拉鏈霉菌（Streptomyces venezuelae）的代謝通路實現(xiàn)了在E.coli中有效合成對氨基苯丙氨酸（p?amino?phenylalanine，pAF），利用遺傳密碼子擴展技術將其插入到單鏈抗體中與熒光探針偶聯(lián)可用于細胞成像。該課題組還通過引入來源于野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris）的苯丙氨酸4?羥基化酶（phenylalanine 4?hydroxylase）和輔酶再生系統(tǒng)成功實現(xiàn)了在E.coli中合成5? 羥基色氨酸（5?hydroxytryptophan，5?HTP）［62］。Liu 課題組［63］通過工程化改造E.coli中Cys合成路徑并向培養(yǎng)基中補加各種廉價芳香硫醇，實現(xiàn)了合成50 種ncAAs。同樣地，L?磷酸蘇氨酸（O?phospho?L?threonine）、L?二羥基苯丙氨酸（3,4?dihydroxy?L?phenylalanine）和S?烯丙基L?半胱氨酸（S?allyl?L?cysteine）等ncAAs 均實現(xiàn)了在E.coli中生物合成并直接用于遺傳密碼子擴展技術生產含ncAAs 的蛋白質［64?66］。隨著越來越多的新穎酶分子以及代謝通路被發(fā)掘，更多的ncAAs 將能夠被生物合成并直接用于遺傳密碼子擴展技術。隨著遺傳密碼子擴展技術在上述各個環(huán)節(jié)的瓶頸問題得以突破，該技術的應用也日趨多樣化，有望為下一代蛋白質及多肽類藥物的開發(fā)提供技術支持。

2 在蛋白質及多肽類藥物中的應用

2.1 抗體偶聯(lián)藥物

抗體是體內獲得性免疫應答的重要組成部分，對抗原具有優(yōu)異的識別特異性和親和力。將抗體與其他毒性小分子或者治療性藥物通過一定方式連接到一起，制備成抗體偶聯(lián)藥物（antibody?drug conjugates，ADCs），可有效提高藥物的靶向性，實現(xiàn)向腫瘤等病灶組織精確遞藥，降低藥物毒副作用（圖1）。目前有超過175種ADCs正在開展臨床試驗，超過10 種ADCs 已成功上市［67?68］。盡管ADCs在包括癌癥等人類重大疾病的治療中表現(xiàn)出了巨大的應用潛力，但是其安全性和有效性一直受到制備技術的制約。傳統(tǒng)ADCs主要依賴于抗體分子中的Cys 或Lys 殘基與親電子基團反應形成共價交聯(lián)實現(xiàn)藥物分子的裝載。由于抗體分子中Cys和Lys殘基數(shù)量較多，往往無法與配體基團形成均一的化學修飾，造成藥物與抗體的偶聯(lián)比率（drug?to?antibody ratios，DAR）和偶聯(lián)位點不均一、不固定。通過還原抗體分子內部的二硫鍵暴露Cys殘基進行化學修飾則會影響抗體分子的穩(wěn)定性［69］。因此傳統(tǒng)方法制備的ADCs是不穩(wěn)定的混合物，其可能同時含有未裝載藥物的抗體以及過量裝載藥物的抗體。未裝載藥物的抗體會與裝載藥物的抗體競爭性結合目標抗原，減弱ADCs的療效，而過量裝載藥物的抗體則會導致ADCs 發(fā)生沉淀、毒性增加、血清穩(wěn)定性降低等［70］。傳統(tǒng)方法制備的ADCs在體內的有效性、安全性、免疫原性、半衰期、親和力、藥物動力學等性質可能會受到不同生產批次的影響。實現(xiàn)抗體和藥物定點偶聯(lián)，制備均一的ADCs有望解決這一問題。Mallet課題組［71］通過定點突變引入反應性Cys 并減少抗體分子中非必需Cys 殘基的數(shù)量（the engineered thio monoclonal antibody，THIOMAB）首次制備出了均一的ADCs。該 ADCs（THIOMAB antibody?drug conjugates）與非均一ADCs 相比顯示出了更高的劑量耐受性和血清穩(wěn)定性，有效提高了藥物的治療窗濃度范圍。然而抗體中引入的Cys會與其他含巰基物質或者抗體分子間形成二硫鍵從而影響偶聯(lián)，同時許多基于Cys形成的加合物在生理條件下并不穩(wěn)定，這限制了THIOMAB 技術在ADCs 中的應用。通過蛋白質標簽（protein tagging）和酶催化等技術同樣也實現(xiàn)了均一化ADCs的制備，但考慮到抗體上偶聯(lián)位點的選擇對ADCs的有效性和安全性具有重要影響，而這些方法對抗體上的修飾位點選擇性有限，可能會影響對ADCs 的進一步優(yōu)化［72］。

利用遺傳密碼子擴展技術位點特異性插入ncAAs制備均一化ADCs具有以下明顯優(yōu)勢：a.遺傳密碼子擴展技術可實現(xiàn)在抗體分子中任意一個或者多個位點插入ncAAs，實現(xiàn)藥物偶聯(lián)位點的自由選擇；b.借助ncAA側鏈上的生物正交化學官能團（如疊氮基、炔基、酮基、鹵代基等）不僅可以建立起抗體與藥物分子之間穩(wěn)定、高效、高特異性的定點偶聯(lián)，而且還可以使偶聯(lián)反應多樣化，允許更多不同化學結構的藥物用于ADCs 的制備（圖2）［73］。Schultz 研究組［74］利用遺傳密碼子擴展技術向曲妥珠單抗（trastuzumab）中引入L乙?；奖彼幔??acetyl?L?phenylalanine，pAcF），使其與烷氧基胺修飾的藥物auristatin F形成肟鍵制備成功了DAR 為2 的均一化ADCs。與非均一化ADCs 相比，該ADCs在小鼠腫瘤移植模型中具有消除Her2陽性腫瘤的能力，并且展現(xiàn)出了偶聯(lián)效率高、安全性能好、血清清除率低等優(yōu)點。隨后該方法被成功用于制備治療前列腺癌、腎癌以及癌癥轉移等疾病的均一化ADCs。Chin 課題組［75］利用遺傳密碼子擴展技術將含有環(huán)丙烯基團的Lys 衍生物CypK 插入到曲妥珠單抗中，隨后通過Diels?Alder反應實現(xiàn)了與藥物auristatin E的定點偶聯(lián)，顯著提高了偶聯(lián)反應的速率，提高了均一化ADCs 的產量。Sapra研究組［76］將正交EcTyrRS/tRNA 對基因整合到中國倉鼠卵巢癌細胞（Chinese hamster ovary，CHO）基因組中，構建了穩(wěn)定的重組細胞系4E2，將含ncAAs 抗體產量提升至1 g/L，為均一化ADC 的大規(guī)模生產提供了極大便利。

憑借ncAAs結構與化學性質的多樣性，遺傳密碼子擴展技術不僅可以實現(xiàn)ADCs 的均一化制備，而且還可以極大豐富ADCs的種類與功能。隨著眾多含有不同生物正交化學官能團的ncAAs被用于遺傳密碼子擴展技術，越來越多在生理條件下穩(wěn)定的偶聯(lián)反應，如疊氮?炔環(huán)加成（azide?alkyne cycloaddition）、點擊化學（click chemistry）等被用于制備均一化ADCs［77］。通過遺傳密碼子擴展技術引入兩種不同的ncAAs既可以實現(xiàn)在單個抗體分子中裝載兩種具有協(xié)同作用的藥物提高ADCs的效力，又可以在單個抗體中實現(xiàn)同時裝載藥物分子和熒光探針用于ADCs 在組織細胞中的熒光成像。Schultz研究組［78］通過遺傳密碼子擴展技術分別將pAcF 和疊氮化賴氨酸類似物（azido?lysine analog，pAzK）插入到anti?Her2 IgG抗體的重鏈和輕鏈上，成功制備了能同時偶聯(lián)毒性藥物分子和熒光探針的均一化ADCs。該課題組還通過遺傳密碼子擴展技術將pAcF 位點特異性插入到anti?Her2 IgG 抗體中與小干擾RNA（small interfering RNAs，siRNAs）偶聯(lián)，成功制備出了能夠沉默腫瘤細胞內基因表達的ADCs 藥物，并且他們發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)位點對該ADC分子的活性影響較大［79］。Guo課題組［80］利用遺傳密碼子擴展技術將含疊氮基團ncAA定點引入到利妥昔單抗（rituximab）中，通過與雙功能臂DIBO?DOTA 發(fā)生click 反應成功制備出了有放射性核素64Cu 標記的ADCs，其具有腫瘤成像和放射性免疫治療的應用前景。除了用于抗擊腫瘤外，目前由遺傳密碼子擴展技術制備的均一化ADCs還被用于其他疾病的治療。Schultz研究組［81］通過遺傳密碼子擴展技術將免疫抑制劑——達沙替尼（dasatinib）定點偶聯(lián)到能夠與造血干細胞（hematopoietic stem cells）表面抗原CXCR4高效結合的人源化抗體HLCX上，制備的ADCs能夠有效避免達沙替尼靶向性不足而產生的毒副作用，可用于治療T細胞活化引起的免疫紊亂。利用遺傳密碼子擴展技術將甲狀腺激素受體激動劑與靶向肝臟的抗體進行定點偶聯(lián)可用于非酒精性脂肪肝炎的治療［82］。此外，相關ADCs 還被應用于治療其他炎癥及代謝性疾病［2］。目前基于ncAAs 偶聯(lián)構建的ADCs數(shù)量約占臨床試驗ADCs的4%，我們認為憑借遺傳密碼子擴展技術的優(yōu)勢未來將有更多基于ncAAs的ADCs被應用［67］。

2.2 雙特異性抗體

雙特異性抗體（bispecific antibody）是基因工程抗體的一種，具有兩個不同的抗原結合位點，可發(fā)揮類似于免疫突觸（immunological synapse）的功能。雙特異性抗體能夠同時結合靶細胞（通常為腫瘤細胞）和功能細胞（通常為T 細胞），增強對靶細胞尤其是免疫原性較低的腫瘤細胞的殺傷作用（圖2）。雙特異性抗體結構獨特、功能多樣，已被用于病毒性傳染病的酶聯(lián)免疫檢測、體內組織細胞成像、腫瘤免疫治療以及穿透血腦屏障治療神經(jīng)退行性疾病等領域［82］。目前大量雙特異性抗體藥物仍處于臨床試驗階段，至少有3種雙特異性抗體藥物已獲批上市。2009 年由歐盟批準上市的雙特異性抗體——卡妥索單抗（catumaxomab）可用于治療EpCAM 陽性腫瘤導致的惡性腹水［83］。2014 年由美國批準上市的博納吐單抗（blinatumomab）是首個具有雙特異性T 細胞接合器（bispecific T cell engager）結構的雙特異性抗體，可同時結合T細胞的CD3受體和淋巴癌細胞的CD19受體，用于治療前體B 細胞急性淋巴細胞白血?。?4］。該抗體藥物于2015 年在歐盟批準上市。由羅氏公司（Roche）開發(fā)的雙特異性抗體——艾美賽珠單抗（emicizumab）于2017 年在美國批準上市，并于2018 年獲得FDA 認證。該抗體藥物是首個非凝血因子類血友病藥物，可用于預防體內不含VIII因子抑制物的血友病頻繁出血，為血友病的治療提供了新的解決方案［85］。雖然與普通抗體相比，雙特異性抗體表現(xiàn)出了優(yōu)異的靈敏度、特異性以及多靶點靶向能力，但其面臨著表達量低、容易聚集、血清半衰期短、副作用強等缺點［85］。

Fig.2 Applications of genetic code expansion in antibody-related drugs圖2 遺傳密碼子擴展技術在抗體類相關藥物中的應用

傳統(tǒng)雙特異性抗體的構建方法主要依賴于將兩個抗原結合區(qū)的編碼基因進行融合表達，然而這將限制二者的空間排列并可能對穩(wěn)定性、有效性、選擇性產生影響［86］。利用遺傳密碼子擴展技術在兩個抗原結合區(qū)中引入ncAAs，通過正交反應與不同長度的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）連接臂相連可對二者在空間位置和距離上進行調控。Schultz 研究組［87］利用遺傳密碼子擴展技術將pAcF 定點插入到anti?CD3 和anti?Her2 抗體的Fab區(qū)，隨后與一端為氨氧基、另一端為疊氮或環(huán)辛烷基團的PEG 連接臂通過兩步反應進行共價連接，成功制備了anti?HER2/anti?CD3 Fab雙特異性抗體。只需皮摩爾級濃度的anti?HER2/anti?CD3 Fab 即可引導T細胞對Her2+陽性腫瘤細胞進行選擇性殺傷，該抗體同樣對低表達Her2+的腫瘤細胞顯示出了較強的抑制作用。利用相同的策略，Schultz 研究組［88］還成功制備出了雙特異性抗體anti?CLL1/anti?CD3，用于急性髓系白血病的治療。Young 研究組［89］向anti?BCMA 和anti?CD3 抗體Fab 區(qū)中定點引入pAcF 并利用Diels?Alder 反應實現(xiàn)了二者之間的高效交聯(lián)，成功制備的雙特異性抗體BiFab?BCMA，能夠介導T細胞識別成熟B細胞抗原，特異性殺傷惡性多發(fā)性骨髓瘤細胞，為多發(fā)性骨髓瘤的耐藥性問題提供了新的治療手段。

鑒于Watson?Crick 堿基配對具有高度特異性，利用寡核苷酸鏈作為連接臂進行雙特異性抗體的快速構建同樣取得了成功。Smider研究組［90］利用遺傳密碼子擴展技術將pAcF 位點特異性地插入到anti?Her2 或anti?CD20 抗體片段的Fab 區(qū)并與一端經(jīng)過氨氧基修飾的寡核苷酸鏈或者肽核苷酸鏈進行正交反應，隨后與攜帶有anti?CD3 Fab區(qū)的反義寡核苷酸鏈或肽核苷酸鏈進行互補配對形成完整連接臂，成功制備的雙特異性抗體分別用于乳腺癌和淋巴癌的治療。利用該策略可以快速制備雙特異性抗體，甚至可以制備出異源多價特異性抗體用于提高抗體藥物的有效性。

基于ncAAs 的正交反應可以突破通過傳統(tǒng)基因融合方式產生雙特異性抗體的限制，將具有靶向作用的小分子與抗體片段Fab連接到一起，制備成均一的小分子/Fab 雙特異性抗體（small?molecule?antibody conjugate，SMAC）（圖2）。Zn2+依賴金屬蛋白酶PSMA在前列腺癌細胞表面大量表達而在正常組織中的表達水平極低，是理想的前列腺癌分子標志物。DUPA（2?［3?（1,3?dicarboxy propyl）?ureido］pentanedioic）是PSMA 的高效抑制劑，通過與PSMA 結合抑制其酶活性［91］。Schultz 研究組［92］利用遺傳密碼子擴展技術將pAcF 定點引入到anti?CD3 抗體片段Fab 中并將其與DUPA 通過連接臂相連，制備成了DUPA/anti?CD3 雙特異性抗體。DUPA/anti?CD3不僅在體外對前列腺癌細胞展現(xiàn)出了高效地選擇性殺傷作用，而且在小鼠腫瘤移植模型中也顯現(xiàn)出了良好的安全性和延長的血清半衰期。葉酸受體（folate receptor）在許多炎癥細胞和腫瘤細胞（如卵巢癌和非小細胞肺癌等）表面過度表達，其對葉酸具有極強的親和力。該研究組采用相同的策略成功制備了葉酸分子/anti?CD3 Fab雙特異性抗體并將其用于靶向葉酸受體高表達的癌癥治療，同樣獲得了較好的實驗結果［93］。

2.3 基于蛋白質開關控制的細胞治療

與傳統(tǒng)的放化療相比，免疫細胞療法具有靶向性好、毒副作用小等特點。嵌合抗原受體T細胞免疫療法（chimeric antigen receptor T?cell immune?therapy，CAR?T）在癌癥治療中表現(xiàn)出了巨大潛力，工程化T細胞表面的scFv抗體能夠靶向識別體內腫瘤組織，特異性殺傷腫瘤細胞。目前該療法已被FDA 批準用于急性淋巴細胞白血病的治療［94］。然而工程化T細胞在體內的不可控性可能導致嚴重后果，包括引起細胞因子釋放綜合癥（cytokine release syndrome）以及長效B細胞發(fā)育不全等［95］。為了解決這一問題，Young 課題組［96］和Cao 課題組［97］設計了一種基于遺傳密碼子擴展技術的蛋白質“開關分子”，實現(xiàn)了在體內對工程化T 細胞活性的調控。該“開關分子”由異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）和靶向腫瘤細胞的小抗體分子組成，二者通過基于ncAAs的正交反應共價相連（圖2）。工程化T細胞在體內不再直接靶向腫瘤細胞，而是特異性識別蛋白質“開關分子”中的FITC，隨后由蛋白質“開關分子”介導其對腫瘤細胞的識別和殺傷。該方法能夠使人們通過控制蛋白質“開關分子”在體內的濃度來精細調控工程化T 細胞的活性，避免了CAR?T 在體內的不可控性。同時只需對“開關分子”中的小分子抗體進行簡單替換，即可實現(xiàn)將工程化T細胞靶向不同腫瘤細胞，避免了對工程化T 細胞進行重復改造。

通過誘導劑控制治療性蛋白質的表達可用于多種疾病的治療。目前研究人員主要通過誘導劑控制轉錄水平的應答來實現(xiàn)對治療性蛋白質表達的調控。這種調控方式響應速度慢，并不能夠完全滿足對疾病治療的需求。Liu 課題組［98］近期開發(fā)出了一種基于遺傳密碼子擴展技術的治療開關系統(tǒng)（ncAA triggered therapeutic switch，NATS），實現(xiàn)了在翻譯水平上對治療性蛋白質表達的控制，并成功將其用于小鼠糖尿病的治療。他們將遺傳密碼子擴展系統(tǒng)以及含有UAG 終止密碼子的胰島素基因同時整合進工程化細胞中，隨后將該工程化細胞移植到小鼠體內，通過飼喂含有相應ncAA的飼料實現(xiàn)了對工程化細胞中胰島素表達的精準調控，有效降低了小鼠的血糖水平。

2.4 具有共價交聯(lián)活性的蛋白質藥物

與靶點存在共價交聯(lián)機制的藥物一般具有選擇性高、藥效持久、藥代動力學性質優(yōu)良等特點，因此共價交聯(lián)藥物的開發(fā)一直備受關注。由于小分子化合物藥物易于通過化學合成或修飾添加各種反應官能團，一段時間以來共價交聯(lián)藥物的研發(fā)主要聚焦于一些小分子化合物。一般小分子共價交聯(lián)藥物會與靶點蛋白的口袋或活性中心特異性結合并與其中的Lys 或Cys 殘基側鏈發(fā)生交聯(lián)形成共價鍵［99］。值得注意的是，小分子共價交聯(lián)藥物并不適合用于干擾蛋白質與蛋白質之間的相互作用（protein?protein interactions，PPIs），這是因為PPIs 往往發(fā)生在面積高達數(shù)百埃的界面上，遠超小分子共價交聯(lián)藥物的作用能力。PPIs 與諸多生命過程密切相關，包括信號轉導、分化調控以及大分子合成等。PPIs 紊亂會導致多種疾病的發(fā)生［100］。以干擾PPIs為目標設計藥物已被證實是治療一些炎癥疾病的有效手段。受抗原?抗體特異性相互作用啟發(fā)，研究人員認為以同為大分子的多肽或蛋白質為基礎設計藥物有望成為干擾PPIs，治療相關疾病的有效手段。

與小分子共價交聯(lián)藥物類似，若蛋白質或多肽類藥物能夠與其靶點共價連接，有望提高藥物的選擇性并增強藥效。然而20 種cAAs 僅Cys 能夠在沒有酶催化的情況下形成二硫鍵。二硫鍵在生理條件下易受還原勢的影響，不適合用于共價交聯(lián)蛋白藥物的開發(fā)［101］。通過向蛋白質或多肽中引入含有正交反應官能團的ncAAs 有望解決這一問題。Pellecchia研究組［102］利用固相肽合成將Lys?丙烯酰胺插入到靶向E3 泛素連接酶Siah 的短肽BI?107D1中，發(fā)現(xiàn)具有共價交聯(lián)活性的BI?107D1 肽能夠更好地抑制Siah 的活性，有望用于由Siah 誘發(fā)的癌癥的治療。采用相同的策略，BIM肽被設計成為共價交聯(lián)肽靶向致癌蛋白Bcl2A1，表現(xiàn)出了極好的位點選擇性［103］。在人類癌癥中腫瘤蛋白Mdm2 和Mdm4 會與腫瘤抑制蛋白p53 發(fā)生相互作用導致其失活。Wang 課題組［104］將含芳基磺酰氟的氨基酸（aryl sulfonyl fluoride，Ar?SO2F）插入到靶向腫瘤蛋白Mdm2 和Mdm4 的短肽SAHp53?8 中制成了共價交聯(lián)肽，成功干擾了p53 與Mdm2/4 之間的相互作用。他們還發(fā)現(xiàn)該共價肽對Mdm4的選擇性明顯高于Mdm2，而野生型SAHp53?8 對二者的親和力是相同的。隨后又有靶向不同PPIs 的共價交聯(lián)肽被設計合成出來，其優(yōu)點也得到越來越多的驗證。

由于固相肽合成只能用于合成相對較短的多肽，這導致該方法不能夠用于大分子共價交聯(lián)蛋白藥物的開發(fā)，而遺傳密碼子擴展技術有望解決這一問題。為避免共價交聯(lián)蛋白藥物中ncAAs 與胞內其他蛋白質組分發(fā)生無區(qū)別的交聯(lián)反應干擾細胞功能，Wang 課題組［105?108］率先提出了鄰近觸發(fā)化學共價交聯(lián)（proximity?triggered chemical crosslinking）的概念并合成了一系列新型ncAAs，包括含鹵代烷烴的EB3、含全氟苯的F?PSCaa、含氟乙酰胺的FAcK 以及含芳基氨基甲酸酯的FPheK等。這些ncAAs 在生理條件下不會與胞內低濃度游離的cAAs 或蛋白質發(fā)生交聯(lián)，只有含ncAAs 的共價交聯(lián)蛋白藥物與靶蛋白成功建立起穩(wěn)定的相互作用，ncAA以適當方向接近其靶點cAA時才會激發(fā)共價交聯(lián)反應的發(fā)生。該課題組最近利用遺傳密碼子擴展技術開發(fā)出了第一種共價交聯(lián)蛋白藥物用于癌癥的治療［109］。人程序性死亡蛋白?1（PD?1）是位于T 細胞膜表面可調控T 細胞活性的轉膜受體。PD?L1 可與PD?1 發(fā)生相互作用抑制T 細胞增殖活化，導致腫瘤特異性T細胞衰竭和凋亡，其往往在不同腫瘤細胞表面過度表達（圖3）。使用外源PD?1競爭性阻斷體內T細胞上PD?1分子與腫瘤細胞上PD?L1分子間的相互作用可用于癌癥免疫治療。Wang 課題組將氟磺酸?L?酪氨酸（4?flourosulfate?L?tyrosine，F(xiàn)SY）通過遺傳密碼子擴展技術定點引入到PD?1 中制備成了可發(fā)生共價交聯(lián)的蛋白藥物PD?1（FSY）。FSY 可在PD?1（FSY）與PD?L1 發(fā)生相互作用時與PD?L1 上特定的His殘基發(fā)生共價交聯(lián)（圖3）。他們發(fā)現(xiàn)，不管是體內還是體外，PD?1（FSY）都比野生型PD?1表現(xiàn)出了更好的抗腫瘤活性［109］。利用蛋白水解靶向嵌合體（proteolysis?targeting chimera methodology，PROTAC）降解腫瘤源性蛋白可用于癌癥的治療。Chen 課題組［110］通過遺傳密碼子擴展技術向anti?PD?L1納米抗體中引入FYS，構建了能夠與PD?L1 形成共價交聯(lián)蛋白藥物GlueTAC。GlueTAC能夠與腫瘤細胞表面的PD?L1形成共價交聯(lián)，促進PD?L1的內吞和在溶酶體中的降解，有效緩解PD?L1造成的腫瘤細胞免疫逃逸。共價交聯(lián)蛋白藥物概念的提出以及遺傳密碼子擴展技術的應用將蛋白藥物的設計與開發(fā)提升到了新的高度。

Fig.3 The mechanisms of PD-1（FSY）in cancer treatment圖3 共價蛋白藥物PD-1（FSY）治療腫瘤的原理示意圖

2.5 治療性蛋白疫苗

遺傳密碼子擴展技術為治療性疫苗和預防性疫苗的開發(fā)提供了開創(chuàng)性解決方案，有望在疫苗領域引起一場新的技術革命。一般人體內免疫系統(tǒng)不會對自身蛋白質產生免疫應答的現(xiàn)象稱之為免疫耐受，自身免疫耐受可有效防止自免疫疾病的發(fā)生［111］。然而在某些情況下打破自身免疫耐受，引導免疫系統(tǒng)靶向自身蛋白質有助于包括癌癥、慢性炎癥以及骨質疏松等多種疾病的治療［112?113］。通過向自身蛋白質中引入新的抗原表位或者進行大量化學修飾可在一定程度上打破自身免疫耐受激活體內免疫應答，但同時有可能對目標蛋白的折疊產生影響［114］。機體在受到病毒感染以及發(fā)生炎癥時會通過氧化應激反應引發(fā)自身某些蛋白質中的Tyr殘基發(fā)生翻譯后修飾形成硝基酪氨酸（nitrotyrosine）和磺基酪氨酸（sulfotyrosine），目前這一過程被證實與機體打破免疫耐受，誘發(fā)自身免疫疾病相關。隨后研究人員發(fā)現(xiàn)硝基和磺基在體內具有較強免疫原性，是打破自身免疫耐受的關鍵所在。因此，一些含硝基或者磺基的ncAAs，包括p?nitro?L?phenylalanine（pNO2F）、3?nitro?L?tyrosine（3?NO2Y）和p?sulfo?L?phenylalanine（pSO3F）被認為可用于治療性蛋白疫苗的開發(fā)（圖4）［115?116］。

腫瘤壞死因子?α（TNF?α）是在機體炎癥發(fā)生過程中扮演重要角色的多功能細胞因子，被認為與多種炎癥疾病相關，包括克羅恩病和類風濕性關節(jié)炎等。以TNF?α為靶點，打破其自身免疫耐受，誘導免疫系統(tǒng)產生中和TNF?α抗體被認為可用于多種炎癥疾病的治療。Smider課題組［117?118］利用遺傳密碼子擴展技術將小鼠mTNF?α中第11位Lys或第86位Tyr 殘基定點突變成pNO2Phe 后，mTNF?α 產生了新的抗原決定簇，有效打破了自身免疫耐受，產生了能夠同時識別突變體及野生型mTNF?α的高效價抗體。他們發(fā)現(xiàn)pNO2Phe在mTNF?α中的突變位置對能否打破自身免疫耐受至關重要。為了明確pNO2Phe86?mTNF?α 的作用，他們分別將接種了野生型mTNF?α 和突變體pNO2Phe86?mTNF?α 的小鼠進行脂多糖（LPS）處理，發(fā)現(xiàn)免疫接種pNO2Phe86?mTNF?α 后可有效降低小鼠的死亡率。RANKL是TNF家族中的細胞因子，其與能夠分解骨骼組織的噬骨細胞激活有關，是治療骨質疏松癥和類風濕性關節(jié)炎等疾病的潛在靶點［119］。Tao 課題組［120］通過遺傳密碼子擴展技術將RANKL 中第234位和第240位的Tyr殘基突變?yōu)閜NO2Phe后，有效打破了其自身免疫耐受，產生了能夠同時特異性識別野生型和突變體RANKL且在體內持留時間長的高效價抗體。他們隨后還明確了免疫接種pNO2Phe234?mRANKL 后，小鼠的骨質疏松和類風濕性關節(jié)炎癥狀明顯減輕。其他自身蛋白質如補體系統(tǒng)組分5α、蛋白前體轉化酶subtilisin/kexin 9 等同樣可以通過類似的策略打破自身免疫耐受［117］。通過遺傳密碼子擴展技術插入免疫原性強的ncAAs不僅可以用于打破自身免疫耐受，同時還有望提高一些外源蛋白的免疫原性，用于一些感染性疾病的預防和治療。

2.6 預防性衰減疫苗

目前人們主要通過接種滅活或者減毒疫苗來預防一些傳染病。滅活疫苗中的病原體在體內無法復制繁殖，往往需要多次免疫接種才能達到理想的預防效果；而減毒活疫苗在體內能夠正常復制繁殖，只需接種一次就可以獲得較強的免疫應答，但存在減毒病原體通過回復突變重新獲得致病性的使用安全問題。將病原微生物中關鍵蛋白進行基于遺傳密碼子擴展技術的ncAAs 突變，可構建出嚴格依賴ncAAs生長的營養(yǎng)缺陷型突變株。這些突變株由于ncAAs的缺乏而不能在人體內正常復制繁殖，會逐漸消亡（圖4）［67］。將該技術用于疫苗領域具有諸多優(yōu)勢：a.突變株與野生型病原體的結構完全一致，具有與野生型一樣的免疫原性，能夠激發(fā)宿主發(fā)生較強免疫應答；b.在病原微生物必需基因中插入多個ncAAs可有效降低發(fā)生回復突變重新獲得致病性的概率，提高安全性；c.與獲得減毒突變株的傳統(tǒng)方法相比，ncAAs營養(yǎng)缺陷型突變株構建方法簡單且適用范圍較廣。

目前遺傳密碼子擴展技術已被應用于病毒衰減疫苗的研發(fā)。ncAAs營養(yǎng)缺陷型突變病毒株只能夠在相應ncAAs 存在的情況下，在含有正交aaRS/tRNA 對的細胞系中生長繁殖，在人體正常細胞中則不能復制繁殖（圖4）。Guo課題組［121］率先將遺傳密碼子擴展技術用于HIV?1 ncAA 營養(yǎng)缺陷型突變株的構建。他們向HIV?1 不同基因中引入UAG突變，隨后利用含有正交aaRS/tRNA對的轉基因細胞系對HIV?1病毒進行誘導表達，以期能獲得具有感染活性的ncAA營養(yǎng)缺陷型突變株。通過一系列篩選，他們發(fā)現(xiàn)將HIV?1蛋白酶第59位Tyr殘基或將Gag 蛋白第36 位Trp 殘基和第127 位Gln 殘基突變?yōu)閜AzPhe 可保留病毒的自組裝能力和感染性。然而UAG 回復突變?yōu)槠渌辛x密碼子的風險限制了該ncAAs營養(yǎng)缺陷型突變株的進一步應用。為了解決這一問題，該課題組將四堿基密碼子（UAGA）替換了UAG密碼子用于介導ncAAs的插入，大幅降低了ncAAs營養(yǎng)缺陷型突變株發(fā)生回復突變的頻率［122］。除此之外，他們還將編碼正交aaRS/tRNA對的基因整合到HIV?1基因組中，其可在感染過程中與病毒基因組一起插入到機體正常細胞中，隨后可通過控制ncAAs的有無來調控HIV?1在體內的傳代次數(shù)，達到增強免疫的效果［123］。Zhou 課題組［124］利用遺傳密碼子擴展技術向流感病毒（influenza virus）NP蛋白中引入多個UAG突變，成功構建了低逃逸率的流感病毒ncAAs 營養(yǎng)缺陷型突變株。通過多種動物模型實驗，他們發(fā)現(xiàn)獲得的流感病毒ncAAs 營養(yǎng)缺陷型突變株與商品化的疫苗相比具有更強的免疫原性，可激發(fā)宿主免疫系統(tǒng)發(fā)生更強、更廣泛的免疫應答。

利用遺傳密碼子擴展技術構建嚴格依賴ncAAs生長的致病菌同樣獲得了成功。與病毒相比，由于病原菌具有獨立的大分子合成系統(tǒng)，其逃逸頻率，即發(fā)生回復突變的頻率相對更高。目前研究人員已采用多種策略有效解決了這一問題。Isaacs 課題組［125］通過向E.coli22個必需基因中同時引入多個UAG 突變，大幅降低了逃逸頻率。Church 課題組［126］通過計算生物學和基于ncAAs的篩選，獲得了代謝過程嚴格依賴ncAAs的E.coli菌株，有效避免了由基因突變或者水平基因轉移造成的逃逸。Schultz課題組［127?129］通過利用定點突變建立起嚴格依賴ncAAs 的關鍵酶活性位點、關鍵蛋白質間相互作用以及關鍵蛋白質修飾/去修飾的方式同樣大幅降低了逃逸效率。目前嚴格依賴ncAAs 的結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）已被成功構建，其作為活體疫苗預防肺結核的研究也正在進行當中［24］。

Fig.4 Applications of genetic code expansion in the vaccine development圖4 遺傳密碼子擴展技術在疫苗中的應用

2.7 治療性細胞因子的長效化

蛋白質類藥物一般都具有分子質量高、半衰期短、免疫原性強等特點。通過對蛋白藥物進行共價聚乙二醇修飾（PEGylation）可有效提高蛋白藥物的穩(wěn)定性以及在體內的半衰期［130］。過去一般采用對蛋白質N 端氨基、C 端羧基、Lys 的ε?氨基或者Cys的巰基進行修飾。然而對蛋白質末端修飾可能會影響其活性，對內部的Lys 和Cys 殘基進行不加選擇地修飾會導致產物不均一，無法獲得藥效穩(wěn)定的產物并可能影響蛋白藥物的免疫原性［131］。通過遺傳密碼子擴展技術定點引入ncAAs不僅可以獲得均一的PEG 修飾產物，還可以明確不同修飾位點對治療性蛋白性質的影響從而獲得藥效更加優(yōu)良的修飾蛋白。Kimmel 研究組［132］率先利用遺傳密碼子擴展技術向人生長激素（human growth hormone，hGH）不同位點引入pAcF，通過與含氨氧基修飾的PEG 分子形成肟鍵構建了一系列在不同位點實現(xiàn)均一化PEG 修飾的hGH，并對它們的性質進行了比較分析。其中Y35pAcF?hGH 在大鼠模型中與野生型hGH 活性相當并且具有更優(yōu)良的藥代動力學性質，極大提高了hGH 在體內的半衰期。隨后Y35pAcF?hGH 被命名為ARX201，用于成人生長激素缺乏癥（AGHD）的臨床治療并取得了理想效果，有助于大幅降低hGH 的給藥頻率。Zhou 研究組［133］在上述研究的基礎上利用相同的策略對hGH 進行了多位點PEG 修飾，獲得的最終突變體Y35/G131/K145?NEAK 與Y35pAcF 相比具有更低的免疫原性和更優(yōu)良的藥代動力學性質。目前人成纖維細胞生長因子21（FGF21）、牛粒細胞集落刺激因子（GCSF）、干擾素α2b（IFN?α2b）、生長激素受體拮抗劑（GHR antagonists）、白介素?4（interleukin?4，IL?4）等均采用遺傳密碼子擴展技術進行了定點PEG 修飾，在保留了其生物學功能的同時大幅提高了血清半衰期［72］。PEG 雖然能夠有效延長治療性蛋白在體內的半衰期，但研究表明PEG黏附脂質體會激活體內補體系統(tǒng)產生中和PEG抗體，導致二次給藥時PEG 修飾蛋白的血清半衰期縮短，因此有必要尋找性質更加優(yōu)良并可用于蛋白質修飾的聚合物［134］。Meinel 研究組［135］通過遺傳密碼子擴展技術向IL?4中定點引入含炔丙基的賴氨酸類似物（propargyl?L?lysine，Plk）并將其用于聚2?惡唑啉（poly 2?oxazoline，Pox）聚合物修飾，結果表明修飾后的IL?4生物學功能、熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性均未受到影響。

將生長因子、細胞因子以及其他調控因子固定到病灶周圍可在保證治療疾病的同時有效緩解這些治療性蛋白存在的全身毒副作用。利用蛋白質分子內部的Lys 或Cys 殘基固定到介質表面會導致產物不均一、空間排列混亂，影響其藥代動力學性質以及免疫原性［136］。通過遺傳密碼子擴展技術將治療性蛋白位點特異性地固定到載體上，可制備空間排列單一的均一化產物。Meinel研究組［137］利用遺傳密碼子擴展技術將Plk位點特異性插入到成纖維細胞生長因子2（FGF2）中，通過銅催化的疊氮炔環(huán)加成反應將其連接到瓊脂糖顆粒上，制備的固定化Plk?FGF?2可高效促進其周圍人骨肉瘤細胞的增殖。他們采用相同的策略將IL?4 固定到瓊脂糖顆粒上，發(fā)現(xiàn)固定后的IL?4仍具有生物學功能，可有效促進巨噬細胞的分化［138］。該研究組還通過遺傳密碼子擴展技術將Plk 定點插入到胰島素樣生長因子I（IGF?1）中并將其固定到瓊脂糖顆粒上，他們發(fā)現(xiàn)固定化plk?IGF?I比游離IGF?1更能有效促進C2C12細胞肌管形成［139］。Nickel 課題組［140］利用基于ncAAs 的點擊化學反應將骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）固定到含有活化疊氮基的瓊脂糖微珠上，發(fā)現(xiàn)BMP2?K3Plk具有促進其周圍細胞向成骨細胞系分化的潛力。上述研究表明利用遺傳密碼子擴展技術制備固定化蛋白因子有望用于傷口愈合、骨缺陷、類風濕性關節(jié)炎以及動脈硬化癥等疾病的治療。

2.8 抗菌肽

隨著抗生素濫用導致的細菌耐藥性問題日趨嚴重，開發(fā)下一代高效廣譜抗菌藥物已迫在眉睫。抗菌肽（antimicrobial peptide）是一類具有抑菌殺菌功能、帶正電荷的兩親性小分子肽，通常由11～50個氨基酸殘基組成，廣泛存在于微生物以及動植物體內，是宿主天然免疫的重要組成部分?？咕姆N類和數(shù)量繁多，目前已發(fā)現(xiàn)有3 000 多種，被認為是抗生素藥物的理想替代品［141］。一般在生理條件下，抗菌肽的穩(wěn)定性及可溶性較差，易受蛋白酶水解，這限制了其在生物醫(yī)藥行業(yè)中的應用。已有大量研究表明，通過蛋白質工程可有效改良抗菌肽的性質，提高其應用價值［142］。一些抗菌肽以前體的形式被核糖體翻譯出來，隨后通過翻譯后加工修飾形成有活性的形態(tài)，翻譯后修飾的過程往往涉及一些ncAAs的形成。受此啟發(fā)，研究人員認為對抗菌肽進行基于ncAAs 的改造有望獲得穩(wěn)定性、特異性、半衰期、抗菌譜等性質顯著提高的突變體［143］。

目前有關利用遺傳密碼子擴展技術對抗菌肽進行基于ncAAs 改良的研究才剛剛起步。Donk 課題組［144］通過遺傳密碼子擴展技術向抗菌肽lacticin 481和nukacin ISK?1核心區(qū)與前導肽之間定點引入α?羥基酸（alpha hydroxy acid），實現(xiàn)了利用酸堿處理去除前導肽，避免了特異性蛋白酶的使用。Schultz研究組［145］將含有α氯乙酰胺的ncAAs通過遺傳密碼子擴展技術插入乳鏈菌肽A（nisin A）中形成了由硫醚鍵組成的新型環(huán)狀拓撲結構。Link研究組［146］利用遺傳密碼子擴展技術將4 種ncAAs引入抗菌肽MccJ25 結構中，豐富了該抗菌肽的化學多樣性。Süssmuth研究組［147］同樣通過遺傳密碼子擴展技術將5 種ncAAs 插入抗菌肽capistruin 中，利用Hoveyda?Grubbs 催化劑修飾ncAAs 的側鏈基團成功引入了新的化學結構。Young 課題組［25］利用遺傳密碼子擴展技術向抗菌肽thiocillin中引入了一些含有生物物理探針（熒光探針、光交聯(lián)基團）的ncAAs，在提高thiocillin化學多樣性的同時為探測其抗菌機理提供了便利。Donk 課題組［148］將多種ncAAs定點引入到抗菌肽lacticin 481中獲得了抑菌活性顯著提高的突變體。盡管多項研究表明插入ncAAs可能會導致抗菌肽的生物學活性下降，但該領域的先驅們普遍認為向抗菌肽分子內部引入ncAAs必將豐富抗菌肽的化學多樣性，有望開發(fā)出針對新型病原體的殺傷能力。

2.9 病毒載體外殼蛋白修飾

腺病毒（adeno?associated virus，AAV）隸屬于細小病毒科，其基因組為線狀DNA 分子。AAV無明顯致病性，轉導效率高，是基因治療中常用的病毒載體。然而其在體內靶向性差，免疫原性強，血清半衰期短等特點限制了其應用［149］。相關學者通過基于遺傳密碼子擴展技術的多種策略在一定程度上解決了上述問題。Zhou 課題組［150］利用遺傳密碼子擴展技術將Nε?2?azideoethyloxycarbonyl?L?lysine（NAEK）定點插入到衣殼蛋白VP1 中，構建了一系列含有定點PEG 修飾的AAV 突變體并從中獲得了血清穩(wěn)定性提高了2.4 倍的修飾病毒顆粒。Chatterjee 課題組［151］利用遺傳密碼子擴展技術將靶向整合素的環(huán)肽RGD（cyclic?RGD peptide）定點錨定到AAV衣殼蛋白上，顯著提高了AAV對高表達αvβ3整合素受體細胞的識別和轉染。Zhou課題組［152］通過遺傳密碼擴展技術將熒光探針連接到病毒載體上，實現(xiàn)了對病毒顆粒感染細胞及在胞內運輸?shù)目梢暬O(jiān)測。最近，Chatterjee 課題組［153］利用遺傳密碼子擴展技術實現(xiàn)了對AAV 載體感染性的光調控，為未來在使用過程中對AAV 載體的時空調控打下了堅實基礎。他們將AAV2衣殼蛋白VP1 中參與宿主細胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG）結合的關鍵氨基酸殘基（R585，R588）進行了ncAAs 突變，新引入的賴氨酸衍生物NBK 由于正電荷屏蔽作用及空間位阻效應可干擾VP1與HSPG的結合，從而抑制AAV2 的感染性。通過紫外光照射可使NBK脫去保護基團轉變?yōu)長ys，使AAV2恢復感染活性。

3 其他應用

環(huán)肽一般結構緊密，與靶點結合親和力高并能耐受蛋白酶的降解，其在蛋白質抑制劑開發(fā)方面具有重要應用。Schultz研究組［154］將遺傳密碼子擴展技術用于HIV?1蛋白酶抑制劑環(huán)肽的開發(fā)，通過多輪進化篩選，他們發(fā)現(xiàn)將對苯甲酰苯丙氨酸（4?benzoyl?L?phenylalanine，pBzF）定點引入到環(huán)肽G12 中，可誘使G12 與HIV 蛋白酶發(fā)生共價交聯(lián)，顯著抑制其活性。Kawakamide 研究組［155］同樣借助于遺傳密碼子擴展技術獲得了能夠抑制TNF?α功能的環(huán)肽分子。Smider研究組［156］利用噬菌體展示技術和遺傳密碼子擴展技術獲得了對HIV gp120蛋白親和力顯著提高的抗體分子，并且發(fā)現(xiàn)ncAAs 在其中扮演的角色具有不可替代性。目前CRISPR/Cas 已被廣泛應用于基因編輯領域，在未來有望用于人類一些重大遺傳病以及癌癥的治療，然而其潛在的脫靶效應仍待解決。Deiters 研究組［157］利用遺傳密碼子擴展技術向Cas9 中定點插入光保護的賴氨酸（PCK）抑制其活性，隨后通過紫外光照使PCK脫去光保護基團形成Lys恢復活性，實現(xiàn)了在時間和空間上對Cas9 活性的調控。Liu 課題組［158］通過將 4?（2?azidoethoxy）?l?phenylalanine（AeF）定點插入到Cas12 蛋白中并與相應含有二苯并環(huán)辛炔修飾的crRNA 形成共價復合物，顯著提高了Cas12?crRNA 的基因編輯能力，并成功將其用于CAR?T 細胞的制備。此外，遺傳密碼子擴展技術還被廣泛應用于一些病原微生物致病機理的研究。Chen 課題組［159］利用遺傳密碼子擴展技術在一些腸道致病菌中（如E.coli，Shigella，Salmonella）引入一系列光交聯(lián)（photo crosslinking）ncAAs，研究了這些致病菌在感染人體過程中抵御胃酸及分泌毒素的分子機制。Müller課題組［160］利用遺傳密碼子擴展技術以及熒光手段研究了HIV包膜糖蛋白在病毒出芽過程中的作用。Shin課題組［161］利用遺傳密碼子擴展技術對β?N?乙酰己糖氨基酶進行甘露糖?6?磷酸鹽（M6Ps）修飾并將其靶向細胞內的溶酶體，成功用于缺乏內源性β?N?乙酰己糖氨基酶細胞疾病的治療。

4 總結與展望

本文綜述了遺傳密碼子擴展技術近幾年來的研究進展及其在蛋白質及多肽等生物技術藥物中的應用。雖然研究人員目前已經(jīng)能夠通過遺傳密碼子擴展技術將200多種ncAAs位點特異性插入到蛋白質中，但是這些ncAAs 在結構上大多是對Tyr 或Lys結構的延伸，將更多不同化學結構的ncAAs用于遺傳密碼子擴展技術有望擴展該技術的能力。由于真核生物基因組龐大且復雜，現(xiàn)階段通過密碼子重分配提高遺傳密碼子擴展技術在真核生物中的ncAA整合效率、增加含ncAAs蛋白質的產量仍無法獲得突破。由于密碼子和相互正交RS/tRNA對的匱乏，向除E.coli之外的物種中同時插入兩個以上不同的ncAAs依然具有困難。將遺傳密碼子擴展技術應用于更多物種，包括一些特殊致病菌以及高等多細胞生物等仍面臨巨大挑戰(zhàn)。然而隨著合成生物學、化學生物學、分子生物學以及生物化學等學科的不斷發(fā)展與積累并指導遺傳密碼子擴展技術的改良與突破，人類最終有望能夠在細胞中從頭合成全部由ncAAs 組成的非天然聚合物（non?canonical polymers）。隨著計算化學以及計算生物學技術的興起，通過計算模擬輔助遺傳密碼子擴展技術用于蛋白質及多肽藥物的設計將大大提高成功率并有效節(jié)約生產成本。隨著遺傳密碼子擴展技術不斷成熟與發(fā)展，未來其將為諸多生物學問題提供開創(chuàng)性解決方案。