蛋白質(zhì)錯誤折疊相關(guān)疾病的多肽藥物研究進展*

吳 思 張 紅 柯 莎

（1）中國科學(xué)院生物物理研究所，北京 100101；2）中國科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049）

蛋白質(zhì)和多肽在特定條件下可能發(fā)生錯誤折疊，從可溶的天然態(tài)轉(zhuǎn)化為不可溶的淀粉樣聚集態(tài)。蛋白質(zhì)的錯誤折疊和聚集與多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，包括常見的阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）、帕金森氏?。≒arkinson’s disease，PD）、亨廷頓?。℉untington’s disease）等［1?2］。在這些疾病中，均有某種特定多肽或蛋白質(zhì)從具有正常結(jié)構(gòu)的可溶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦缓抡郫B結(jié)構(gòu)的淀粉樣纖維沉積，從而導(dǎo)致細胞正常功能的喪失并引發(fā)細胞毒性。目前為止，已發(fā)現(xiàn)近40 種蛋白質(zhì)或多肽形成的淀粉樣纖維化沉積與退行性疾病相關(guān)，例如：AD 患者腦組織中的淀粉樣斑塊，主要由Aβ40 和Aβ42 多肽聚集形成，而患者神經(jīng)細胞中發(fā)現(xiàn)的纖維纏結(jié)，則主要由Tau 蛋白聚集形成。PD 患者腦神經(jīng)細胞中的Lewy小體，主要由α?synuclein（α?syn）聚集形成［1，3］。這些蛋白質(zhì)在正常生理狀態(tài)下具有不同的功能，例如：Aβ 被認(rèn)為與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護相關(guān)，α?syn 參與調(diào)節(jié)突觸的功能，而Tau 作為微管結(jié)合蛋白，在促進微管組裝和維持其穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用［4?6］。這些蛋白質(zhì)和多肽形成的淀粉樣纖維具有相似的形態(tài)及結(jié)構(gòu)特征，一般直徑約5～20 nm，長度可達數(shù)微米，多肽鏈形成的β 折疊排列方向與纖維的軸向垂直。近年來，隨著冷凍電鏡技術(shù)的突破，使得包括Aβ、α?syn、Tau 等多種退行性疾病相關(guān)的淀粉樣纖維的高分辨結(jié)構(gòu)得以解析［7?15］，為深入理解上述蛋白質(zhì)的組裝機制及其與不同疾病表型的關(guān)系，以及基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計提供了線索。

蛋白質(zhì)的淀粉樣纖維化是高度動態(tài)且復(fù)雜的過程，包含一系列可同時發(fā)生的微觀反應(yīng)步驟［16?17］，包括：蛋白質(zhì)單體互相結(jié)合形成纖維核心（一級成核）、纖維的延伸生長、纖維的斷裂、纖維表面催化單體生成新的纖維核心（二級成核）和纖維的末端重組等［18?22］，其中成核過程通常是限速步驟，核一旦形成即可作為模板使纖維化反應(yīng)迅速推進。在上述復(fù)雜的動態(tài)過程中，存在多種不同結(jié)構(gòu)和狀態(tài)的中間體，從結(jié)構(gòu)無序、大小不均一的蛋白寡聚體，到長度不同但結(jié)構(gòu)有序的成熟纖維，多種聚集體形式可能共存，對于哪種組分是關(guān)鍵的致病因素仍然存在爭論。目前為止的一些研究表明，淀粉樣纖維化過程中的可溶的、可擴散的寡聚中間體可能是細胞毒性最強的組分［23?25］，它們可通過蛋白單體寡聚化生成，也可能由成熟纖維的斷裂和解離產(chǎn)生。淀粉樣蛋白寡聚體通過破壞細胞膜及內(nèi)膜系統(tǒng)的完整性、導(dǎo)致膜的通透性改變以及細胞內(nèi)鈣離子失衡，引發(fā)線粒體功能異常及胞內(nèi)大量活性氧（ROS）生成，進而引發(fā)細胞凋亡［26］。

由于淀粉樣蛋白構(gòu)象的無序性、聚集的動態(tài)性、過程的復(fù)雜性，以及致病組分尚不明晰，使藥物研發(fā)工作充滿困難和挑戰(zhàn)［27］。在過去近30 年間，研究者們已針對蛋白質(zhì)錯誤折疊和聚集相關(guān)疾病發(fā)展出多種不同的治療策略，例如，干預(yù)蛋白質(zhì)生成相關(guān)酶的活性以降低錯誤折疊蛋白質(zhì)的生成水平；靶向錯誤折疊蛋白質(zhì)或聚集體以增加其降解；穩(wěn)定天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象以降低錯誤折疊和聚集的傾向；增強和激活蛋白質(zhì)質(zhì)量控制體系以減少錯誤折疊和聚集；清除已形成的淀粉樣纖維聚集體、阻斷錯誤折疊寡聚體在細胞間傳播等［28］。相關(guān)的試劑主要包括抗體、有機小分子和多肽等［29?31］，其中多肽藥物因其高效性、可變和易修飾性、可降解性等諸多優(yōu)勢而備受關(guān)注［32?35］。相比小分子藥物，多肽具有更高的特異性和更低的毒性，而相比體積較大的抗體藥物，多肽則具有較好的膜透過性、血腦屏障通過率以及較低的免疫原性，因而有望成為治療蛋白質(zhì)錯誤折疊和聚集相關(guān)疾病的候選藥物。

由于多肽易被胃腸道的酶降解，口服利用率很低，因此一般采用注射方式。多肽類藥物可分為天然多肽序列和多肽修飾物或類似物［29，36］，主要以抑制淀粉樣纖維化發(fā)生、減慢聚集體生長、降低淀粉樣蛋白寡聚體及纖維的細胞毒性、促進高毒性寡聚體轉(zhuǎn)化為低毒性組分為目的。本文將主要對AD相關(guān)的Aβ、Tau以及PD相關(guān)的α?syn的多肽抑制劑相關(guān)研究進行總結(jié)，主要策略包括基于淀粉樣纖維核心序列設(shè)計天然多肽，淀粉樣纖維化核心序列多肽的修飾，以及隨機篩選獲得多肽。

1 基于淀粉樣纖維化核心序列的天然多肽

通過對淀粉樣蛋白成纖維核心的關(guān)鍵多肽序列進行篩選，從而獲得有效的抑制劑前體，是一種常見的多肽抑制劑設(shè)計策略［37］。最早在Aβ淀粉樣纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)，Aβ纖維核心序列Aβ（16～20）五肽片段KLVFF，能夠與全長Aβ40結(jié)合，破壞Aβ單體之間的有序組裝，提示成纖維核心序列肽可對Aβ 的纖維化產(chǎn)生抑制作用［38］。以此為基礎(chǔ)對KLVFF 多肽進行改造，在保持對成纖維核心序列識別能力的同時，增強多肽抑制劑的溶解性，加入破壞鏈間β 折疊的氨基酸及其他修飾［39?46］。例如：通過加入脯氨酸殘基破壞多肽形成β 折疊的傾向（如RDLPFFPVRID 和LPFFD）［40?41］；在多肽末端引入多個帶電氨基酸殘基破壞β 折疊（如KLVFFKKKK 和KLVFFEEEE），引起聚集形式改變，降低Aβ的細胞毒性［42］。其中，LPFFD首次在動物實驗中顯示，能有效減少Aβ 在大鼠腦組織中的沉積［41］，因此被作為先導(dǎo)分子進行改造。如：N端和C端酰胺化的LPFFD能夠降低AD轉(zhuǎn)基因模型小鼠的腦損傷，并且比末端未修飾的LPFFD 具有更好的抗水解性，在血漿和腦脊液中可保持24 h不被降解［47］；C 端酰胺化的LPYFD?NH2等多肽，顯示出對Aβ 纖維化聚集及神經(jīng)細胞毒性的抑制作用，并且在小鼠實驗中可緩解Aβ 聚集導(dǎo)致的記憶障礙［43?44］。

采用纖維核心識別策略，研究者也設(shè)計了針對Tau 蛋白淀粉樣聚集的多肽抑制劑。Tau 蛋白微管結(jié)合區(qū)（MTBR）是其淀粉樣纖維的核心區(qū)域，位于MTBR 的兩個六肽基序VQIVYK（PHF6，Tau（306～311））和VQIINK（PHF6*，Tau（275～280））是引發(fā)Tau 蛋白纖維化的關(guān)鍵序列［48?49］。通過在VQIVYK序列的不同位置引入破壞β折疊結(jié)構(gòu)的脯氨酸，發(fā)現(xiàn)其中Ac?VPIVYK?NH2和Ac?VQPVYK?NH2可抑制PHF6 聚集，還可解聚PHF6纖維并降低PHF6的神經(jīng)細胞毒性［50］。但是后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，基于VQIVYK 設(shè)計的多肽只能抑制3R Tau（MTBR區(qū)含有3個重復(fù)序列的Tau蛋白）的聚集，并不能抑制全長Tau的聚集。因此，Eisenberg課題組［51］根據(jù)Tau 蛋白另一成纖維核心VQIINK所形成的“steric zipper”纖維結(jié)構(gòu)設(shè)計了DVQMINKKRK（MINK）和 DVQWINKKRK（WINK），上述多肽在兩倍過量的條件下對全長Tau 蛋白的淀粉樣纖維化抑制率達50%，并能抑制纖維種子誘導(dǎo)細胞內(nèi)Tau蛋白的聚集。進一步通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計的W?MINK多肽（DVWMINKKRK）顯示出更強的阻斷Tau 纖維種子傳播能力，IC50約為1.1 μmol/L［51］。近期一項研究顯示，Tau 蛋白MTBR 區(qū)的長片段Tau（258～360）在進行ΔK280以及I277P/I308P 突變后，在體外實驗、N2a 細胞、以及線蟲模型中均能夠抑制Tau蛋白纖維化，且能夠降低Tau 蛋白聚集的細胞毒性，改善Tau 蛋白聚集引起的線蟲神經(jīng)功能紊亂和運動障礙［52］。

α?syn蛋白疏水性中心NAC片段是其淀粉樣聚集的核心區(qū)域，其中α?syn（68～76）和α?syn（71～82）是形成淀粉樣纖維的關(guān)鍵基序［53?54］。Allsop課題組［55］從一系列α?syn 的短肽片段中篩選出能與全長蛋白結(jié)合的α?syn（68～72）片段GAVVT，并對其進行親水性修飾，獲得的RGGAVVTGR?NH2以及RGAVVTGR?NH2多肽可抑制α?syn 淀粉樣纖維化以及高分子量寡聚物的形成，進一步在該多肽C 端加入多個精氨酸以增加細胞膜的透過性（RGGACCTGRRRRRR?NH2），可抑制M7?A53T細胞中α?syn?A53T 聚集體形成和DNA 損傷，降低細胞毒性。Im 課題組［56］將NAC 區(qū)域的不同多肽片段中插入脯氨酸和帶電荷氨基酸使之能破壞β折疊的形成，經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)含有第72 位絲氨酸（Thr）突變?yōu)楦彼幔≒ro）的6～10 肽均可抑制α?syn 淀粉樣聚集并能解聚成熟纖維，其中最短的6 肽PGVTAV經(jīng)N端和C端酰胺化修飾，可在血漿中保持24 h 穩(wěn)定，并抑制α?syn 聚集引發(fā)的細胞毒性［57］，有希望成為PD治療的藥物前體。近期的一項研究基于α?syn（68～78）的纖維結(jié)構(gòu)，將Thr72突變?yōu)門rp 并進行末端修飾，獲得含 GAVVWGVTAV 序列的4 個多肽，其中 GAVVWGVTAVKKGRKKRRQRRRPQ（S62）與α?syn纖維的解離常數(shù)可達0.5 μmol/L，在等摩爾條件下能抑制α?syn淀粉樣纖維化，顯著降低α?syn纖維種子誘導(dǎo)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)聚集的能力［58］。

2 淀粉樣纖維化核心序列多肽的修飾方式

成纖維核心序列本身往往具有較強的疏水性和聚集傾向，為提高多肽抑制劑的穩(wěn)定性、水溶性和抗水解性，研究者對其進行了修飾和改造，主要包括下列方法：

2.1 氨基甲基化修飾

肽鏈骨架上的氨基（—NH—）甲基化能夠阻斷鏈間氫鍵網(wǎng)絡(luò)的形成，因而有效抑制淀粉樣纖維化［59?61］；同時，氨基甲基化多肽具有更高的水溶性和磷脂膜穿透能力［62］。交替氨基甲基化的多肽K（Me?L）V（Me?F）F（Me?A）E?NH2（Aβ（16～22m））能夠結(jié)合Aβ40 纖維核心，抑制纖維生長延伸［60］。該甲基化多肽在水溶液中可達到40 g/L的濃度并以穩(wěn)定的單體形式存在，與非甲基化的Aβ（16～22）相比，不易被蛋白酶降解［60］。在細胞實驗中，Cruz 等［59］以KKLVFFA?NH2為基礎(chǔ)序列，對不同位置的氨基酸進行氨基甲基化，發(fā)現(xiàn)Phe 殘基的氨基甲基化多肽（inL）可降低Aβ42的細胞毒性。類似地，在α?syn 研究中，氨基甲基化 的α?syn（68～78）（GAVVT（Me?G）VTAVA）以及α?syn（77～82）（VAQKT（Me?V））多肽也均能有效抑制α?syn 的纖維化［63?64］。此外，與氨基甲基化類似的方法還包括將多肽鏈骨架上的酰胺鍵替換為酯鍵［65］。

2.2 D型多肽

天然氨基酸均為L型，L型多肽序列很容易被生物體內(nèi)各種蛋白酶降解，使藥效降低。而由D型氨基酸構(gòu)成的多肽序列能夠有效抵抗水解酶的作用，提高多肽抑制劑的代謝穩(wěn)定性，降低免疫原性，增強通過血腦屏障的能力［66?67］。研究發(fā)現(xiàn)，抑制Aβ 纖維化的多肽KLVFFA 的D 型對映異構(gòu)體klvffa，比天然L 型多肽具有更高的抑制纖維化能力［68］。D 型N?甲基化多肽（Me?l）vffl?NH2（PPI?1019，Apan）進入了AD I期和II期臨床試驗，但隨后被停止試驗［69］。Doig 課題組［70］以KLVFF 為基礎(chǔ)，對氨基酸的手性、氨基甲基化位置、乙?；揎棥?cè)鏈修飾、肽鏈末端的酰胺化等不同條件進行系統(tǒng)的優(yōu)化和篩選，發(fā)現(xiàn)C端酰胺化且單甲基化的D型多肽具有最好的效果；他們篩選獲得高活性的 多 肽D?［（chGly）?（Tyr）?（chGly）?（chGly）?（mLeu）］?NH2（SEN304），該多肽能結(jié)合Aβ42并抑制其纖維化，促使毒性寡聚體轉(zhuǎn)化為非毒性組分［71］，SEN304 的衍生物SEN606 目前已處于臨床前實驗中［72］。Horsley 等［73］在研究中將D 型多肽klvff的末端氨基酸替換為D型的色氨酸，并在C端連接氨基丁酸（aminobutyric acid，Aib）作為破壞β折疊的基團，與天然的L型KLVFF相比，可更有效抑制Aβ42的成核和纖維延伸，顯著降低Aβ42的細胞毒性。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，纖維核心序列的反向D型多肽（retro?inverso peptides）比天然正向多肽對于淀粉樣蛋白核心序列有更強的親和力，因此往往具有更好的抑制效果［74?78］。Giralt 研究組［78］基于前期研究中獲得的全L型氨基甲基化修飾多肽inL，獲得其D 型對映異構(gòu)體inD 以及反向D 型多肽inrD（a（Me?f）fvlkk），比較結(jié)果顯示inrD 比inL 和inD 具有更強的抑制Aβ42 細胞毒性的作用，且可抗胰蛋白酶等的水解。

在Tau 和α?syn 多肽抑制劑研究中，基于纖維核心結(jié)構(gòu)設(shè)計特異性結(jié)合的D型多肽也被作為一種重要策略。2011 年，Eisenberg 課題組［79］基于VQIVYK形成纖維的層間“steric zipper”結(jié)構(gòu)，設(shè)計D型多肽tlkivw破壞β折疊堆積，阻斷纖維延伸，該多肽與PHF6 纖維的解離常數(shù)約為2 μmol/L，可抑制PHF6以及Tau蛋白K12和K19截短體的聚集。Gazit課題組［80］從β?syn序列中篩選與α?syn結(jié)合的多肽片段，發(fā)現(xiàn)GVLYVGSKTR（β?syn36）對α?syn 纖維化和寡聚化具有最強的抑制作用，其D型異構(gòu)體以及D型反向多肽在保持抑制能力的基礎(chǔ)上，具有較強的抗水解性和細胞膜透過性，可降低果蠅PD模型中A53T突變型α?syn的聚集，改善果蠅運動功能異常。上述研究結(jié)果表明，D型多肽的獨特優(yōu)勢使之更有希望成為退行性疾病的備選藥物。

2.3 多肽的環(huán)化

環(huán)化能夠限制多肽的構(gòu)象，使多肽抑制劑保持更高的穩(wěn)定性。2003 年，Kapurniotu 等［81］使Aβ（1～28）中的Lys17 和Asp21 的側(cè)鏈形成酰胺鍵，合成含有環(huán)結(jié)構(gòu)的多肽cyclo（17，21）?Aβ（1?28），環(huán)化后的多肽自身不會聚集，且可抑制Aβ 的聚集并降低細胞毒性。環(huán)化的Aβ（16～20）多肽（cyclo?KLVFF）及其D 型異構(gòu)體對Aβ42 纖維化的抑制能力比線性KLVFF 提高了3 倍［82］；進一步將此多肽第4 位Phe 殘基的β 位連接苯環(huán)基團（cyclo?KLVF（β?Ph）F），可誘導(dǎo)Aβ42形成低毒性的、無法轉(zhuǎn)化為纖維結(jié)構(gòu)的“off?pathway”寡聚體，從而有效抑制Aβ42發(fā)生纖維化［83］。在紫外光照射下，二氮環(huán)丙烯光活化基團修飾的cyclo?KLVF（β?Ph）F，可特異性地與Aβ42 的Tyr10 殘基發(fā)生共價反應(yīng)，降低Aβ42 的淀粉樣聚集和細胞毒性［84］。

Nowick和Eisenberg研究組［85?86］發(fā)展了一種稱為“cyclic template”的環(huán)肽設(shè)計方法，為淀粉樣纖維化抑制劑設(shè)計提供了新思路。環(huán)肽的一半由識別淀粉樣纖維核心的片段組成，另一半含有被命名為“Hao”的三肽類似物作為骨架模板，這兩部分自身能形成反向β 折疊結(jié)構(gòu)，并阻斷β 片層繼續(xù)疊加（圖1a）。這樣的環(huán)肽結(jié)合在纖維種子末端，破壞氫鍵進一步形成，從而抑制纖維生長。Nowick等［85］采用上述策略，將Tau 蛋白PHF6 相關(guān)序列VQIVY 作為識別序列接入上述環(huán)肽骨架（圖1b），該環(huán)肽分子對Ac?PHF6?NH2的纖維化有顯著抑制作用。研究表明，環(huán)型結(jié)構(gòu)對多肽的抑制效果起至關(guān)重要的作用，而環(huán)肽中關(guān)鍵殘基的疏水性、手性等因素也與其抑制能力密切相關(guān)［85?86］。Nowick等［87］改進了環(huán)肽骨架模板，將Aβ、α?syn 等多種淀粉樣蛋白的纖維核心作為識別序列，分別接入環(huán)肽分子；這些環(huán)肽分子在亞化學(xué)計量比水平即可對Aβ、α?syn等的淀粉樣纖維化起抑制作用，其中含有Aβ（16～22）即KLAFFAE 序列的環(huán)肽分子（圖1c），能夠顯著降低Aβ40 和Aβ42 纖維化導(dǎo)致的細胞毒性。在近期的一項工作中，研究者將針對Aβ（16～21）和Aβ（37～42）所形成纖維結(jié)構(gòu)的5 種多肽抑制劑片段接入環(huán)肽模板骨架，可顯著增強其抑制Aβ42纖維化能力，在抑制劑與單體摩爾比為0.2的條件下，可使Aβ42 纖維化延滯期增加7～10 倍，抑制Aβ42形成寡聚體并降低其細胞毒性［88］。

除上述策略外，還可對多肽抑制劑進行其他化學(xué)修飾，或?qū)⑵溥B接到納米顆粒載體表面［89?94］，以增強多肽抑制劑的穩(wěn)定性和抗水解性，提高其血腦屏障通過率，以達到更好的抑制效果。此外，將具有識別和抑制效應(yīng)的多肽序列插入抗體中，可特異性結(jié)合淀粉樣蛋白單體及其聚集物，為抗體藥物的開發(fā)提供新思路［95?97］。

3 隨機篩選

除了基于淀粉樣纖維核心的序列和結(jié)構(gòu)進行理性設(shè)計得到多肽抑制劑之外，隨機篩選也是發(fā)現(xiàn)有效多肽抑制劑的方法之一［67，98?105］。鏡像噬菌體展示（mirror phage display）是常用的多肽篩選技術(shù)［106］。Willbold 課題組［100，107?108］采用鏡像噬菌體展示技術(shù)，從12肽隨機序列中篩選對Aβ42纖維具有高親和力的序列，篩選出D 型多肽qshyrhispaqv（D1）和rprtrlhthrnr（D3），二者均可特異性識別APP/PS?1轉(zhuǎn)基因小鼠模型腦組織中的Aβ42淀粉樣斑塊，降低Aβ 聚集的細胞毒性。D1 對Aβ 纖維具有更高的親和力，能夠增加Aβ42 聚集體的數(shù)量，但顯著減低聚集體的大??；D3則對Aβ寡聚體親和力更高，可改變Aβ42 聚集體形態(tài)，使之形成無毒性的無定形沉淀［99?100，109］。其中，D3在臨床前實驗中具有減少轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中Aβ 淀粉樣斑塊形成、降低炎癥反應(yīng)的效果；同時D3 具有良好的抗水解穩(wěn)定性和血腦屏障通過率，口服利用率可達58%［110?113］，因此D3 及其衍生物有望成為治療AD的候選藥物［114?115］。此外，在Tau 蛋白相關(guān)的研究中，F(xiàn)unke 課題組［67］利用鏡像噬菌體展示技術(shù)，從109條12 肽中篩選出6 個與PHF6 纖維結(jié)合的多肽序列，其中D 型多肽ttslqmrlyypp（TD28）和ppyylrmqlstt（TD28rev）具有較強的抑制Tau 蛋白纖維化作用以及良好的細胞膜透過性。近期，該課題組又以PHF6*形成的纖維作為靶標(biāo)，通過鏡像噬菌體展示篩選獲得D 型多肽dplkarhtsvwy（MMD3）及其反向序列（MMD3rev），它們能夠抑制PHF6*及全長Tau蛋白的纖維化，使之形成無定形沉淀［102］。將靶向PHF6 和PHF6*的序列整合在同一分子上，也可能產(chǎn)生更有效的針對Tau蛋白聚集的藥物。

Fig.1 Design of cyclic-peptide inhibitors of amyloid formation圖1 抑制淀粉樣纖維化的環(huán)肽分子設(shè)計

4 其他新思路

設(shè)計靶向毒性相對較高的淀粉樣蛋白寡聚體的抑制劑，是近年多肽藥物研究的新思路。Daggett等［116?117］研究發(fā)現(xiàn)，Aβ 等多種不同的淀粉樣蛋白在聚集早期可形成具有非典型二級結(jié)構(gòu)“α?sheet”的毒性寡聚體。研究者據(jù)此設(shè)計出能夠形成α?sheet 的多肽片段，如AP5、AP90、AP407 和AP421［116］，它們對單體和纖維的親和力較低，但能以納摩爾級親和力特異性結(jié)合Aβ 寡聚體，可抑制Aβ的聚集和引發(fā)的神經(jīng)細胞毒性，并且抑制Aβ聚集導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因線蟲麻痹癥，促進AD小鼠模型中毒性Aβ 寡聚體的清除，有望成為藥物和診斷試劑的前體［116］。在近期的一項關(guān)于α?syn 蛋白的多肽抑制劑研究中，Santos等［118］發(fā)現(xiàn)，采用具有正電性和兩親性的α螺旋型的天然多肽PSMα3，雖不與天然態(tài)α?syn 單體結(jié)合，但能夠以納摩爾級親和力特異性結(jié)合α?syn 蛋白的寡聚體和纖維聚集體，并在亞化學(xué)計量比的條件下抑制α?syn 的聚集，且消除寡聚體對神經(jīng)細胞的毒性。通過分析PSMα3與α?syn 寡聚體及纖維相互作用的界面特征，設(shè)計出多個具有類似效果的多肽，并通過篩選發(fā)現(xiàn)人源抗菌肽LL?37 也符合上述特征，它們均能與α?syn的毒性寡聚體相互作用，并顯著降低細胞毒性。有趣的是，LL?37 多肽也被發(fā)現(xiàn)能夠抑制Aβ 和IAPP的淀粉樣纖維化［119?120］。相比外源多肽抑制劑，內(nèi)源性多肽具有更好的生物相容性，更有潛力成為疾病治療的藥物。

越來越多的證據(jù)顯示，淀粉樣蛋白所形成的寡聚體可能比成熟纖維具有更高的毒性，加速寡聚體向成熟纖維的轉(zhuǎn)化也被作為治療蛋白質(zhì)錯誤折疊疾病的潛在策略［121?124］。本課題組［125］在近期關(guān)于酵母prion蛋白Ure2淀粉樣纖維化機制的研究中，從Ure2 成纖維核心區(qū)域篩選出LQVNIGNR 多肽，該多肽能夠組裝成泡狀結(jié)構(gòu)，加速Ure2、Tau 以及α?syn 的纖維化過程。通過單分子熒光實驗和全局動力學(xué)建模分析，揭示LQVNIGNR 多肽可促進高毒性寡聚體向低毒性纖維轉(zhuǎn)化，從而減少寡聚體累積并降低細胞毒性。通過催化機制加速毒性組分轉(zhuǎn)化為無毒性或低毒性組分，相比通過結(jié)合單體及中間體而抑制纖維生長所需的抑制劑劑量更低，使毒性中間體組分存在的時間更短（圖2），為神經(jīng)退行性疾病的防治提供了新思路。

Fig.2 Difference between the working mechanisms of catalysts and inhibitors of amyloid formation圖2 催化劑與抑制劑作用機制的差異

5 展望

多肽是較早開始發(fā)展的針對蛋白質(zhì)錯誤折疊相關(guān)疾病的藥物前體，截至目前已開展了大量的研究工作。因多肽具有高特異性、低毒性、低免疫原性、易修飾性，以及生物兼容性等優(yōu)勢，它們有望成為治療退行性疾病的先導(dǎo)分子和備選藥物［29，35］。本文總結(jié)了過去20 多年中，針對Aβ、Tau 以及α?syn淀粉樣纖維化的多肽抑制劑研發(fā)的主要策略，以及對基于纖維核心的合理設(shè)計和隨機篩選等方式獲得的多肽抑制劑進行修飾和優(yōu)化的方法（表1），這些研究結(jié)果為進一步開發(fā)有效藥物奠定了良好的基礎(chǔ)。然而，目前多數(shù)研究僅停留在體外實驗及細胞實驗水平，僅有少數(shù)多肽進入臨床前研究，尚未成為臨床確證有效的藥物［126?127］。盡管退行性疾病的致病機制尚未完全清楚，仍然存在爭論［128］，但大量的研究證據(jù)表明，蛋白質(zhì)淀粉樣聚集的過程與退行性疾病的發(fā)病密切相關(guān)［28］。鑒定蛋白質(zhì)聚集過程中不同組分的細胞毒性及其時空因果關(guān)系，深入揭示蛋白質(zhì)聚集體的結(jié)構(gòu)及其與毒性的關(guān)聯(lián)，對于發(fā)展有效的治療策略起關(guān)鍵作用。在未來的研究中，包括干擾淀粉樣纖維化過程在內(nèi)的多種治療策略的聯(lián)合應(yīng)用將有望為退行性疾病治療帶來新希望。同時，基于淀粉樣纖維化過程開發(fā)疾病檢測和診斷的生物標(biāo)志物，對于退行性疾病的早期診斷以及評判臨床治療效果也有十分重要的意義。

Table 1 Peptide inhibitors targeting Aβ，Tau and α-syn fibril formation表1 針對Aβ、Tau、α-syn纖維化的多肽抑制劑