水杉葉浸提液對銀杏苗生理生化的化感效應(yīng)

李廣云 曹永富 劉瑞倩 郁萬文

摘要：? 以水杉葉水浸提液為供體，銀杏幼苗為受體，研究銀杏幼苗對水杉葉浸提液添加的生理響應(yīng)，結(jié)果表明：（1）銀杏葉中可溶性糖和可溶性蛋白含量在低濃度水杉葉浸提液處理中低于對照，但隨著添加濃度的升高而升高;銀杏葉中游離脯氨酸、總黃酮含量及黃酮清除DPPH自由基能力隨著濃度的升高呈“升高-降低”的變化趨勢，其中T2處理的3個指標(biāo)最高。（2）可溶性糖含量與可溶性蛋白含量、游離脯氨酸及總黃酮含量存在中等強(qiáng)度的負(fù)相關(guān)，其中與游離脯氨酸含量存在顯著性相關(guān);可溶性蛋白含量與游離脯氨酸含量存在極顯著的高強(qiáng)度正相關(guān)，游離脯氨酸含量與總黃酮含量存在中等強(qiáng)度的正相關(guān)，總黃酮與其清除DPPH自由基能力存在弱度的正相關(guān)。（3）基于隸屬函數(shù)評價，第一次采樣時的處理排名為T2>T4>CK>? ? T1>T3，第二次采樣時的處理排名為T2>T3>T4>T1>CK，兩次采樣均是以T2較優(yōu)。綜上所述，水杉葉浸提液對銀杏幼苗具有一定的化感作用，表現(xiàn)為中高濃度下促進(jìn)，低濃度下抑制。

關(guān)鍵詞：? 化感作用; 水浸提液; 水杉; 銀杏; 生理生化

中圖分類號：? ?S 792. 95? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? ?A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1001 - 9499（2022）01 - 0017 - 04

化感作用是植物種間相互作用的重要途徑，對群落的植物組成、分布及其演替過程具有重要作用，是影響森林天然更新的重要因子?；旖涣值臓I造也要充分考慮化感作用的影響。以植物化感作用原理為指導(dǎo)，充分發(fā)揮其相生作用、互補(bǔ)作用，從而實(shí)現(xiàn)中藥材的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、安全、高效。本文以水杉葉水浸提液為供體，銀杏幼苗為受體，研究銀杏幼苗對水杉葉浸提液添加的生理響應(yīng)，為實(shí)現(xiàn)水杉及銀杏種植產(chǎn)業(yè)中的復(fù)合經(jīng)營系統(tǒng)提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1. 1 種子處理

2019年10月上旬采集郯城銀杏種質(zhì)資源圃中銀杏優(yōu)良單株上的種實(shí)，去外種皮后清洗干凈，并進(jìn)行濕藏層積處理45天，完成生理成熟后，將種子于27 ℃用濕布覆蓋催芽，種子露白播入口徑10 cm、高20 cm的營養(yǎng)缽中，每盆2粒，每天光照16 h，溫度27.5 ℃，光照強(qiáng)度為2 500 lx;暗處理8 h，溫度25.0 ℃。

1. 2 水杉葉浸提液的制備

稱取80g水杉凋落葉粉末，置于1 L燒杯中，加入800 mL蒸餾水，待葉粉完全浸濕后，超聲30 min，繼續(xù)24 h。用4層滅菌醫(yī)用紗布過濾，得到濃度為100 mg/mL的水杉凋落葉浸提液。用去離子水將母液分別配置成12.5、25、50和100 mg/mL的處理液，記作T1、T2、T3、T4;以去離子水作對照（CK），置于4 ℃冰箱待用。

2 試驗(yàn)方法

2. 1 試驗(yàn)設(shè)計

于2020年4月26日，選取長勢一致的銀杏幼苗，按CK、T1、T2、T3、T4 設(shè)置5個處理，每個處理6盆，一次性澆入相應(yīng)濃度浸提液100 mL，以后每3天補(bǔ)水一次，保持基質(zhì)濕潤。分別于處理后的第5天、第10天采集銀杏葉片，進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測定。

2. 2 測定項(xiàng)目與方法

可溶性糖含量的測定 取相同部位的葉片0.1 g，采用蒽酮法測定可溶性糖含量;首先配置試劑，將76 mL的濃硫酸加入到30 mL的去離子水中稀釋待完全冷卻至室溫后，向溶液中加入100 mg的蒽酮，攪拌至完全溶解，待用。將切取的葉片分別放入標(biāo)記好的10個10 mL移液管中，并加入8 mL去離子水，再將其放入沸水中30 min后取出。待完全冷卻至室溫后，吸取樣品提取液0.1 mL于新的10 mL移液管中，并向提取液中加入3 mL的蒽酮-濃硫酸試劑，再將其放入100 ℃的水浴鍋中水浴30 min，每個濃度梯度3次重復(fù)（另做兩個空白組用作參比）。待其冷卻至室溫后，以空白做參比，在630 nm波長下測用不同濃度澆灌的銀杏葉片的吸光值。

可溶性蛋白含量的測定 取相同部位的葉片0.1 g，采用考馬斯亮藍(lán)染色法測定可溶性蛋白質(zhì)含量;首先配置試劑，稱取100 mg的考馬斯亮藍(lán)G-

250粉末，溶解于50 mL的無水乙醇中，加入100 mL 85%的磷酸，用水定容至1 000 mL，此藥品試劑常溫下可保存30天。將切取并研磨好的葉片粉末分別放入標(biāo)記好的10個10 mL移液管中，并加入8 mL去離子水，再將其放入沸水中30 min后取出。待完全冷卻至室溫后，吸取樣品提取液1 mL于新的10 mL移液管中，并向提取液中加入3 mL的考馬斯亮藍(lán)G-250試劑（另做兩個空白組用作參比）?；蝿蚝?，以空白做參比，在590 nm波長下測定不同濃度水杉葉浸提液澆灌的銀杏葉片的吸光值。

脯氨酸含量的測定 另取0.1 g 葉片采用茚三酮法測定脯氨酸含量。首先配置試劑，稱取6 g的磺基水楊酸，用去離子水定容至200 mL。再稱取2.5 g茚三酮，加入60 mL的冰醋酸以及40 mL 6 mol/L的磷酸加熱溶解，冷卻后儲藏于棕色試劑瓶內(nèi)。將切取的葉片分別放入標(biāo)記好的10個10 mL移液管中，并加入1 mL磺基水楊酸，再將其放入沸水中10 min后取出。待完全冷卻至室溫后，吸取樣品提取液1 mL于新的10 mL移液管中，并向提取液中先后加入1 mL的冰乙酸和1.5 mL的茚三酮顯色液，再將其放入100 ℃的水浴鍋中水浴40 min，每個濃度梯度做3組重復(fù)（另做兩個空白組用作參比）。待其冷卻至室溫后，以空白做參比，在520 nm波長下測用不同濃度澆灌的銀杏葉片的吸光值。

總黃酮含量的測定 將采樣后剩余的銀杏葉片烘干，研磨成粉末稱量并記錄質(zhì)量，再將其分別倒入事先標(biāo)記好的10個10 mL的移液管中并先后加入事先配好的30%乙醇5 mL和5%NaNO2，5 min后加入10%Al（NO3）30.35 mL，6 min后加入10%NaOH 2.5 mL，混勻，再用30%乙醇定容至10 mL后放入40 ℃的水浴鍋中水浴10 min，每個濃度梯度做3組重復(fù)（另做兩個空白組用作參比）。拿出待冷卻后，以空白做參比，在510 nm波長下測用不同濃度澆灌的銀杏葉片的吸光值。

數(shù)據(jù)處理方法 采用DPS7.04和Excel 2016統(tǒng)計分析軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和方差分析，運(yùn)用Turky法進(jìn)行多重比較。

3 結(jié)果與分析

3. 1 水杉葉浸提液對銀杏葉中可溶性糖含量的影響

隨著水杉葉浸提液質(zhì)量濃度的提高，銀杏幼苗葉中可溶性糖總體呈現(xiàn)升高的趨勢（圖1），但各濃度間差異不顯著（p>0.05），且在低濃度時低于CK;隨著處理時間的延長呈下降的趨勢，但差異不顯著（p=0.0545）。

圖1 浸提液對銀杏葉可溶性糖含量的影響

3. 2 水杉葉浸提液對銀杏葉中可溶性蛋白含量的影響

隨著水杉葉浸提液質(zhì)量濃度的提高，銀杏幼苗葉中可溶性蛋白總體呈現(xiàn)升高的趨勢（圖2），但各濃度間差異不顯著（p=0.086 3），且在低濃度時低于CK;隨著處理時間的延長呈升高的趨勢，但差異顯著（p=? 0.015 5）。

3. 3 水杉葉浸提液對銀杏葉中游離脯氨酸含量的影響

隨著水杉葉浸提液質(zhì)量濃度的提高，銀杏幼苗葉中游離脯氨酸含量呈升高-降低的變化趨勢（圖3），且各濃度間差異顯著（p=0.0326），在T2處理達(dá)到最大值;隨著處理時間的延長呈升高的趨勢，但差異極顯著（p=0.003 2）。

3. 4 水杉葉浸提液對銀杏葉中總黃酮含量的影響

隨著水杉葉浸提液質(zhì)量濃度的提高，銀杏幼苗葉中總黃酮含量呈現(xiàn)升高-降低的變化趨勢（圖4），且各濃度間差異顯著（p=0.1740），在T2處理達(dá)到最大值并顯著高于對照;隨著處理時間的延長呈升高的趨勢，但差異不顯著（p=0.6267）。

3. 5 水杉葉浸提液對銀杏葉總黃酮清除DPPH·自由基能力的影響

隨著水杉葉浸提液質(zhì)量濃度的提高，銀杏幼苗葉總黃酮清除DPPH·自由基能力總體呈現(xiàn)升高-降低的變化趨勢（圖5），且各濃度間差異不顯著（p=? 0.550），在T2處理達(dá)到最大值;隨著處理時間的延長呈降低的趨勢，但差異不顯著（p=0.9283）。

3. 6 相關(guān)性分析

可溶性糖含量與可溶性蛋白含量、游離脯氨酸及總黃酮含量存在中等強(qiáng)度的負(fù)相關(guān)，其中與游離脯氨酸含量存在顯著性相關(guān)。可溶性蛋白含量與游離脯氨酸含量存在極顯著的高強(qiáng)度正相關(guān)，游離脯氨酸含量與總黃酮含量存在中等強(qiáng)度的正相關(guān)，總黃酮與其清除DPPH自由基能力存在弱度的正相關(guān)（表1）。

3. 7 隸屬函數(shù)評價

由不同水杉葉浸提液及采樣時間處理的隸屬函數(shù)值及排名（表2）可知：兩次采樣時間的不同濃度浸提液處理，第一次采樣時的處理排名為T2>T4>? CK>T1>T3，第二次采樣時的處理排名為T2>T3>T4>? T1>CK，其中兩次采樣均是以T2較優(yōu)，且隨著處理時間的延長，添加水杉浸提液有利于上述生理代謝。

4 結(jié)論與討論

4. 1 銀杏葉中可溶性糖和可溶性蛋白含量在低濃度水杉葉浸提液處理中低于對照，但隨著添加濃度的升高而升高。銀杏葉中游離脯氨酸、總黃酮含量及黃酮清除DPPH自由基能力隨著濃度的升高呈升高-降低的變化趨勢，其中T2水平時升至最高點(diǎn)。相關(guān)性分析表明，可溶性糖含量與可溶性蛋白含量、游離脯氨酸及總黃酮含量存在中等強(qiáng)度的負(fù)相關(guān)，其中與游離脯氨酸含量存在顯著性相關(guān)?？扇苄缘鞍缀颗c游離脯氨酸含量存在極顯著的高強(qiáng)度正相關(guān)，游離脯氨酸含量與總黃酮含量存在中等強(qiáng)度的正相關(guān)，總黃酮與其清除DPPH自由基能力存在弱度的正相關(guān)。上述分析表明，水杉葉浸提液的添加，促使更多的碳水化合物（如可溶性糖）轉(zhuǎn)化成含氮化合物（如可溶性蛋白及游離脯氨酸等），進(jìn)一步促進(jìn)了黃酮類化合物的合成與積累?；陔`屬函數(shù)評價，兩次采樣時間的不同濃度浸提液處理，第1次采樣時的處理排名為T2>? T4>CK>T1>T3，第2次采樣時的處理排名為T2>? ?T3>T4>T1>CK，其中兩次采樣均是以T2較優(yōu)，且隨著處理時間的延長，添加水杉浸提液有利于上述生理代謝。

4. 2 水杉葉浸提液對銀杏幼苗具有一定的化感作用，表現(xiàn)為中高濃度下促進(jìn)，低濃度下抑制。在自然界中，通過雨水淋洗進(jìn)入土壤的浸提物是少而慢的，其作用應(yīng)該類似與本實(shí)驗(yàn)的低濃度處理。同時本研究的時間較短，測定指標(biāo)側(cè)重生理指標(biāo)，今后應(yīng)延長研究周期及加大生長指標(biāo)的測定來完善相關(guān)的研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳秀珍.? 銀杏葉不同生長期總黃酮的含量測定[J]. 廣西物，1988（4）： 363 - 364.

[2] 戴余軍，? 方華，? 江德安.? 不同品種銀杏葉的黃酮含量變化規(guī)律研究[J].? 林業(yè)實(shí)用技術(shù)， 2009（2）： 4 - 6.

[3] 管玉民，? 王健，? 尤慧蓮，? 等.? 氣候、? 季節(jié)、? 樹齡對銀杏葉總黃酮含量的影響[J].? 中成藥， 2000， 25（5）： 50 - 52.

[4] 黃萍.? 不同產(chǎn)地銀杏葉中總銀杏酸的含量比較[J].? 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2013， 19（12）： 129 - 131.

[5] 江德安，? 李國元，? 李順文，? 等.? 葉用銀杏品種、? 形態(tài)指標(biāo)與產(chǎn)量相關(guān)性及選擇[J].? 福建林學(xué)院學(xué)報， 2004， 24（2）： 169 - 171.

[6] 江德安，? 庹明枝.? 不同營養(yǎng)部位、樹齡銀杏葉黃酮含量的比較[J].? 孝感學(xué)院學(xué)報， 2006， 26（3）： 9 - 12.

第1作者簡介：? 李廣云（1980-），女，高級工程師，主要從事林業(yè)科研科技推廣、森林病蟲害防治等研究。

收稿日期： 2021 - 12 -? 01

（責(zé)任編輯：? ?李 丹）

Allelopathic Effects of Extracts from Metasequoia Metasequoia Leaves

on the Physiology and Biochemistry of Ginkgo Biloba Seedlings

LI Guangyun

（Linyi Forest Wetland Protection Center，? Shandong Linyi 276000）

Abstract The water extract of metasequoia metasequoia leaves was used as the donor and ginkgo biloba seedlings as the acceptor to study the physiological response of ginkgo biloba seedlings to the extract of metasequoia metasequoia leaves， so as to provide a basis for the construction of metasequoia metasequoia and ginkgo biloba compound management system. The main research results were as follows ：（1） the contents of soluble sugar and soluble protein in ginkgo biloba leaves were lower than those in the control group at low concentration， but increased with the increase of the added concentration; The contents of free proline and total flavonoids in ginkgo biloba leaves and the ability of flavonoids to scavenging DPPH free radicals showed a trend of "up-decrease" with the increase of concentration， among which the three indexes of T2 treatment were the highest. （2） there was a moderate negative correlation between soluble sugar content and soluble protein content， free proline content and total flavonoids content， among which， there was a significant correlation between soluble sugar content and free proline content. There was a significant positive correlation between soluble protein content and free proline content with high strength， a positive correlation between free proline content and total flavonoids content with moderate strength， and a positive correlation between total flavonoids and its ability to scavenging DPPH free radicals. （3） based on the evaluation of membership functions， the processing ranking of the first sampling was T2>T4>CK>T1> T3， and the processing ranking of the second sampling was T2>T3>T4>T1>CK. To sum up， the extract of metasequoia metasequoia leaves has a certain allelopathic effect on ginkgo seedlings， which is promoted at medium and high concentration and inhibited at low concentration.

Key words Allelopathy;? Water extract;? Metasequoia;? Ginkgo;? Physiology and biochemistry