環(huán)頸雉骨蛋白風(fēng)味蛋白酶水解工藝條件的優(yōu)化

翟學(xué)超 王帥

摘要：? 選用風(fēng)味蛋白酶對(duì)環(huán)頸雉骨蛋白進(jìn)行水解，在風(fēng)味蛋白酶的最適溫度50 ℃和pH值7.0條件下，以水解度（DH）和氮回收率為指標(biāo)，優(yōu)化出風(fēng)味蛋白酶最適的水解條件：底物濃度為2 g/100 mL，[E]/[S]為2∶100，水解時(shí)間4 h。研究表明：在此條件下骨蛋白水解液的水解度和氮收率較為合理，為后續(xù)的美拉德反應(yīng)產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)提供豐富的反應(yīng)原料，打下良好的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：? 風(fēng)味蛋白酶;? 骨蛋白;? 水解

中圖分類號(hào)：? ?S 865? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? ?A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：1001 - 9499（2022）01 - 0047 - 03

畜禽骨是一種營(yíng)養(yǎng)極為豐富的天然資源，其約占胴體的10%～15%，骨本身含有11%～14%的蛋白質(zhì)，我國(guó)是蛋白質(zhì)資源相對(duì)較少的一個(gè)國(guó)家，因此，高效利用與綜合開發(fā)骨蛋白質(zhì)資源具有一定的實(shí)際意義[ 1 ]。肉類天然風(fēng)味物質(zhì)的生產(chǎn)與制備作為食用香精的一個(gè)新興產(chǎn)業(yè)，近年來發(fā)展尤為迅速，并由此形成了一個(gè)由酶水解、美拉德反應(yīng)、超臨界萃取及噴霧干燥等多種處理方法于一體的天然風(fēng)味物質(zhì)生產(chǎn)體系[ 2 - 4 ]。酶解工程技術(shù)和美拉德反應(yīng)是生產(chǎn)天然肉類風(fēng)味物質(zhì)的主要方法。酶解能較為高效的利用骨中的蛋白，令其水解成多肽和氨基酸，水解產(chǎn)物更易被人體消化吸收[ 5 ]，還可進(jìn)一步與糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)，在最大限度保存了風(fēng)味物質(zhì)天然性和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)完整性的同時(shí)，生產(chǎn)出具有較高風(fēng)味特征的風(fēng)味物質(zhì)。改善了傳統(tǒng)香精的耐高溫性差、香味駐留時(shí)間短、存儲(chǔ)條件苛刻、風(fēng)味不自然等缺點(diǎn)。

本試驗(yàn)通過摸索水解骨湯中骨蛋白時(shí)的水解條件，包括底物濃度、酶與底物濃度比、水解時(shí)間等，以水解度和氮收率作為標(biāo)準(zhǔn)，篩選最佳的反應(yīng)條件。

1 試驗(yàn)材料

1. 1 材料與主要試劑

環(huán)頸雉骨、風(fēng)味蛋白酶（Flavourzyme 2×104 U/g）（北京索萊寶科技有限公司）、十二烷基磺酸鈉（SDS）（美國(guó)Sigma試劑公司）、N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）（上海天虹生物有限公司）、TEMED（北京百奧萊博）、過硫酸銨（APS）（美國(guó)Sigma試劑公司）、牛血清白蛋白（BSA）（美國(guó)Sigma試劑公司）、甘氨酸（上海藍(lán)源試劑公司）、丙烯酰胺（Acr）（美國(guó)Sigma試劑公司）、β-巰基乙醇（美國(guó)Amersco試劑公司）、SDS蛋白Marker（美國(guó)NEB公司）。

1. 2 儀器與設(shè)備

高速離心機(jī)TGL-16C、ORP3.0型pH計(jì)、JA1003? N-5003N電子天平、精密電子天平AB 204-N、L9 Plus 雙光束紫外可見分光光度計(jì)、電熱恒溫水浴鍋HH-? ? ? ? M4、精密增力電動(dòng)攪拌器JJ-1。

2 研究方法

2. 1 珍禽骨蛋白水解液的制備及條件優(yōu)化

取500 mL骨湯置于燒瓶中，采用蒸餾水稀釋和部分濃縮的方法，依次將骨湯的底物濃度調(diào)節(jié)至2%、3%、4%、5%、6%、7%。用已配制好的1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)骨湯體系的pH值，使其接近風(fēng)味蛋白酶的最適pH值（7.0），向其中加入1∶100（[E]/[S]）的風(fēng)味蛋白酶，并于該酶最適酶解溫度（50℃）條件下恒溫振蕩水解4 h[ 6 ]，在水解反應(yīng)進(jìn)行的過程中，根據(jù)反應(yīng)進(jìn)程向體系內(nèi)加入1 mol/L的NaOH溶液，使體系pH維持在相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，記錄耗堿量，并以此通過公示計(jì)算水解度。水解完成后沸水浴10 min，以消除殘余酶的活性，得珍禽骨蛋白水解液。測(cè)定水解物的水解度和氮收率，篩選出最佳的底物濃度，并于該底物濃度條件下，以同樣方法在0.5∶100，1∶100，1.5∶100，2∶100，2.5∶100的[E]/[S]中篩選出最佳的[E]/[S]。

2. 2 水解度的測(cè)定

水解度計(jì)算公式[ 7 ]為：

DH（%） =×100

h=B×Nb×1/α×1/MP

式中：h-單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中被水解的肽鍵的量（mmol/g）;htot-單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中肽鍵的總量（mmol/g），血蛋白htot-8.8mmol/g;B-水解過程中所消耗的堿量（mL）;Nb -堿液的濃度（mol/L）;MP -水解液中蛋白質(zhì)的品質(zhì)（g）;1/α-校正系數(shù)（堿性蛋白酶1/α=1.105，中性蛋白酶1/α=1.400）。

2. 3 氮收率的測(cè)定

氮收率計(jì)算公式為[ 8 ]：

氮收率×100%

式中水解液中和骨湯中蛋白含量均按照國(guó)標(biāo)GB5009.5-2010方法進(jìn)行的測(cè)定，采用凱氏定氮法測(cè)定水解液和骨湯中的蛋白含量。

2. 4 硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別準(zhǔn)確吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL濃度為100 mg/L的硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL帶塞比色管中，再分別向其中加入4 mL乙酸銨緩沖液和4 mL顯色劑，加水補(bǔ)足至刻度，蓋緊玻璃塞，震搖1 min，開塞，放入沸水浴中反應(yīng)15 min，此后取出并將其浸沒于冷水中快速降溫至室溫，于400 nm的波長(zhǎng)下測(cè)得吸光值。以硫酸銨含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2. 5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)重復(fù)2次，至少一式三份分析。所有數(shù)據(jù)均采用平均值±S.D，采用數(shù)據(jù)軟件SPSS16.0進(jìn)行顯著性以及相關(guān)性分析。顯著性水平為P<0. 05。

3 結(jié)果與分析

3. 1 不同底物質(zhì)量濃度對(duì)水解度和氮收率的影響

由不同底物濃度對(duì)水解度和氮收率的影響（圖1）可知：使用風(fēng)味蛋白酶對(duì)骨湯中的蛋白進(jìn)行水解，隨著底物濃度的升高，體系的水解度和氮收率呈降低的趨勢(shì)。當(dāng)?shù)孜餄舛葹? g/100mL時(shí)，水解度和氮收率都為最高;隨著底物濃度升高，水解度和氮收率逐漸減少，這主要是由于底物濃度較低時(shí)，底物與底物之間的空間較大，在同等加酶量的條件下，底物的相對(duì)含量較少，風(fēng)味蛋白酶處于主導(dǎo)地位，可與環(huán)頸雉骨蛋白進(jìn)行充分的接觸，因此此時(shí)的水解度和氮收率處于較高的水平;底物濃度過大則會(huì)阻礙酶和底物的充分接觸，此時(shí)底物處于主導(dǎo)地位，導(dǎo)致水解度和氮收率下降。

3. 2 不同酶與底物濃度比對(duì)水解度和氮收率的影響

由不同酶與底物濃度比對(duì)水解度和氮收率的影響（圖2）可知：在風(fēng)味蛋白酶的[E]/[S]由0.5∶100遞增至2.5∶100的過程中，水解度和氮收率均出現(xiàn)了增加的趨勢(shì)。其中水解度的上升趨勢(shì)較為均衡，當(dāng)[E]/[S]為2.5∶100時(shí)，水解度達(dá)到最大。[E]/[S]在0.5∶100～2∶100的范圍內(nèi)時(shí)，隨著[E]/[S]的繼續(xù)增大，氮收率的上升速度趨向平緩，在[E]/[S]由2∶100向2.5∶100增加過程中，氮回收率出現(xiàn)拐點(diǎn)。氮收率的上升速度則呈現(xiàn)出前期穩(wěn)定增加后期逐漸減小的趨勢(shì)，因此選擇[E]/[S]為2∶100作為環(huán)頸雉骨蛋白水解的最適加酶量。

3. 3 不同水解時(shí)間對(duì)美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物及氨基酸態(tài)氮損失率的影響

由不同水解時(shí)間對(duì)美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物（A294 nm）和氨基酸態(tài)氮損失率的影響（圖3）可知：A294 nm在0.5～6 h的水解時(shí)間內(nèi)，總體呈上升趨勢(shì)。氨基酸態(tài)氮損失率在0.5～4 h內(nèi)的上升速度相對(duì)較快，而在4～5 h內(nèi)逐漸趨于平緩，最終維持在8%左右，幾乎不再出現(xiàn)變化。這是因?yàn)橐欢抗菧械牡鞍妆伙L(fēng)味蛋白酶水解的時(shí)間不同，水解液中的蛋白、短肽、氨基酸等的含量也不盡相同，但骨湯中的蛋白含量是一定的，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解程度也越發(fā)徹底。隨著后續(xù)美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，水解液中有限的蛋白、短肽、氨基酸等逐漸被耗盡，反應(yīng)原料不足，最終導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮損失率維持在一定極限水平不再變化。綜上所述，選取水解時(shí)間為0.5～4 h的水解液作為美拉德反應(yīng)的基液相對(duì)較好。

3. 4 不同水解時(shí)間水解液中蛋白質(zhì)及短肽的SDS-PAGE電泳變化

由不同水解時(shí)間水解液的SDS-PAGE電泳（圖4）可知：未風(fēng)味蛋白酶水解的原骨湯蛋白大分子肽段顯色條帶顏色深度明顯。但隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，骨湯蛋白大分子肽段的顯色條帶逐漸變淺、顯色帶深度逐漸下移，說明骨湯蛋白分子正逐漸被酶水解。在水解1 h的時(shí)候，在代表分子量為27.0 kDa～212 kDa的蛋白質(zhì)大分子條帶消失的同時(shí)，會(huì)在6.5 kDa～20.0 kDa之間生成新的條帶，顯色帶深度下移，說明隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，小分子量肽段的數(shù)量在增加，平均分子量逐漸減小;但隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解程度進(jìn)一步提高，體系內(nèi)的大分子物質(zhì)進(jìn)一步減少。當(dāng)水解時(shí)間達(dá)到4 h時(shí)，泳道內(nèi)已無明顯條帶，這意味著風(fēng)味蛋白酶將珍禽骨蛋白完全水解。

4 結(jié) 論

通過使用風(fēng)味蛋白酶，在酶的最適溫度50 ℃和最適pH值7.0條件下，于一定時(shí)間內(nèi)采用不同的底物濃度和[E]/[S]對(duì)骨湯進(jìn)行水解，以水解度和氮收率為參考，并根據(jù)實(shí)際情況優(yōu)化選擇出最適的水解條件：底物濃度為2 g/100 mL，[E]/[S]為2∶100，水解時(shí)間4 h。研究表明：在此條件下環(huán)頸雉骨蛋白水解液的水解度和氮收率較為合理，為后續(xù)的美拉德反應(yīng)產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)提供豐富的反應(yīng)原料，打下良好的基礎(chǔ)。

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第1作者簡(jiǎn)介：? 翟學(xué)超（1981-），? 男，? 副研究員，? 碩士研究生，? 主要從事特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物及野生動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化研究。

通訊作者：? 王帥（1981-），? 男，? 副研究員，? 碩士，? 主要從事特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物保育和標(biāo)準(zhǔn)化工作。

收稿日期： 2021 - 01 -? 20

（責(zé)任編輯：? ?李 丹）