N6-甲基腺苷甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用

吳華濤，崔玉坤

（1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院廣東省乳腺癌診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515041）

N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）最早于20世紀(jì)70 年代由Desrosiers 等[1]團(tuán)隊(duì)報(bào)道，是真核信使RNA（messenger RNA，mRNA）中最豐富的內(nèi)部修飾方式。近年來(lái)，針對(duì)m6A修飾的研究越來(lái)越廣泛，m6A主要出現(xiàn)在序列RRm6ACH（[G/A/U][G＞A]m6AC[U＞A＞C]）中，該甲基化修飾過(guò)程是可逆性的，包括甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和甲基化閱讀蛋白等共同參與[2]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，m6A不僅在正常的生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中都占據(jù)重要地位[3]。

目前研究表明m6A修飾過(guò)程在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)[4]。其中甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3（methyltransferase-like protein 3，METTL3）作為主要的m6A甲基化酶，通過(guò)調(diào)控下游分子甲基化水平參與正常生理和多種疾病的病理過(guò)程，且多項(xiàng)研究顯示METTL3在人類多種惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)且具有致癌/促癌特性[3]。本文將總結(jié)METTL3 在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中作用的最新研究進(jìn)展，探索其對(duì)乳腺癌的調(diào)控機(jī)制及其作為乳腺癌患者治療靶點(diǎn)的潛能。

1 參與m6A修飾的分子及其作用

研究已經(jīng)證實(shí)，m6A對(duì)RNA的甲基化修飾是可逆化過(guò)程，調(diào)控因子包括甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和甲基化閱讀蛋白等[5]。結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究表明，甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3 和METTL14 均具有關(guān)鍵的催化結(jié)構(gòu)域，在m6A 修飾過(guò)程中，兩者之間形成復(fù)合物，共同行使催化功能，其中METTL3 具有催化活性，而METTL14 主要負(fù)責(zé)底物識(shí)別，因此METTL3表達(dá)水平及活性對(duì)真核生物細(xì)胞內(nèi)m6A修飾水平起到重要的作用。Huang等[6]指出，m6A相關(guān)修飾酶在腫瘤中的表達(dá)水平不盡相同，環(huán)境因素和基因位點(diǎn)突變均可導(dǎo)致m6A狀態(tài)的改變，同時(shí)m6A修飾還可參與腫瘤靶向治療基因的調(diào)控。因此，METTL3 在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中占有重要的地位。

2 METTL3分子在乳腺癌中的表達(dá)情況

Zhang 等[7]首先在乳腺癌干細(xì)胞（breast cancer stem cell，BSCS）中發(fā)現(xiàn)，在缺氧刺激下缺氧誘導(dǎo)因子可促進(jìn)m6A 去甲基化酶ALKBH5 的表達(dá)，進(jìn)而使多能性因子NANOG 的甲基化水平下調(diào)、表達(dá)增加并誘導(dǎo)BSCS 表型，而ALKBH5 表達(dá)的下調(diào)可顯著減少BSCS 的數(shù)量，降低乳腺癌發(fā)生的能力，提示m6A甲基化水平對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要作用，而m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的表達(dá)水平則可直接影響乳腺癌中m6A 的修飾水平。有趣的是，沉默METTL3 表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力，并增強(qiáng)其凋亡水平[8]。隨后，F(xiàn)ry 等[9]在永生化的人類乳腺上皮細(xì)胞HMEC 中發(fā)現(xiàn)METTL3 表達(dá)及m6A 水平均下調(diào)，過(guò)表達(dá)METTL3可促進(jìn)該細(xì)胞的增殖和遷移潛能。Wu等[10]利用生存分析及Cox 單因素分析發(fā)現(xiàn)METTL3 表達(dá)水平與乳腺癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)；且另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織及細(xì)胞中，METTL3的表達(dá)均顯著升高[11]。

然而，一項(xiàng)針對(duì)轉(zhuǎn)移率和惡性程度高的三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer， TNBC） 的研究則發(fā)現(xiàn) ，METTL3在TNBC中呈低表達(dá)狀態(tài)，且與TNBC患者短距離無(wú)轉(zhuǎn)移生存率密切相關(guān)，敲除METTL3 可通過(guò)降低TNBC細(xì)胞中的m6A 水平進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移、侵襲和黏附能力[12]。Fry 等[9]則發(fā)現(xiàn)在永生化和轉(zhuǎn)化的乳腺上皮細(xì)胞中，METTL3的表達(dá)及m6A甲基化水平均顯著低于其親本細(xì)胞。

3 METTL3調(diào)控乳腺癌的分子機(jī)制

3.1 METTL3促進(jìn)乳腺癌增殖、抑制凋亡

失控性增長(zhǎng)是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特點(diǎn)之一，乳腺癌也不例外。研究認(rèn)為在脊椎動(dòng)物細(xì)胞凋亡過(guò)程中，線粒體處于凋亡調(diào)控的中心位置，而在線粒體通路中，凋亡信號(hào)激活含BH3 結(jié)構(gòu)域的Bcl-2 家族成員，后者發(fā)生寡聚化并插入線粒體膜，引起線粒體膜通透性改變，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。Wang 等[11]發(fā)現(xiàn)抗凋亡蛋白 Bcl-2 是 METTL3 的下游靶分子。在乳腺癌細(xì)胞和組織中，METTL3 表達(dá)水平顯著增高，敲減METTL3 表達(dá)可下調(diào)Bcl-2 的m6A 及表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其增殖能力。Cheng等[14]在探索二甲雙胍對(duì)乳腺癌的治療作用的研究中，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)p21是METTL3的潛在下游分子，METTL3可以通過(guò)依賴m6A的方式抑制p21的表達(dá)，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖；而二甲雙胍則以p21為主要靶點(diǎn)，通過(guò)抑制METTL3 的表達(dá)降低乳腺癌細(xì)胞中m6A 水平，進(jìn)而上調(diào)p21 表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，提示METTL3 是二甲雙胍治療乳腺癌的潛在靶點(diǎn)。

METTL3 通過(guò)m6A 修飾不僅可以調(diào)控下游蛋白表達(dá)，還可以通過(guò)調(diào)控非編碼RNA的表達(dá)水平調(diào)控后者的下游蛋白，進(jìn)而影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程。乙型肝炎X互作蛋白（hepatitis B X-interacting protein，HBXIP）的異常表達(dá)是驅(qū)動(dòng)乳腺癌侵襲性進(jìn)展的重要因素，Cai 等[8]研究發(fā)現(xiàn)HBXIP 可通過(guò)抑制小分子miRNA let-7g 進(jìn)而上調(diào)METTL3的表達(dá)，而上調(diào)的METTL3則可通過(guò)上調(diào)HBXIP的m6A修飾水平，進(jìn)而促進(jìn)HBXIP的表達(dá)，兩者正反饋調(diào)控，最終促進(jìn)了乳腺癌的增殖并抑制了凋亡的發(fā)生。Rong等[15]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng) 鏈 非 編 碼 RNA （long non-coding RNA， lncRNA）LINC00958 是METTL3 的下游分子，m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3 通過(guò)促進(jìn)LINC00958 甲基化水平上調(diào)后者的表達(dá)，而LINC00958則在乳腺癌增殖進(jìn)展過(guò)程中扮演促癌基因的作用，其通過(guò)吸附作用降低miR-378a-3p的表達(dá)，從而上調(diào)其下游基因YY1的mRNA 和蛋白水平，促進(jìn)乳腺癌的增殖能力。而LINC00675 在METTL3 甲基化的修飾下則增強(qiáng)了其作為內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNA 的作用，增強(qiáng)了其與miR-513b-5p 的相互作用，進(jìn)一步抑制了miR-513b-5p 對(duì)下游基因的抑制作用，從而抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力[16]。

近期，Wan 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中，PD-L1是METTL3 介導(dǎo)的m6A 修飾的下游靶點(diǎn)，抑制METTL3 表達(dá)可顯著下調(diào)m6A修飾水平，降低PD-L1的穩(wěn)定性，進(jìn)而增強(qiáng)PD-L1介導(dǎo)的T細(xì)胞激活和浸潤(rùn)，在體增強(qiáng)抗腫瘤免疫，對(duì)腫瘤免疫治療提供了新的治療策略和思路。

3.2 METTL3促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移

作為體表腫瘤，乳腺癌患者因癌死亡的主要原因是腫瘤的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，探索乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，將為延長(zhǎng)患者生存期和提高患者生存質(zhì)量提供幫助。Chen 等[18]篩選建立了乳腺癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞模型，即BCLMF3細(xì)胞，并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在BCLMF3細(xì)胞中m6A 甲基化水平及METTL3 的表達(dá)均顯著升高，而去甲基化酶FTO 明顯下調(diào)；METTL3通過(guò)甲基化角蛋白7（keratin 7，KRT7）的反義lncRNA KRT7-AS 的A877 位點(diǎn)，促進(jìn)KRT7-AS/KRT7 mRNA 的穩(wěn)定性及KRT7 的翻譯和表達(dá)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床研究都同樣證實(shí)METTL3 及其上調(diào)的KRT7 和KRT7-AS 均在乳腺癌肺轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是治療乳腺癌轉(zhuǎn)移的重要靶點(diǎn)。LncRNA 轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1，MALAT1）也是METTL3甲基化的下游分子[19]。METTL3通過(guò)上調(diào)MALAT1 的m6A 修飾水平進(jìn)而增加MALAT1 的表達(dá)，而MALAT1則可通過(guò)吸附miR-26b進(jìn)而上調(diào)其下游分子高遷移率基團(tuán)AT-Hook 蛋白2 （high mobility group at-hook protein 2，HGMA2），從而促進(jìn)乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過(guò)程和侵襲轉(zhuǎn)移能力[19]。

另一方面，Li 等[20]則發(fā)現(xiàn)METTL3基因在乳腺癌中高表達(dá)環(huán)狀circMETTL3，其作為內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)性RNA 拮抗miR-31-5p的作用，進(jìn)而上調(diào)其下游靶分子周期蛋白依賴性激酶1 促進(jìn)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移，而其宿主基因METTL3則可通過(guò)m6A 依賴的方式上調(diào)circMETTL3 的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展；該研究未發(fā)現(xiàn)circMETTL3 對(duì)其宿主基因表達(dá)的影響。然而，近期一項(xiàng)針對(duì)TNBC 的研究則認(rèn)為circMETTL3 可作為miR-34c-3p 的吸附海綿進(jìn)而促進(jìn)其下游分子METTL3的表達(dá)，發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、侵襲和腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的作用[21]。而免疫共沉淀研究發(fā)現(xiàn)，METTL3 可與EZH2 的mRNA 結(jié)合，并通過(guò)m6A 修飾促進(jìn)后者的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)下調(diào)E-cadherin 的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的EMT和轉(zhuǎn)移過(guò)程，加重乳腺癌的進(jìn)展[22]。

3.3 METTL3促進(jìn)乳腺癌耐藥

雌激素受體陽(yáng)性的Luminal 型乳腺癌患者對(duì)含他莫昔芬等藥物的內(nèi)分泌治療敏感，預(yù)后優(yōu)于其他類型的乳腺癌患者。然而，他莫昔芬耐藥的出現(xiàn)嚴(yán)重影響了患者生存期和生存質(zhì)量，Liu等[23]發(fā)現(xiàn)在他莫昔芬耐藥的乳腺癌細(xì)胞株中腺苷酸激酶4（adenylate kinase 4，AK4）和METTL4 表達(dá)均顯著上調(diào)。研究表明，在他莫昔芬耐藥的MCF-7乳腺癌細(xì)胞株中AK4的5′非翻譯區(qū)存在多個(gè)m6A修飾位點(diǎn)，在METTL3 調(diào)控下，AK4 表達(dá)顯著上調(diào)并進(jìn)一步激活活性氧自由基的產(chǎn)生及p38的磷酸化水平，從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)他莫昔芬的抗性。

而METTL3 的高表達(dá)同樣可以降低乳腺癌對(duì)阿霉素（adriamycin，ADR）的敏感性，研究表明，在ADR耐藥的MCF-7 乳腺癌細(xì)胞中下調(diào)METTL3 表達(dá)可降低pri-miR-221-3p 的m6A 甲基化水平，從而抑制后者的成熟，降低miR-221-3p 及多藥耐藥蛋白1 和乳腺癌耐藥蛋白的表達(dá)；另一方面，miR-221-3p 可通過(guò)與3′非翻譯區(qū)結(jié)合負(fù)向調(diào)控同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶2 （homeodomaininteracting protein kinase 2，HIPK2），進(jìn)而誘導(dǎo) ADR 耐藥的MCF-7 乳腺癌細(xì)胞的抗性。METTL3/miR-221-3p/HIPK2信號(hào)軸的發(fā)現(xiàn)闡述了乳腺癌化療耐藥的表觀遺傳學(xué)分子機(jī)制，并提供了新的治療靶點(diǎn)[24]。而Li 等[25]也發(fā)現(xiàn)MALAT1 作為METTL3 的下游分子同樣參與了乳腺癌對(duì)ADR 耐藥的過(guò)程，METTL3 甲基化修飾MALAT1 并上調(diào)后者的表達(dá)，進(jìn)而招募轉(zhuǎn)錄因子E2F1 直接結(jié)合于人前梯度蛋白2（anterior gradient 2，AGR2）的啟動(dòng)子區(qū)域促進(jìn)AGR2 的表達(dá)，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞對(duì)ADR 治療的抵抗。METTL3 同樣參與了同源重組修復(fù)的調(diào)控，抑制METTL3表達(dá)可降低同源重組修復(fù)的效率，并通過(guò)調(diào)節(jié)EGF/RAD51軸的m6A 修飾水平增加ADR 所誘導(dǎo)的DNA 損傷[26]。上述結(jié)果均提示，METTL3 介導(dǎo)的化療藥物反應(yīng)性改變，是惡性腫瘤治療的重要分子機(jī)制。

3.4 METTL3促進(jìn)乳腺癌腫瘤干細(xì)胞特性

腫瘤干細(xì)胞理論的提出為重新認(rèn)識(shí)腫瘤的起源和本質(zhì)提供了新的方向，也為臨床惡性腫瘤的治療提供了新的視角[27]，而對(duì)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的篩選為該類研究提供了有力的平臺(tái)[28]。Xie 等[29]研究表明，METTL3 在乳腺癌組織中高表達(dá)，同時(shí)與腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而敲減METTL3 的表達(dá)可顯著下調(diào)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物SOX2、CD133 和CD44 的表達(dá)水平，進(jìn)一步抑制乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而RNA 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)SOX2 是METTL3 的靶分子，METTL3 可與SOX2 的mRNA 直接結(jié)合并富集SOX2的表達(dá)。

NANOG 是維持干細(xì)胞自我更新增殖和亞全能性的關(guān)鍵因子，屬于胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，可增強(qiáng)腫瘤干細(xì)胞的多能干性，增加了惡性腫瘤的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[30]。而METTL3作為轉(zhuǎn)錄因子鋅指蛋白217 （zinc finger protein 217，ZNF217）的下游分子可以抑制NANOG的表達(dá)，ZNF217通過(guò)下調(diào)METTL3 及m6A 水平促進(jìn)NANOG 的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的干性和進(jìn)展[31]。

4 總結(jié)與展望

近期，He 等[32]利用TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)，在775 例乳腺癌患者中分析了24 種與m6A 修飾相關(guān)的重要調(diào)節(jié)因子的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)m6A調(diào)節(jié)因子與乳腺癌惡性程度、預(yù)后及抗腫瘤免疫反應(yīng)等密切相關(guān)，提示m6A修飾在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要的作用。而不同類型的惡性腫瘤中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3 的高表達(dá)均與患者不良預(yù)后密切相關(guān)，是腫瘤進(jìn)展過(guò)程中的重要標(biāo)志物[33]。本文通過(guò)對(duì)已發(fā)表的關(guān)于甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3 在乳腺癌中的作用分析后發(fā)現(xiàn)，METTL3主要通過(guò)提高乳腺癌細(xì)胞內(nèi)m6A修飾水平調(diào)控下游蛋白或非編碼RNA的表達(dá)水平，進(jìn)而影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。然而，由于表觀遺傳學(xué)中RNA 翻譯的復(fù)雜性，現(xiàn)有的研究結(jié)果對(duì)METTL3在乳腺癌進(jìn)展中的作用仍存在一定的爭(zhēng)議，對(duì)METTL3的作用及其調(diào)節(jié)乳腺癌的關(guān)鍵步驟和分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究和闡明。

雖然針對(duì)METTL3 作用的研究存在一定矛盾的結(jié)果，但其在乳腺癌中發(fā)揮促癌作用得到一定的認(rèn)可，且以METTL3或m6A修飾為分子診療靶點(diǎn)的研究展現(xiàn)出了相應(yīng)的效果，為患者帶來(lái)希望，受到了廣泛的關(guān)注[34]。此外，除了上述已報(bào)道的在乳腺癌中的作用機(jī)制外，METTL3 也在其他重要的生物過(guò)程起到重要的作用，如新陳代謝調(diào)節(jié)、血管生成失調(diào)、免疫逃逸等[35]。因此，深入研究并闡明METTL3及其調(diào)控的m6A修飾對(duì)明確乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，完善相關(guān)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探索乳腺癌精準(zhǔn)治療的潛在靶點(diǎn)等均具有重要的意義。同時(shí)迫切需要研發(fā)針對(duì)METTL3的抑制劑或小分子藥物，將為研究m6A修飾表型與乳腺癌表型間的關(guān)系提供條件，也使其在未來(lái)成功地應(yīng)用于乳腺癌患者的治療提供了可能。