基于CRISPR/Cas12a快速識(shí)別apxIVA的胸膜肺炎放線桿菌檢測(cè)平臺(tái)的建立

胸膜肺炎放線桿菌是引起豬急性呼吸道感染的重要病原菌之一，以急性出血性肺炎和慢性壞死性胸膜肺炎為主要特征。隨著我國集約化、工業(yè)化養(yǎng)豬模式的不斷發(fā)展，以及飼料中禁止添加抗生素政策的實(shí)施，都給該細(xì)菌性疾病的防控提出了新的挑戰(zhàn)。一旦豬只感染此病，生長發(fā)育速度變緩，飼料利用率變低，日增重及免疫抵抗力降低，其他生產(chǎn)性能也明顯下降，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

胸膜肺炎放線桿菌是革蘭氏陰性球桿菌，可以產(chǎn)生毒素。不同血清型分泌的外毒素種類不同，導(dǎo)致其毒力差異。已有研究表明現(xiàn)在分離鑒定的19 種血清型均可分泌毒素ⅠV 蛋白（ApxⅠV）。因此，apxⅠ-VA 基因也被認(rèn)為是APP 感染臨床診斷的理想檢測(cè)靶點(diǎn)。對(duì)于APP 感染的鑒定，通常使用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和分子生物學(xué)方法，而分離培養(yǎng)法相對(duì)耗時(shí)，因此人們更傾向于使用PCR 和qPCR 等分子生物學(xué)方法。但是，這兩種實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)，不僅要求昂貴的儀器設(shè)備，還需要操作熟練的專業(yè)技術(shù)人員，這給現(xiàn)地開展快速檢測(cè)帶來了一定的不便。

近期發(fā)表于《Frontiers in Microbiology》的“A CRⅠSPR/Cas12a-assisted rapid detection platform by biosensing the apxⅠVA ofActinobacillus pleuropneumoniae”一文介紹了一種快速識(shí)別胸膜肺炎放線桿菌核酸的快速檢測(cè)平臺(tái)，該方法將重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）與CRⅠSPR/Cas12a 快速識(shí)別系統(tǒng)相結(jié)合，并可依據(jù)檢測(cè)人員具備的硬件條件，通過3 種方法進(jìn)行結(jié)果的判定，最終實(shí)現(xiàn)APP 感染的快速檢測(cè)。

RPA 反應(yīng)依賴于多個(gè)酶的互相協(xié)同作用，反應(yīng)過程無需精密的儀器設(shè)備，僅需要一臺(tái)恒溫設(shè)備（金屬浴或水浴鍋）在37 ℃～42 ℃下，即可完成對(duì)目標(biāo)序列的指數(shù)擴(kuò)增。CRⅠSPR/Cas12a 檢測(cè)系統(tǒng)主要是利用crRNA 引導(dǎo)的Cas12a 識(shí)別靶序列后激活的Cas12a 非特異性切割單鏈DNA（ssDNA）活性，當(dāng)體系中兩端分別由熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)修飾的ssDNA被切割后，即可釋放出熒光，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。整個(gè)檢測(cè)過程可以在1 h內(nèi)完成。自從2018年Doudna 團(tuán)隊(duì) 首 次 使 用CRⅠSPR/Cas12a 進(jìn) 行HPV 的 快 速 檢測(cè)后，已有多個(gè)團(tuán)隊(duì)開發(fā)出針對(duì)不同種人類和動(dòng)物病原的快速檢測(cè)平臺(tái)，如Cas12aVDet、OCTOPUS 等。

該研究通過對(duì)crRNA、RPA 引物設(shè)計(jì)及篩選得到最佳檢測(cè)體系之后，以APP 現(xiàn)有的19 種血清型參考菌株和7 種常見的豬病病原和巴氏桿菌屬內(nèi)的8種與APP 親緣關(guān)系較近的菌種的基因組為模板，進(jìn)行了特異性分析，結(jié)果表明其對(duì)APP 具有高度特異性，沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)其它病原的交叉污染；同時(shí)通過使用人工構(gòu)建的載體和菌體進(jìn)行了靈敏度的分析，結(jié)果顯示其最低檢出量為10 cfu/反應(yīng)，與實(shí)驗(yàn)室常用的qPCR 方法具有相似的靈敏度。而對(duì)于實(shí)驗(yàn)室早期保存的肺臟樣品檢測(cè)時(shí)，表現(xiàn)出與傳統(tǒng)PCR 法高度的一致性。同時(shí)，在結(jié)果讀取時(shí)其可以在藍(lán)光儀激發(fā)條件下直接通過肉眼觀察，也可以通過酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光值測(cè)定或使用免疫層析試紙條直接觀察。以上讀取方式的選擇，一方面取決于檢測(cè)人員現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)條件，另一方面也需要結(jié)合檢測(cè)樣本的數(shù)量。盡管現(xiàn)階段其單次檢測(cè)成本高于常用的分子生物學(xué)方法，但對(duì)于滿足現(xiàn)場(chǎng)以及條件匱乏地區(qū)的APP 感染快速鑒定，無疑提供了一種候選方案。