蝙蝠寄生線蟲杜瑞特線屬新種的鑒定（圓形目，莫林科）

菅 蕊，徐 真，張東紅，徐鳳周，宋素潔，陳慧霞，劇慧棟*

（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000；2.河北工程大學(xué)，河北 邯鄲 056038；3.石家莊學(xué)院，河北 石家莊 050035；4.石家莊市人民醫(yī)院，河北 石家莊 050030；5.河北地質(zhì)職工大學(xué)，河北 石家莊 050086；6.河北師范大學(xué)，河北 石家莊 050010）

翼手目寄生線蟲到目前的記錄有13科25屬5個(gè)亞屬139 種，我國(guó)蝙蝠寄生線蟲的研究起步較晚，從伍獻(xiàn)文和劉健康（1940）發(fā)現(xiàn)中華刺圓線蟲[1]，到后來的馬金友（2004）對(duì)河南地區(qū)蝙蝠寄生線蟲的研究，總共報(bào)道3 科6 屬9 種。我國(guó)除了臺(tái)灣、河南、云南和廣西有過蝙蝠寄生線蟲的報(bào)道以外，其他省份關(guān)于蝙蝠寄生線蟲的報(bào)道很少[2-4]。一定程度上表明我國(guó)在蝙蝠寄生線蟲領(lǐng)域的研究還很薄弱，許多省份的蝙蝠寄生線蟲還沒有開展研究。本研究對(duì)采自小黃蝠體內(nèi)的線蟲使用光學(xué)和電子掃描顯微鏡觀察后確定該種屬于杜瑞特線屬，且為一新種，進(jìn)一步通過對(duì)其ITS-1 基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析后印證了上述結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料蟲體標(biāo)本采自2018 年廣東省龍門縣小黃蝠的小腸。用80 ℃左右的熱水將蟲體燙直，并將線蟲保存于70%酒精中。同時(shí)記錄宿主的種名、寄生部位、采集時(shí)間和地點(diǎn)。透明液（乳酸∶苯酚∶蒸餾水∶甘油=1∶1∶1∶2），由河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)與分子進(jìn)化實(shí)驗(yàn)室配制；DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PCR 試劑盒和蛋白酶K購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 線蟲的觀察、繪圖及鑒定將已固定的標(biāo)本用75%酒精或透明液制成臨時(shí)裝片，在光學(xué)顯微鏡下，對(duì)線蟲標(biāo)本的各個(gè)部分進(jìn)行初步的形態(tài)觀察，并使用顯微測(cè)微尺測(cè)量標(biāo)本的重要形態(tài)學(xué)特征，并記錄數(shù)據(jù)，借助可拍攝的光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡對(duì)線蟲標(biāo)本的主要形態(tài)特征鑒別并拍照，查閱文獻(xiàn)并對(duì)比確定線蟲種類[5]。模式標(biāo)本保存于河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。

1.3 線蟲ITS-1 基因的PCR 擴(kuò)增及序列分析從70%酒精中取出8 條雌蟲，分別置于不同的1.5 mL 離心管內(nèi)并做好標(biāo)記， 用蒸餾水漂洗3～5 次，提取DNA 為模板，采用文獻(xiàn)[6]中PCR 方法擴(kuò)增線蟲ITS-1基因。PCR 產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。利用MegAlign 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果及GenBank中莫林科11 種線蟲的ITS-1 基因序列進(jìn)行同源性分析。分別采用最大似然法（ML）和貝葉斯法（BI）構(gòu)建ITS-1 基因系統(tǒng)發(fā)育樹，將Amidostomoides monodon（KJ186098）和Amidostomoides acutum（KJ186097）設(shè)置為外群[7-8]，探究線蟲間的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 線蟲的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果與分析該線蟲的模式宿主為小黃蝠（翼手目，蝙蝠科）Scotophilus kuhlii（Leach）（Chiroptera，Vespertilionidae）。寄生部位為小腸，感染率為24%（解剖62只其中15只感染），感染強(qiáng)度為2～5 條（平均1.5 條）。宿主采集地為中國(guó)廣東省龍門縣。模式標(biāo)本中正模為1 條雄蟲（HBNU-M1004），配模為1條雌蟲（HBNU-M1005）。新種以模式宿主小黃蝠命名。

形態(tài)特征：蟲體較小、細(xì)長(zhǎng)、乳白色，具頭泡，身體中部最寬，向尾部逐漸變細(xì)。體表具細(xì)小的環(huán)紋，無側(cè)翼（圖1A 和圖2A、圖2B）。頭端具三瓣的口，口周有一對(duì)頭感器和4個(gè)頭乳突（圖2C），食道肌肉質(zhì)，呈棒狀，后端比前端稍寬，神經(jīng)環(huán)大約在食道前1/3 位置，神經(jīng)環(huán)、排泄孔、頸乳突（圖2D）距頭端的距離依次增大（圖1A 和圖2A），無排泄溝。體表具連續(xù)不斷的，數(shù)量不等的脊（圖1E、圖1F 和圖2E），雄蟲的脊開始于頭泡的末端，一直延伸至交合傘，雌蟲的脊起始于頭泡的末端，延伸至蟲體末端。體表脊垂直于體表，蟲體側(cè)面的脊明顯比其他部位的脊粗大，雄蟲頭泡位置脊的數(shù)量為34條，身體中部的脊增加到67條，交合傘前部脊的數(shù)量減少到52條。雌蟲頭泡位置脊的數(shù)量為30 條，身體中部的脊增加到75條，蟲體尾端脊的數(shù)量減少到38條。雄蟲兩交合刺刃部?jī)?nèi)腹側(cè)支。腹面觀時(shí)向右側(cè)彎曲（圖1H，圖1I）。引帶腹面觀近端為一個(gè)矛頭結(jié)構(gòu)，中間到遠(yuǎn)端部分，形態(tài)類似長(zhǎng)茄子，引帶中部有一條溝從“茄子”頂端開始在引帶后部結(jié)束，側(cè)面觀引帶頂端為錐形結(jié)構(gòu)，整體為不規(guī)則棒狀結(jié)構(gòu)，引帶前2/3 表面不光滑，有較密的凹點(diǎn)，后1/3 表面光滑（圖1J、圖1K）。雌蟲排卵器的前部與體表平行，排卵器的后半部分從陰道位置開始與體表呈45°角向陰道對(duì)側(cè)的體表延伸，一直到括約肌，從括約肌到漏斗部分垂直于體表向陰道側(cè)體表延伸，大約延伸到體腔的中部，子宮部平行于體表延伸（圖1C）。

其中正模（雄蟲1 條）：體長(zhǎng)10.5 mm，最大體寬240 μm，頭泡長(zhǎng)59 μm寬63 μm，神經(jīng)環(huán)、頸乳突、排泄孔到頭端的距離分別為140 μm、230 μm、210 μm。食道長(zhǎng)300 μm，最寬處為49 μm。交合傘對(duì)稱，側(cè)葉具斑點(diǎn)，交合傘肋的排列方式為2-1-2，第2肋和第3肋基部連接在一起并與主干相連，肋的遠(yuǎn)端分離。第5 肋和第6 肋的基部連接在一起并與主干相連，肋的遠(yuǎn)端分離。第4 肋比第3 肋和第5 肋稍短，且距離第3 肋和第5 肋的距離相等。第8 肋起于背肋基部，比背肋稍短。背肋從基部垂直向后延伸，首先向兩側(cè)各分出一個(gè)側(cè)支，隨后再分為兩支，每支又分為兩小支，分別為尾感器和第10 肋（內(nèi)側(cè)的分叉）（圖1G）。交合刺細(xì)長(zhǎng)，長(zhǎng)度為320 μm，交合刺柄部比刃部粗短，刃部具有橫紋的翼膜，遠(yuǎn)端部分為3個(gè)分支，外側(cè)支最長(zhǎng)最粗，內(nèi)腹支和內(nèi)背支在寬度和長(zhǎng)度上幾乎相等，較外側(cè)支明顯小，在腹面觀時(shí)兩根交合刺刃部的內(nèi)腹側(cè)支呈鉤狀并向右側(cè)彎曲。引帶長(zhǎng)127 μm，腹面觀近端為一個(gè)矛頭結(jié)構(gòu)，中間到遠(yuǎn)端部分類似長(zhǎng)茄子結(jié)構(gòu)，引帶中部有一條溝從“茄子”頂端開始在引帶后部結(jié)束，側(cè)面觀引帶頂端為錐形結(jié)構(gòu)，整體為不規(guī)則棒狀，引帶前2/3 表面不光滑，有較密的凹點(diǎn)，后1/3 表面光滑圖（圖1J、圖1K）。生殖錐由背唇和腹唇組成，腹唇呈三角形，背唇圓形，背唇上有兩個(gè)乳突，和一些不規(guī)則的凸起（圖2I）。

配模（雌蟲1條）：體長(zhǎng)15.2 mm，最大體寬292 μm，頭泡長(zhǎng)57 μm，寬83 μm，神經(jīng)環(huán)、頸乳突、排泄孔距離頭端的距離分別是142 μm、245 μm、230 μm，食道長(zhǎng)318 μm，最大寬度為72 μm。陰門距尾端4.2 mm，雙宮型，陰道短，大體與體表垂直，長(zhǎng)度98 μm，將前庭分為均等的兩部分，前庭長(zhǎng)325 μm，前括約肌和漏斗的長(zhǎng)度分別是45 μm 和90 μm，排卵器的前部與體表平行，排卵器的后半部分從陰道位置開始與體表呈45°角向陰道對(duì)側(cè)的體表延伸，一直到括約肌，從括約肌到漏斗部分垂直于體表向陰道側(cè)體表延伸，大約延伸到到體腔的中部，子宮部平行于體表并延伸，后括約肌和漏斗的長(zhǎng)度分別是47 μm 和72 μm，前子宮長(zhǎng)1.68 mm，后子宮長(zhǎng)1.7 mm，每個(gè)子宮有處于桑葚期的蟲卵（圖1D）15～32個(gè)，長(zhǎng)50 μm～98（77）μm（括號(hào)內(nèi)的數(shù)值為平均值，下同），寬29 μm～65（44）μm，尾部尖而圓（圖2B），長(zhǎng)度為73 μm，尾尖長(zhǎng)度為12 μm。

圖1 小黃蝠杜瑞特線蟲（Durettenema scotophili n.sp.），光鏡手繪圖譜，采自小黃蝠Fig.1 Hand drawing of Durettenema scotophili n.sp.from Scotophilus kuhlii based on optical microscope

圖2 小黃蝠杜瑞特線蟲（Durettenema scotophili n.sp）掃描電鏡圖譜，采自小黃蝠Fig.2 Scanning electron micrographs of Durettenema scotophili n.sp.from Scotophilus kuhlii

副模：雄蟲（10條），體長(zhǎng)10.3 mm～12.4（11.5）mm，最 大 體 寬215 μm～246（224）μm，頭 泡 長(zhǎng)41 μm～59（50）μm，寬51 μm～76（65）μm。神經(jīng)環(huán)、頸乳突、排泄孔距離頭端的距離分別為115 μm～134（123）μm、201 μm～235（217）μm 和200 μm～225（210）μm，食道長(zhǎng)270 μm～331（315）μm，最大寬度50 μm～68（59）μm，交合刺長(zhǎng)270 μm～490（380）μm，引帶116 μm～193（153）μm。雌蟲（12條），體長(zhǎng)13.1 mm～15.8（15.2）mm，最大體寬為259 μm～291（282）μm，頭泡長(zhǎng)43 μm～63（53）μm，寬72 μm～92（86）μm。神經(jīng)環(huán)神經(jīng)環(huán)、頸乳突、排泄孔距離頭端的距離分別為131 μm～167（150）μm、222 μm～242（235）μm、200 μm～230（223）μm。食道長(zhǎng)319 μm～399（358）μm，最大寬度為53 μm～83（68）μm。陰門距尾端4.1 mm～4.6（4.3）mm陰道長(zhǎng)92 μm～95（93）μm，前庭長(zhǎng)290 μm～323（312）μm，前括約肌和漏斗分別長(zhǎng)36 μm～50（43）μm和78 μm～102（89）μm后括約 肌 和 漏 斗 分 別 長(zhǎng)32 μm～50（43）μm 和72 μm～105（95）μm，前子宮長(zhǎng)1.56 mm～1.93（1.76）mm，子宮內(nèi)有10個(gè)～30（18）個(gè)蟲卵，后子宮長(zhǎng)1.5 mm～1.8（1.65）mm，子宮內(nèi)有12 個(gè)～39（23）個(gè)蟲卵，此時(shí)的蟲卵均處于桑葚期，蟲卵長(zhǎng)56 μm～85（75）μm，寬32 μm～61（45）μm，尾部長(zhǎng)59 μm～103（88）μm，尾尖長(zhǎng)10 μm～19（14）μm。

綜上所述，該線蟲具有杜瑞特線屬的形態(tài)特征。

杜瑞特線屬有兩個(gè)已知種，分別是廣東杜瑞特線蟲和蝠杜瑞特線蟲，本新種與廣東杜瑞特線蟲和蝠杜瑞特線蟲分別有以下區(qū)別：廣東杜瑞特線蟲的交合刺刃部的內(nèi)腹側(cè)支末端平直，小黃蝠杜瑞特線蟲交合刺刃部的內(nèi)腹側(cè)支末端彎曲呈鉤狀，而蝠杜瑞特線蟲交合刺刃部3 個(gè)分支的末端與前兩者相比鈍而粗。廣東杜瑞特線蟲的引帶腹面觀形狀像橄欖的種子，側(cè)面觀比腹面觀稍彎曲，表面光滑，蝠杜瑞特線蟲的引帶與廣東杜瑞特線蟲的引帶形態(tài)基本相似而小黃蝠杜瑞特線蟲的引帶腹面觀近端為矛頭結(jié)構(gòu)，中間到遠(yuǎn)端部分類似長(zhǎng)茄子，引帶中部有一條溝從“茄子”頂端開始在引帶后部結(jié)束，側(cè)面觀引帶頂端為錐形結(jié)構(gòu)，整體為不規(guī)則棒狀結(jié)構(gòu)，引帶前2/3 表面不光滑，有較密的凹點(diǎn)，后1/3 表面光滑。此外，廣東杜瑞特線蟲的陰道垂直于體表，整個(gè)排卵器和子宮組成的管道系統(tǒng)平行于體表，蝠杜瑞特線蟲的排卵器前半部分與體表平行，后半部分彎曲成一環(huán)狀后繼續(xù)延伸與體表平行，小黃蝠杜瑞特線蟲排卵器的后半部分從陰道位置開始與體表呈45°角向陰道對(duì)側(cè)的體表延伸，一直到括約肌，從括約肌到漏斗部分垂直于體表向陰道側(cè)體表延伸到約體腔的中部，子宮部平行于體表并延伸。綜上所述新種與杜瑞特線屬兩個(gè)已知種的形態(tài)均不相同，因此確定該種為杜瑞特線屬的一個(gè)新種。

2.2 基于ITS-1 基因序列的同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2.1 同源性分析 對(duì)所獲線蟲ITS-1 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并將其序列與GenBank 中莫林科11 種線蟲的20 條ITS-1 基因比對(duì)后的結(jié)果顯示，該線蟲與上述11 種線蟲的同源性是38.6%～99.4%，表明莫林科線蟲的ITS-1 基因呈遺傳多樣性。其中小黃蝠杜瑞特線蟲與細(xì)頸屬、小細(xì)頸屬、類細(xì)頸屬線蟲的同源性為41.9%～56.3%，小黃蝠杜瑞特線蟲與絲狀?yuàn)W庫(kù)線蟲的同源性為46.4%～47.5%，小黃蝠杜瑞特線蟲與廣東杜瑞特線蟲的同源性為96.7%，小黃蝠杜瑞特線蟲與蝠杜瑞特線蟲的同源性為96.0%，表明小黃蝠杜瑞特線蟲與杜瑞特線屬的兩種線蟲親緣關(guān)系更近，該種應(yīng)屬于杜瑞特線屬，小黃蝠杜瑞特線蟲與廣東杜瑞特線蟲和蝠杜瑞特線蟲的基因差別分別為3.3%和4.0%，結(jié)合形態(tài)學(xué)上的差別，表明該種與杜瑞特線屬的兩個(gè)已知種為不同種，該種為杜瑞特線屬的一個(gè)新種。

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析 本實(shí)驗(yàn)共選取NCBI 中莫林科線蟲的ITS-1 基因序列共20 條，包括2 亞科3 屬11種，選取Amidostomoides monodon（KJ186098）和Ami?dostomoides acutum（KJ186097）為外群。利用MEGA6.0和MrBayes3.2 軟件對(duì)線蟲的ITS-1 基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示構(gòu)建的ML 樹和BI 樹具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，充分表明了系統(tǒng)發(fā)育樹是可信的（圖3）。

圖3 基于ITS-1基因采用貝葉斯法和最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，只標(biāo)注支持度＞50%（重復(fù)1 000次）的數(shù)據(jù)Fig.3 ML and Bayes trees constructed using ITS-1 rDNA sequence data of Molineidae.Bootstrap value(1 000 replicates)of ＞50%are indicated

系統(tǒng)發(fā)育樹分為3 個(gè)分支，其中細(xì)頸屬的瑞士細(xì)頸線蟲Nematodirus helvetianus、花苞細(xì)頸線蟲Nemato?dirus spathiger、伊朗細(xì)頸線蟲Nematodirus oiratianus、棉絮細(xì)頸線蟲Nematodirus battus和小細(xì)頸屬的駱駝小細(xì)頸線蟲Nematodirella cameli以及類細(xì)頸屬的斑馬類細(xì)頸線蟲Nematodiroides zembrae組成一個(gè)分支。絲狀?yuàn)W庫(kù)線蟲Oswaldocruzia filiformis為一個(gè)分支。杜瑞特線屬的蝠杜瑞特線蟲Durettenema rhinolophi和廣東杜瑞特線蟲Durettenema guangdongense與小黃蝠杜瑞特線蟲Durettenema scotophilin.sp.組成一個(gè)分支。

系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示杜瑞特線屬與絲狀?yuàn)W庫(kù)線蟲的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[9-10]，但與細(xì)頸屬線蟲、小細(xì)頸屬線蟲以及類細(xì)頸屬線蟲的親緣關(guān)系相對(duì)較近[11-13]。小黃蝠杜瑞特線蟲、蝠杜瑞特線蟲與廣東杜瑞特線蟲組成一個(gè)分支，說明三者的親緣關(guān)系更近，且小黃蝠杜瑞特線蟲與廣東杜瑞特線蟲和蝠杜瑞特線蟲分屬兩支，說明其與廣東杜瑞特線蟲和蝠杜瑞特線蟲為不同的種，進(jìn)一步從基因方面印證該種為杜瑞特線屬的一個(gè)新種。

近十多年來，由蝙蝠攜帶的病原造成人類的重大傳染疾病事件已有多起，蝙蝠攜帶病原對(duì)人畜都有潛在的感染性，雖然目前尚無蝙蝠寄生線蟲感染人類的病例，但有可能在條件適宜的情況下造成人類的感染，因此該新種的發(fā)現(xiàn)使人類又掌握了一種新的潛在病原，為人畜寄生蟲病的預(yù)防提供了基礎(chǔ)資料，為將來可能發(fā)生的人畜寄生蟲病提供了病原學(xué)檢測(cè)依據(jù)。