PRRSV-1在我國(guó)的流行現(xiàn)狀及其感染防控的研究進(jìn)展

譚菲菲，周 智，田克恭,4*

（1.普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽(yáng) 471003；2.國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471003；3.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100125；4.國(guó)家/OⅠE豬繁殖與呼吸綜合征參考實(shí)驗(yàn)室，北京 100125）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine respiratory and re?productive syndrome，PRRS）俗稱“豬藍(lán)耳病”，是以母豬厭食和流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙及仔豬呼吸道癥狀為特征的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病[1]。20 世紀(jì)80 年代末，美國(guó)的豬場(chǎng)出現(xiàn)了一種“豬神秘病”，90 年代初德國(guó)也報(bào)道了癥狀相似的疫病，隨后很快蔓延至荷蘭、比利時(shí)、西班牙等國(guó)家[2]。1992 年5 月份在美國(guó)召開的第一屆國(guó)際豬病學(xué)術(shù)會(huì)上，統(tǒng)一將該病正式命名為“豬繁殖與呼吸綜合征”[3]，目前該病已在世界范圍內(nèi)普遍存在，且對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的影響。引起PRRS 的病原為PRRS 病毒（PRRSV）。1991 年，荷蘭首次分離到PRRSV，命名為L(zhǎng)elystad 株[4]，1992 年美國(guó)分離到另一株病毒，命名為VR2332 株[5]。1996 年郭寶清首次從我國(guó)豬場(chǎng)的流產(chǎn)胎兒中分離到了PRRSV CH-1a株，證實(shí)了該病毒在我國(guó)的存在[6]。2006 年我國(guó)暴發(fā)的高致病性PRRS（HP-PRRS）病，給中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7]。2013 年之后，類NADC30 株開始在我國(guó)流行，并逐漸成為豬群的流行株[8-9]。

根據(jù)2017 年國(guó)際病毒分類委員會(huì)（The Interna?tional Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）的最新分類原則，PRRSV 屬于套式病毒目動(dòng)脈炎病毒科Po?rarterivirus屬，進(jìn)一步可分為兩個(gè)種：PRRSV-1 和PRRSV-2[10]。PRRSV-1 和PRRSV-2 基 因 組 結(jié) 構(gòu) 相同，均為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，長(zhǎng)約15.4 kb，5'端到3'端 分 別 為5'非 編 碼 區(qū)（Untran-slated region，5'UTR）、ORF（Open reading frame）1、ORF2a、ORF2b、ORF3-ORF5、ORF5a、ORF6、ORF7、3'UTR，5'UTR 上游為帽子結(jié)構(gòu)，3'UTR 下游為Poly（A）尾[11-12]。ORF1占病毒基因組的80%，編碼病毒的復(fù)制酶復(fù)合體，通過(guò)核糖體移碼機(jī)制翻譯產(chǎn)生兩個(gè)多聚蛋白（Poly?protein）pp1a 和pp1ab，由ORF1a 編碼的3 種蛋白酶切割產(chǎn)生至少14 種非結(jié)構(gòu)蛋白（Nonstructural protein，Nsp），其 中Nsp2 變 異 最 大[13]。ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5a 分別編碼的糖基化膜蛋白（Glycoprotein，GP）GP2a、E（Envelope）蛋白、GP3、GP4、GP5a，是病毒的次要結(jié)構(gòu)蛋白；ORF5、ORF6、ORF7 分別編碼的糖基化囊膜蛋白GP5、非糖基化膜蛋白M（Membrane protein）、核衣殼蛋白N（Nucleocap?sid protein），是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白[14]。結(jié)構(gòu)蛋白的ORF 之間有不同程度的重疊，通過(guò)一系列共5'和3'端的亞基因組翻譯產(chǎn)生，其中GP5 是最易變異的結(jié)構(gòu)蛋白。

1 PRRSV-1 在我國(guó)的整體流行情況

2011 年陳南華等首次從2006 年～2009 年采集的臨床樣品中分離、鑒定出2 株P(guān)RRSV-1（BJEU06-1、NMEU09-1），這是首次在中國(guó)大陸發(fā)現(xiàn)PRRSV-1 臨床分離株[15]。國(guó)內(nèi)公開發(fā)表的文章與國(guó)家/OIE 豬繁殖與呼吸綜合征參考實(shí)驗(yàn)室2018 年～2020 年連續(xù)3 年的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，迄今為止PRRSV-1 已經(jīng)在我國(guó)至少22 個(gè)省份流行，遍布華中、華北、華南、華東、東北、西南地區(qū)[16-20]。顧小雪2011 年～2013 年對(duì)全國(guó)29 個(gè)省、市、自治區(qū)的98 個(gè)原種豬場(chǎng)進(jìn)行PRRSV病原監(jiān)測(cè)，結(jié)果連續(xù)3 年P(guān)RRSV-1 的個(gè)體陽(yáng)性率分別為0.26%、0.16%、0.03%，場(chǎng)陽(yáng)性率分別為8.16%、5.26%、1.08%[21]，表明PRRSV-1 在原種豬群中持續(xù)存在。國(guó)家/OIE PRRS 參考實(shí)驗(yàn)室連續(xù)3 年從原種豬場(chǎng)、屠宰場(chǎng)和臨床樣品中均能檢測(cè)到PRRSV-1，其中原種豬場(chǎng)2018 年、2019 年、2020年P(guān)RRSV-1 陽(yáng)性場(chǎng)的比例分別為6.3%（6/95）、9.6%（8/83）、3.8%（3/79），陽(yáng)性樣品的比例分別為1.4%（53/3823）、2.5%（119/4764）、0.1%（3/3148）。屠宰場(chǎng)2018 年、2019 年P(guān)RRSV-1 陽(yáng)性場(chǎng)的比例分別為10%（5/50）、3/46（6.5%），陽(yáng)性樣品的比例分別為0.4%（10/2480）、0.3%（13/4256）。臨床樣品2018 年、2019 年、2020 年的PRRSV-1 陽(yáng)性樣品比例分別為8.8%（10/114）、43.5%（10/23）、4%（2/50）。數(shù)據(jù)顯示原種豬場(chǎng)PRRSV-1 的檢出率高于屠宰場(chǎng)，表明我國(guó)PRRSV-1 的源頭可能仍與引種相關(guān)；而屠宰場(chǎng)持續(xù)檢出陽(yáng)性，表明PRRSV-1 已從原種豬場(chǎng)擴(kuò)散至商品豬場(chǎng)；臨床樣品的高檢出率提示出現(xiàn)疑似PRRS 臨床癥狀的豬群，既要檢測(cè)PRRSV-2、也要檢測(cè)PRRSV-1。翟少倫等收集了廣東省50 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的750 份樣品，其中PRRSV-1 陽(yáng)性率24.8%（186 份），是我國(guó)PRRSV-1 陽(yáng)性檢出率最高的報(bào)道[22]。

2013 年開始，本實(shí)驗(yàn)室持續(xù)對(duì)臨床樣品進(jìn)行PRRSV的監(jiān)測(cè)，檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行病毒分離和全基因組測(cè)序，至今共分離鑒定到5株P(guān)RRSV-1（P073-3、180420-1、180975-5、200604-75、181187-2），獲得6 條PRRSV-1 的全基因組序列（P073-3 的GenBank登 錄 號(hào)MK214314， 180900-5 的GenBank 登 錄 號(hào)MK303390；其余4 條序列未公開）[23]。截至2021 年10月，公開發(fā)表的文獻(xiàn)資料表明國(guó)內(nèi)分離鑒定的PRRSV-1 有53 株[16-20]；GenBank 共有32 條國(guó)內(nèi)提交的PRRSV-1 全基因組序列，另有27 條PRRSV-1 單個(gè)基因序列，以O(shè)RF5 為主，其中多條序列與PRRSV-1疫苗株的序列一致性達(dá)99%以上[18,20,24]。與國(guó)內(nèi)提交至GenBank 的上千條PRRSV-2 全基因組與單個(gè)基因序列相比，PRRSV-1 的序列仍較少，一方面由于PRRSV-1 不是國(guó)內(nèi)流行的PRRSV，另一方面反映了國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)對(duì)PRRSV-1 的重視程度不高。

2 PRRSV-1 的遺傳變異情況

2.1 遺傳進(jìn)化分析PRRSV-1 自1990 年在荷蘭發(fā)現(xiàn)以來(lái)，迅速蔓延到歐洲各個(gè)國(guó)家。歐盟內(nèi)部密集的豬肉貿(mào)易使病毒在各國(guó)家之間傳播，活疫苗的使用也加劇了PRRSV-1 的變異和進(jìn)化[25-27]。PRRSV-1分 為4 個(gè) 亞 型：Subtype I（Global）、Subtype I（Rus?sia）、Subtype II（Russia；Lithuania；Belarus）和Sub?type III[28]。西歐和中歐主要流行Subtype I（Global），目前僅此亞型蔓延到歐洲以外的地區(qū)，包括美國(guó)[29]、加拿大[30]、韓國(guó)[31-32]、中國(guó)[15]、泰國(guó)[33]等。

陳南華等在2017 年首次將國(guó)內(nèi)的PRRSV-1 分為4 個(gè) 基 因 亞 群[34]：Amervac-like、BJEU06-1-like、HKEU-16-like、NMEU09-1-like。其 中BJEU06-1、NMEU09-1-like 為國(guó)內(nèi)首次分離自北京、內(nèi)蒙古的PRRSV[15]；HKEU-16 為2007 年香港分離株；疫苗株指西班牙海博萊生物大藥廠（HIPRA）生產(chǎn)的活疫苗AMERVAC PRRS。目前為止國(guó)內(nèi)分離到的PRRSV-1以Subtype I（Global）居多，如廣西2020 年～2021 年新發(fā)PRRSV-1 的ORF5 基因與香港分離歐洲株HKEU16 親緣關(guān)系較近[35]。但焦臣鵬從廣東分離到的PRRSV-1 CN-2016 株與PRRSV-1 Lena 株的親緣關(guān)系較近[36]，Lena 為Subtype III 的代表株，表明可能有其他亞型的PRRSV-1 在我國(guó)出現(xiàn)。

顧瑞恒利用MEGA對(duì)本實(shí)驗(yàn)室獲得的6條PRRSV-1全基因組序列與GenBank 中的57 條全基因組序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果180975-5株位于Amervac-like亞群；P073-3 株位于NMEU09-1 亞群；180420-1、200604-75 株 位于BJEU06-1 like 亞群；而181187-2、180900-5 株與意大利分離的高致病性PRRSV（HPPRRSV）PR40/2014 株[37]遺傳距離較近，且形成一個(gè)新的分支[23]；6 條ORF5 序列與國(guó)內(nèi)外94 株ORF5 序列的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果與全基因組分析結(jié)果一致[23]。表明國(guó)內(nèi)的PRRSV-1 在持續(xù)發(fā)生變異或有新的病毒株被引入我國(guó)，且致病性可能有增強(qiáng)的趨勢(shì)，因此需要持續(xù)關(guān)注和監(jiān)測(cè)PRRSV-1 的流行情況。

2.2 氨基酸高變區(qū)序列分析國(guó)內(nèi)分離的PRRSV-1基因組的高變區(qū)主要位于非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2和結(jié)構(gòu)蛋白ORF3 的編碼區(qū)、ORF4 重疊區(qū)域[38]。最近有文獻(xiàn)報(bào)道從全國(guó)性病原監(jiān)測(cè)樣品中分離到4株P(guān)RRSV-1，全基因組核苷酸序列與LV 株的一致性介于87.4%～90.7%，變異區(qū)域主要集中于Nsp2、ORF3 和ORF4，且存在不連續(xù)的堿基缺失或插入，導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸缺失或插入[17,39]。對(duì)國(guó)內(nèi)代表株的Nsp2序列分析表明，與LV 株相比，我國(guó)PRRSV-1 Nsp2 區(qū)域存在至少12 種不同類型的插入或缺失模式，其中（aa357～aa360）+aa411 缺失是出現(xiàn)頻率最高的缺失類型[19]。本實(shí)驗(yàn)室獲得的6 株序列中有2 株（180420-1、200604-75）為該缺失模式；其余4 株的缺失類型如下：180975-5 株的aa288～aa294 缺失；P073-3 株的aa310～aa343+aa423～aa431缺失及aa697插入；180900-5和181187-2株的aa306～aa359 缺失，均為國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道的缺失/插入類型。對(duì)國(guó)內(nèi)代表株的ORF3、ORF4 重疊區(qū)域（LV 株重疊區(qū)域?yàn)?56 個(gè)堿基）進(jìn)行核苷酸序列分析，與LV 株相比，我國(guó)PRRSV-1 分離株ORF3 與ORF4 重疊區(qū)域的核苷酸存在不同長(zhǎng)度的缺失，進(jìn)而導(dǎo)致GP3、GP4 兩個(gè)蛋白的氨基酸均發(fā)生缺失。GP3的缺失特征如圖1A 所示，aa238～aa245 缺失與aa243缺失出現(xiàn)的頻率最高，本實(shí)驗(yàn)室獲得的P073-3 與180900-5、180420-1、181187-2 株分別具有這兩種缺失特征，200604-75 株的aa241～aa245 缺失，而180975-5 株未缺失。GP4 的缺失特征如圖1B 所示，aa60～aa67 缺失與aa63 缺失出現(xiàn)的頻率最高，本實(shí)驗(yàn)室獲得的P073-3 株與180900-5、180420-1、181187-26 株分別具有這兩種缺失特征，而200604-75 株的aa60～aa63+aa68 缺失，而180975-5 株未缺失。表明國(guó)內(nèi)分離的PRRSV-1 Nsp2 與ORF3/4 重疊區(qū)域仍是基因組變異較大的區(qū)域，且不斷地有新的缺失/插入類型被報(bào)道，進(jìn)一步提示需要持續(xù)關(guān)注PRRSV-1 的流行及序列變異情況。

圖1 ORF3與ORF4重疊區(qū)域核苷酸缺失導(dǎo)致的GP3、GP4氨基酸序列缺失特征

2.3 重組分析2017 年陳南華等在國(guó)內(nèi)分離到的PRRSV-1 HLJB1 株全基因組序列（KT224385）與疫苗株Amervac 的一致性最高（91.64%），但進(jìn)化樹分析HLJB1 株位于BJEU06-1 like 亞群；利用RDP4 重組軟件檢測(cè)到HLJB1 分離株為Amervac 疫苗株和BJEU06-1 株之間的重組，在ORF1a～ORF3 之間存在3 個(gè)潛在的重組斷點(diǎn)，是國(guó)內(nèi)第一篇PRRSV-1 疫苗株與野毒株自然重組的文章[34]。2020 年于芳等對(duì)GenBank 的91 條PRRSV-1 分離株的全基因組序列進(jìn)行重組分析，結(jié)果共有24 個(gè)重組株，其中5 個(gè)重組事件涉及疫苗株（1 株為國(guó)內(nèi)PRRSV HLJB1）[40]。

2021 年顧瑞恒利用RDP4 軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)室的6 株P(guān)RRSV 進(jìn)行重組分析，結(jié)果6 株病毒均不存在重組事件[23]。PRRSV 自身具有易重組的特性，雖然目前國(guó)內(nèi)報(bào)道的PRRSV-1 重組株較少，但隨著臨床越來(lái)越多的PRRSV-1 被檢測(cè)到，PRRSV-1 在自然界的重組也不容忽視，需要持續(xù)監(jiān)測(cè)分析。

3 我國(guó)PRRSV-1 的致病性研究

以LV 為代表的Subtype 1 亞型的PRRSV-1 均具有中等致病性，致宿主表現(xiàn)為輕微的臨床癥狀和病理變化[41-43]。但是從2006 年起東歐國(guó)家開始出現(xiàn)高致病性PRRSV-1[44]，之后西歐、韓國(guó)等地也出現(xiàn)HPPRRSV-1，宿主感染后均表現(xiàn)出更嚴(yán)重的臨床癥狀、病理變化、病毒血癥、高組織病毒載量或更高死亡率[32,45]。

我國(guó)目前報(bào)道的已經(jīng)做過(guò)致病性評(píng)價(jià)的PRRSV-1有3 株，分別為GZ11-G1 株[46]、HLJB1 株（KT224385）[47]、LNEU12 株[48]。3 株病毒的亞群、接種仔豬日齡及接種途徑、造成的臨床癥狀和主要的剖檢變化匯總?cè)绫?所示?？傮w而言，3株病毒均為中等致病性，接種后未造成仔豬死亡，主要的病變組織為肺臟和淋巴結(jié)。如前文所述，本實(shí)驗(yàn)室獲得的181187-2、180900-5株與意大利分離的HP-PRRSV 遺傳距離較近；但180900-5 株的致病性評(píng)價(jià)表明該病毒株為中等致病力，未表現(xiàn)出與國(guó)外HP-PRRSV-1 相同的致病力（文章未發(fā)表）。雖然目前國(guó)內(nèi)仍無(wú)HP-PRRSV-1 的出現(xiàn)，但國(guó)外HP-PRRSV-1 在陸續(xù)出現(xiàn)[49]，且隨著PRRSV-1 在國(guó)內(nèi)的持續(xù)演化變異及種豬貿(mào)易往來(lái)，國(guó)內(nèi)是否也會(huì)出現(xiàn)HP-PRRSV-1 株值得持續(xù)關(guān)注。

表1 國(guó)內(nèi)PRRSV-1分離株的致病性評(píng)價(jià)結(jié)果匯總

4 小結(jié)與展望

PRRS 自上世紀(jì)80 年代出現(xiàn)以來(lái)已在全球流行30 多年，研究者對(duì)其病原學(xué)、病毒與宿主互作、病毒遺傳變異特性等已經(jīng)有了更加深入的了解，但因其變異頻繁、容易重組等特性仍給PRRS 的防控帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)。目前PRRSV-2 仍是我國(guó)的主要流行株，且近年來(lái)PRRSV-2的變異與演化呈現(xiàn)加快、病毒株多樣性急劇增加的趨勢(shì)，新病毒株及重組病毒株出現(xiàn)的頻率不斷提高，已經(jīng)受到了廣泛關(guān)注[50]。與PRRSV-2 相比，目前PRRSV-1 對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的危害較小，但是近年來(lái)越來(lái)越多的PRRSV-1被分離到，病毒多樣性也在增加，應(yīng)引起足夠重視。

由于國(guó)內(nèi)的核心原種豬群主要通過(guò)不定期從國(guó)外引種來(lái)補(bǔ)充和更新，2018 年～2020 年連續(xù)3 年原種豬場(chǎng)PRRSV-1 的檢出率均高于屠宰場(chǎng)，表明我國(guó)PRRSV-1 的源頭可能仍與引種相關(guān)，所以引種前必須嚴(yán)格實(shí)施隔離檢疫，做到從源頭控制。盡管PRRSV-1 疫苗并未正式在我國(guó)注冊(cè)使用，但國(guó)內(nèi)多位研究者從臨床分離的PRRSV-1 的序列與疫苗株的序列一致性均較高[18,20,24,51]，表明國(guó)內(nèi)可能有豬場(chǎng)使用PRRSV-1 疫苗。雖然目前國(guó)內(nèi)報(bào)道的PRRSV-1 分離株的致病性均為中等，但為了避免疫苗株與野毒株重組產(chǎn)生HP-PRRSV-1 株，應(yīng)禁止非法使用PRRSV-1疫苗。

為貫徹落實(shí)《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》的有關(guān)要求，2021 年10 月，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關(guān)于推進(jìn)動(dòng)物疫病凈化工作的意見中明確將PRRS 列入需凈化的重大動(dòng)物疫病之一，需要在種豬場(chǎng)扎實(shí)開展PRRS 等垂直傳播性疫病的凈化。因此有必要持續(xù)關(guān)注PRRSV-1在我國(guó)豬群中的感染及造成的臨床疾病，并持續(xù)監(jiān)測(cè)其遺傳變異以及可能出現(xiàn)的新病毒株，為采取積極有效的防控策略積累必要的分子與流行病學(xué)研究基礎(chǔ)。在推進(jìn)凈化工作的時(shí)候，既要關(guān)注PRRSV-2株，同時(shí)也要關(guān)注PRRSV-1 株，同時(shí)需要強(qiáng)化針對(duì)PRRSV-1 和PRRSV-2 的檢測(cè)技術(shù)研究，建立及完善相應(yīng)的檢測(cè)方法與診斷標(biāo)準(zhǔn)。