Neuropilin-1與Furin：決定偽狂犬病毒毒力的關(guān)鍵宿主基因

豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要動物傳染病之一。豬是偽狂犬病毒的天然宿主。近年來，越來越多的證據(jù)表明PRV 可實現(xiàn)跨種間傳播感染人，對人類健康構(gòu)成潛在的威脅，尤其是在2011 年以后豬偽狂犬病毒變異毒株的爆發(fā)。PRV 完成生命周期的復(fù)制不僅依賴于病毒自身編碼的關(guān)鍵蛋白，也依賴于重要的宿主蛋白來完成。因此，尋找與PRV 編碼蛋白相互作用的重要宿主蛋白對闡明PRV 的發(fā)病機制以及抗病毒治療至關(guān)重要。PRV gB 是最保守的囊膜糖蛋白，與人單純皰疹病毒1（HSV-1）的gB 蛋白有50%的氨基酸序列同源性。然而，與HSV-1 gB 相比，PRV gB 含有一個弗林蛋白酶（furin）裂解位點“RARR”，該位點可被細胞中普遍表達的furin 所切割，并產(chǎn)生C-end Rule（CendR）基序。Furin切割位點在很多病毒的感染中發(fā)揮重要的作用。比如新型冠狀病毒（SARS-CoV-2），流感病毒中Furin 切割位點與病毒毒力高度相關(guān)，影響病毒的進入，組織嗜性，傳播模式等諸多方面。多項研究表明Furin 切割位點切割之后產(chǎn)生的CendR基序可與神經(jīng)細胞中高表達的Neuropilin-1（NRP1）蛋白相互作用。NRP1 也被認為是SARS-CoV-2 的受體之一。PRV 體內(nèi)主要感染的靶細胞就是神經(jīng)細胞，然而，NRP1 能否通過與gB 蛋白裂解產(chǎn)生的CendR 基序相互作用，進而參與PRV 的復(fù)制，以及PRV 的Furin 位點是否與該病毒的毒力相關(guān)等一些列問題尚不清楚。

近期發(fā)表于《Journal of virology》上的研究報道“Neuropilin-1 facilitates Pseudorabies virus replication and viral glycoprotein B promotes its degradation in a furin-dependent manner”發(fā)現(xiàn)，在RK13、HEK293T、Vero-E6 等細胞中瞬時轉(zhuǎn)染NRP1 真核表達質(zhì)粒促進了PRV 的復(fù)制。在神經(jīng)細胞SK-N-SH 中采用RNAi干擾技術(shù)敲低NRP1 的內(nèi)源表達降低了NRP1 的滴度，結(jié)果表明NRP1 可促進PRV 的復(fù)制。隨后使用不表達內(nèi)源Furin 的Lovo細胞證明NRP1 促進PRV 的復(fù)制不依賴于CendR 基序。為了進一步探究NRP1 參與PRV 復(fù)制的具體過程，研究人員探究了NRP1 對PRV 生命周期各個步驟的影響。首先在CHO 細胞中過表達NRP1 及PRV 已知受體Nectin-1，感染熒光素酶報告病毒6 h 后檢測熒光素酶信號，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nectin-1 轉(zhuǎn)染組，熒光素酶強度是對照組的23 倍，NRP1 轉(zhuǎn)染組是對照組的2 倍。由此說明NRP1 促進了PRV 的進入。由于NRP1 定位在細胞表面，研究人員進一步探究了NRP1 對PRV 吸附過程的影響。通過在過表達NRP1 的CHO 和HEK293T 細胞中感染PRV 病毒以及在SK-N-SH 和SH-SY5Y 細胞中干擾NRP1 后感染病毒，4℃吸附2 h 后檢測病毒拷貝，結(jié)果表明NRP1 促進PRV 的吸附。病毒囊膜蛋白誘導(dǎo)的細胞間融合（Cell-to-cell fusion）在PRV 感染過程中發(fā)揮重要作用，研究人員發(fā)現(xiàn)，NRP1 能夠促進PRV 糖蛋白gB，gD，gH 和gL 介導(dǎo)的細胞融合。通過免疫共沉淀（Co-ⅠP）試驗與雙分子熒光互補試驗（BiFC）證實了NRP1 與gB、gD 和gH 相互作用，與gL 沒有相互作用。更為有趣的是，NRP1 可被gB 特異性通過溶酶體途徑降解。最后，為了探究PRV gB中的Furin 切割位點是否影響PRV 毒力，研究人員構(gòu)建了一系列突變病毒并進行小鼠感染實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)，缺失furin 切割位點的PRV 病毒毒力明顯減弱，表明furin 在PRV 致病性方面起到了重要作用。然而，其具體分子機制需要進一步探索。

總之，該研究詳細解析了NRP1 促進PRV 復(fù)制的分子機制，為深入理解PRV 的致病機制以及開發(fā)新型抗病毒藥物提供依據(jù)。