黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系根際細(xì)菌多樣性分析

崔文文，劉夢(mèng)儀，陳海霞，王雪蓮，朱 華，張 蓉，崔金騰*

(1.北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院，北京102206；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所，北京100068)

河流污染是目前中國面臨最常見的環(huán)境問題之一，河道底泥富集大量的有害物質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致水質(zhì)急劇惡化，魚類及其他生物大量死亡。傳統(tǒng)的水污染治理方法主要有控制外源性和內(nèi)源性營養(yǎng)物質(zhì)[1]等，但是這些方法耗資大，且無法針對(duì)不同水體的整體特性進(jìn)行綜合治理，而以水生植物、細(xì)菌為主的生物治理方法能有效降低污染程度，適用范圍廣，經(jīng)濟(jì)成本低，不會(huì)對(duì)水體造成二次污染。特別是以植物與細(xì)菌為基礎(chǔ)的聯(lián)合修復(fù)技術(shù)不但可以降低污染水體中的污染負(fù)荷，而且能夠有效降低河道底泥的污染，在應(yīng)用過程中還可以獲得一定的經(jīng)濟(jì)效益，因此，水生植物-細(xì)菌聯(lián)合修復(fù)技術(shù)被應(yīng)用于越來越多的水體治理項(xiàng)目中[2]，成為治理富營養(yǎng)水體最有發(fā)展前景的技術(shù)。魏瑞霞等[3]在唐山市南湖公園用植物浮床-細(xì)菌修復(fù)富營養(yǎng)化水體，基本解決南湖公園水體的污染問題；鄒萬生等[4]利用苦草、菹草和細(xì)菌以及水芹菜、水蔥和細(xì)菌凈化珍珠蚌養(yǎng)殖廢水取得較好的凈化效果。研究表明，水生植物根系分泌物及環(huán)境因素會(huì)直接影響根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)又會(huì)影響細(xì)菌的功能[5]，進(jìn)而影響到對(duì)污染水體的凈化效果。同時(shí)，植物通過根系吸收、降解有害物質(zhì)，但植物與細(xì)菌種類不同其凈化效果差異很大，因此，研究不同植物-細(xì)菌體系對(duì)水體的凈化功能具有重要意義。

該研究將黃菖蒲種植在用河道底泥配置的水體中，添加枯草芽孢桿菌處理，構(gòu)建黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系，利用16S rDNA測(cè)序技術(shù)分析該凈化體系根部細(xì)菌的多樣性變化，以探究黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系在河道底泥的凈化效果，為水生植物-細(xì)菌聯(lián)合修復(fù)水體提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019年8月20日從沙河上游河道挖取河道底泥。選擇生長健壯、無病蟲害、生長期一致的黃菖蒲(Irispseudacorus)72株。從中國普通細(xì)菌菌種保存管理中心購置枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisBE_91)菌株。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 制備枯草芽孢桿菌菌液 采用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，恒溫培養(yǎng)搖床設(shè)定200 r/min、37 ℃，12 h取出菌液。在560 nm的波長下，測(cè)定枯草芽孢桿菌菌懸液的吸光度，定容菌懸液OD560 nm=0.8，放入冰箱備用。

1.2.2 試驗(yàn)材料的樣本分組與處理 將采集的河道底泥分成7份，每份5 L。其中1份作為對(duì)照組；3份置于花盆中，分別加入1 000 mL去離子水?dāng)嚢杈鶆虿?biāo)記水位，作為黃菖蒲組；3份置于花盆中，分別加入2 00 mL枯草芽孢桿菌菌液和800 mL去離子無菌水?dāng)嚢杈鶆虿?biāo)記水位，作為黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組。每組處理均為3次重復(fù)。

2019年9月9日栽種黃菖蒲，對(duì)照組、黃菖蒲組和黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組每盆種植8株黃菖蒲，置于25 ℃日光溫室中培養(yǎng)，根據(jù)水分蒸發(fā)情況，用去離子無菌水補(bǔ)充蒸發(fā)損失至標(biāo)記水位。生長到第42天，采集黃菖蒲組和黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組的黃菖蒲根部底泥，各處理組3次重復(fù)，均取根部底泥50 mL置于無菌PC管中，-20 ℃保存、備用。將試驗(yàn)分為第0天對(duì)照組(DAY0)、第42天黃菖蒲組(DAY42CK)和第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組(DAY42BS)。

1.3 根部細(xì)菌DNA提取和測(cè)序

使用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的土壤基因組DNA提取試劑盒(DP336)，提取第0天對(duì)照組、第42天黃菖蒲組和第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組根部底泥的DNA，并純化總DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定DNA完整性，提取的DNA于-20 ℃保存、備用。

將檢測(cè)合格的DNA利用16SrDNA V4區(qū)段引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為515F/806R(515F是5′-CAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R是5′-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[6]。DNA擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。建庫和測(cè)序委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成，采用HiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量雙端測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

使用合并配對(duì)端(V1.2.7, http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)[7]對(duì)每個(gè)樣本的測(cè)序進(jìn)行拼接，得到的拼接序列為原始序列數(shù)據(jù)，參照Qiime(V1.9.1，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)[8]的序列質(zhì)量控制流程處理得到高質(zhì)量的序列數(shù)據(jù)(Clean Tags)[9]。再將序列通過矢量化搜索(https://github.com/torognes/vsearch/)與物種注釋數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)[10]。利用代表性序列鑒定算法(Uparse Tags)軟件(Uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/)對(duì)所有樣本的全部有效序列進(jìn)行聚類，以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為可操作的分類單元，采用Mothur方法與SILVA132(http://www.arb-silva.de/)[11]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[12]進(jìn)行物種注釋。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計(jì)算物種種類指數(shù)，菌群多樣性指數(shù)，樣本多樣性指數(shù)；樣本多樣性指數(shù)組間差異分析采用威爾科克森秩和檢驗(yàn)方法分析，使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線。無度量多維標(biāo)定法統(tǒng)計(jì)組間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，用Qiime軟件(Version 1.9.1)計(jì)算Unifrac距離(多樣本的群落比較方法)、構(gòu)建非加權(quán)組平均法樣本聚類樹。利用顯著性差異分析的方法對(duì)組間的物種豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)，應(yīng)用線性判別分析處理組間差異性物種。應(yīng)用Tax4Fun，以SILVA數(shù)據(jù)庫序列為參考序列聚類出聚類和物種分類，進(jìn)而獲取功能注釋信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃菖蒲根部底泥細(xì)菌測(cè)序數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和質(zhì)控，過濾低質(zhì)量和短長度序列后得到清晰序列，其中第0天對(duì)照組、第42天黃菖蒲組和第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組樣本的清晰序列數(shù)分別為193 250條、186 947條和178 127條。進(jìn)行嵌合體過濾，得到可用于后續(xù)分析的有效序列，然后對(duì)所有樣本的有效數(shù)據(jù)以97%的一致性進(jìn)行聚類分析，分別得到4 668個(gè)序列、4 250個(gè)序列和4 953個(gè)序列(表1)。

表1 黃菖蒲根部底泥細(xì)菌16SrDNA測(cè)序數(shù)據(jù)Tab.1 16S rDNA sequencing data of bacteria in rhizosphere sediment of Iris pseudacorus

2.2 黃菖蒲根部底泥細(xì)菌多樣性分析

2.2.1 黃菖蒲根部底泥細(xì)菌多樣性指數(shù) 黃菖蒲根部底泥細(xì)菌多樣性指數(shù)見表2與圖1。3個(gè)處理組樣本間的物種數(shù)目在2 924～3 150之間，相差不大，說明檢測(cè)到的聚類數(shù)量無顯著差異。將黃菖蒲根部底泥細(xì)菌多樣性繪制為韋恩圖。3個(gè)處理組樣本間的共有細(xì)菌2 919種。除去共有細(xì)菌外，第0天對(duì)照組細(xì)菌1 749種；第42天黃菖蒲組細(xì)菌1 331種；第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組細(xì)菌2 034種。第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組細(xì)菌多樣性的值高，進(jìn)而說明黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系有效改變底泥群落多樣性狀況。在菌群多樣性中，第0天對(duì)照組、第42天黃菖蒲組的指數(shù)相差不大，說明黃菖蒲培養(yǎng)42 d后，沒有改變底泥中的細(xì)菌多樣性。在菌群豐度指數(shù)中，第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組明顯高于第0天對(duì)照組、第42天黃菖蒲組，說明黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系有效改變底泥群落多樣性狀況。

表2 黃菖蒲根部底泥細(xì)菌α多樣性指數(shù)Tab.2 Bacterial α diversity index in rhizosphere sediment of Iris pseudacorus

圖1 黃菖蒲根部底泥細(xì)菌多樣性Venn圖Fig.1 Venn diagram of bacterial diversity inrhizosphere sediment of Iris pseudacorus

2.2.2 黃菖蒲根部底泥細(xì)菌在門分類水平上的分布 根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個(gè)分組在門水平上較大豐度的前10名，生成物種相對(duì)豐度柱狀累加圖，如表3所示。第0天對(duì)照組、第42天黃菖蒲組和第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組在門水平上都以變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)為主，其中明顯優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門(Proteobacteria)。

表3 門水平上黃菖蒲根部底泥細(xì)菌群落組成Tab.3 Bacterial community composition in rhizosphere sediment of Iris pseudacorus at the phylum level

2.2.3 黃菖蒲根部底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異 第0天對(duì)照組、第42天黃菖蒲組和第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組組間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)位置分布明顯不同，經(jīng)過42 d的培養(yǎng)黃菖蒲對(duì)底泥樣本中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響(圖2)。第42天黃菖蒲組和第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組的位置分布存在明顯的差異，說明枯草芽孢桿菌同樣對(duì)底泥樣本的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組中的枯草芽孢桿菌通過營養(yǎng)和空間兩方面的競(jìng)爭(zhēng)形成區(qū)域優(yōu)勢(shì)菌群，抑制有害細(xì)菌的生長繁殖，從而達(dá)到改變底泥樣本中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的效果。

圖2 黃菖蒲根部底泥細(xì)菌群落無度量多維標(biāo)定法分析Fig.2 NMDS analysis of bacterial community in rhizosphere sediment of Iris pseudacorus

2.2.4 黃菖蒲根部底泥細(xì)菌組間差異線性判別分析 選取線性判別分析閾值大于4的物種分析作圖，如圖3所示。

第0天對(duì)照組和第42天黃菖蒲組差異比較發(fā)現(xiàn)(圖3A)，第0天對(duì)照組，厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、梭狀芽胞桿菌綱(Clostridia)、梭狀芽胞桿菌目(Clostridiales)和丙酸桿菌目(Propionibacteriales)的相對(duì)豐度具有顯著差異。第42天黃菖蒲組，擬桿菌門(Bacteroidetes)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、鞘脂桿菌目(Sphingobacteriales)和噬氫菌界(Hydrogenophilaceae)的相對(duì)豐度具有顯著差異。

圖3 黃菖蒲根部底泥細(xì)菌群落線性判別分析值分布Fig.3 LDA value distribution of bacterial community in rhizosphere sediment of Iris pseudacorus

第0天對(duì)照組和第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組差異比較發(fā)現(xiàn)(圖3B)，第0天對(duì)照組，放線菌門(Actinobacteria)、丙酸桿菌目(Propionibacteriales)和諾卡氏菌科(Nocardioidaceae)的相對(duì)豐度具有顯著差異。第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組中，擬桿菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、擬桿菌目(Bacteroidales)、噬氫菌科(Hydrogenophilaceae) 的相對(duì)豐度具有顯著差異。

第42天黃菖蒲組和第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組差異比較發(fā)現(xiàn)(圖3C)，在第42天黃菖蒲組中，伯克氏菌科(Burkholderiaceae)的相對(duì)豐度具有顯著差異；在第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組中，擬桿菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌綱(Bacteroidia)和擬桿菌目(Bacteroidales)的相對(duì)豐度具有顯著差異。

2.2.5 黃菖蒲根部底泥細(xì)菌功能相對(duì)豐度聚類分析 黃菖蒲根部底泥細(xì)菌功能相對(duì)豐度聚類分析見圖4。根據(jù)各個(gè)樣本中細(xì)菌功能聚類分析的熱度值，第0天對(duì)照組底泥中的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)功能具有發(fā)酵作用和化能異養(yǎng)的作用；第42天黃菖蒲組中黃菖蒲根部底泥細(xì)菌優(yōu)勢(shì)功能具有硫酸鹽呼吸作用和硫化物呼吸作用；第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組中黃菖蒲根部底泥細(xì)菌優(yōu)勢(shì)功能具有硝酸鹽還原、銨硫化物氧化、吸收氮元素和通過呼吸作用代謝硝酸鹽。各個(gè)時(shí)期的優(yōu)勢(shì)菌均有差異，其中黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組42 d的優(yōu)勢(shì)菌有較強(qiáng)的代謝底泥中硝酸鹽和吸收氮元素的能力，含氮元素的鹽類物質(zhì)中，尤其是NH4+對(duì)水中動(dòng)物的毒害能力很強(qiáng)，第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組菌群對(duì)NH4+的處理能力明顯強(qiáng)于未處理過的第0天對(duì)照組。

圖4 黃菖蒲根部底泥細(xì)菌功能注釋聚類熱圖Fig.4 Functional annotation cluster heat map of bacteria in rhizosphere sediment of Iris pseudacorus

3 討 論

黃菖蒲[13]是鳶尾科多年生挺水植物，在中國各地均有栽培，喜生于河湖沿岸的濕地或沼澤地，近年常用于園林綠化。黃菖蒲生物量大、適應(yīng)性強(qiáng)，根系發(fā)達(dá)，有較強(qiáng)的輸氧能力，可以產(chǎn)生好氧環(huán)境。水生植物對(duì)環(huán)境的修復(fù)作用主要有植物的吸收、吸附、富集作用和根際細(xì)菌的降解作用，其中根際細(xì)菌在修復(fù)過程中發(fā)揮更為重要的作用。細(xì)菌[14]通過降解有機(jī)物和代謝作用將富營養(yǎng)水體中的一些復(fù)雜有機(jī)物轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)單無機(jī)物，并從污染物中獲取新陳代謝的能量[15]。研究表明，植物的種植會(huì)對(duì)原生細(xì)菌有一定促進(jìn)作用，植物會(huì)使優(yōu)勢(shì)菌種相對(duì)豐度發(fā)生改變，同時(shí)提高原生細(xì)菌的豐度與多樣性[16]。

該研究基于諾禾致源HiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系根部細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，16S rDNA測(cè)序結(jié)果表明，黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系根部細(xì)菌群落多樣性和豐富度較高，共檢測(cè)到52個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門，各處理組的優(yōu)勢(shì)菌門差別較大，表明黃菖蒲和黃菖蒲-枯草芽孢桿菌[17]凈化體系在不同程度上改變根部底泥的細(xì)菌多樣性組成。Alpha多樣性指數(shù)差異性檢驗(yàn)分析表明，黃菖蒲沒有對(duì)底泥中細(xì)菌聚類數(shù)量、群落豐富度和多樣性造成顯著的影響，但是黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系有效改變底泥細(xì)菌群落多樣性狀況。該試驗(yàn)在黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系根部細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)方面，經(jīng)過42 d的處理，第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組和第42天黃菖蒲組都使底泥中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)差異，且第42天黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組差異較第42天黃菖蒲組更加明顯。

枯草芽孢桿菌具有凈化水體的功能[18]，能夠產(chǎn)生多種抗菌素和酶，抑制有害細(xì)菌生長繁殖，并促進(jìn)河流污染物的降解。黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系中，根部底泥大量富集能還原硝酸鹽、氧化銨硫化物、吸收氮元素和代謝硝酸鹽的細(xì)菌類群，其優(yōu)勢(shì)菌具有硝酸鹽還原、銨硫化物氧化、吸收氮元素和通過呼吸作用代謝硝酸鹽的功能，含氮元素的鹽類物質(zhì)中，尤其是NH4+對(duì)水中動(dòng)物的毒害能力很強(qiáng)，黃菖蒲+枯草芽孢桿菌組菌群對(duì)NH4+的處理能力明顯強(qiáng)于未處理過的第0天對(duì)照組，并且黃菖蒲-枯草芽孢桿菌聯(lián)合修復(fù)底泥污染能取得比僅用黃菖蒲更好的凈化效果。黃菖蒲-枯草芽孢桿菌凈化體系對(duì)降低河道底泥和污水中銨類物質(zhì)有較強(qiáng)的潛在能力，對(duì)恢復(fù)河流物種多樣性有較好的應(yīng)用前景。