淫羊藿苷配伍人參皂苷Rg1 對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的作用

葛業(yè)如，林芳花，鄧亞利*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學 制藥工程系，廣東 廣州 510642；2.惠州學院 生命科學學院，廣東 惠州 516007）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）是一種多種因素導(dǎo)致的慢性疾病，病理學上表現(xiàn)為骨組織結(jié)構(gòu)受損、骨質(zhì)變薄、骨小梁數(shù)量減少、骨脆性增加，其根本原因在于成骨和破骨的平衡被打破［1］。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）是成骨細胞的前體細胞，可以分化為軟骨、脂肪、骨細胞和一些其他類型的細胞［2］，在骨骼發(fā)育重建過程中起重要作用。

淫羊藿苷（icariin，ICA）是一種來源于淫羊藿的黃酮苷類化合物，具有健骨作用［3］。人參皂苷Rg1（rinsenoside Rg1，Rg1）是人參的主要藥理活性成分，具有抗衰老，促進細胞增殖，刺激造血干細胞形成的作用［4-6］。淫羊藿苷和人參皂苷Rg1 單體在促進干細胞成骨方面的作用已得到證實［7］，并且已有研究證明淫羊藿苷配伍三七總皂苷能夠促進成骨細胞增殖和鈣化［8］，人參皂苷Rg1 是三七總皂苷有效成分之一，因此，淫羊藿苷與人參皂苷Rg1 聯(lián)合用藥在干細胞成骨方面具有一定的研究意義。

本研究從藥物配伍的角度出發(fā)，通過體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化，研究淫羊藿苷和人參皂苷Rg1及配伍對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 研究材料

藥物與試劑：淫羊藿苷化學對照品，批號：110737-200312；人參皂苷Rg1 化學對照品，批號：110703-200322，購于中國藥品與生物制品檢定所。DMEM-12培養(yǎng)基購自美國gibco；甘油磷酸鈉購自北京索萊寶科技有限公司；抗壞血酸購自北京索萊寶科技有限公司；地塞米松購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清購自廣州百旺生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海星漢生物科技有限公司；熒光定量PCR檢測試劑盒購自美國genecopoeia 公司；骨成型蛋白2（bone mor‐phogenetic protein2，BMP2）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（osterix，OSX）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Run-related transcription factor2，RUNX2）等一抗購自上海艾博抗公司；二抗購自美國Jackson公司；ECL發(fā)光液購自杭州弗德生物技術(shù)有限公司。

儀器：SCIlogex 臺式高速離心機（美國SCIlogex 公司產(chǎn)品）；熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司產(chǎn)品）；Merinton 微量核酸定量儀（美林恒通儀器有限公司產(chǎn)品）；多功能酶標儀（上?，F(xiàn)科儀器有限公司產(chǎn)品）。

細胞：C57小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，購自廣州思晉生物技術(shù)有限公司，在37 ℃、5%CO2生物培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 研究方法

1.2.1 淫羊藿苷和人參皂苷Rg1對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的影響

淫羊藿苷和人參皂苷Rg1分別用DMSO溶解作為儲備液，用培養(yǎng)基稀釋不同濃度備用。

骨髓間充質(zhì)干細胞分種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，換無血清培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的單體藥物使淫羊藿苷終濃度分別為0.1 、1 、10μmol／L，人參皂苷Rg1 終濃度分別為10、20、40μmol／L。分別在加藥后培養(yǎng)24、48、72 h 后棄去原來的培養(yǎng)基，并用PBS 清洗2次，每孔加入100μL新鮮培養(yǎng)基和10μL CCK8試劑，37 ℃孵育1～4 h，于450 nm處檢測吸光度（A）值。

1.2.2 最佳配伍濃度的確定

淫羊藿苷濃度分為A1（0.1μmol／L）、A2（1μmol／L）、A3（10μmol／L）3組，人參皂苷Rg1分為B1（10μmol／L）、B2（20μmol／L）、B3（40μmol／L）3 組，采用交互配比試驗法，按1.2.1研究方法測定。

1.2.3 小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)

將小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞接種到6 孔培養(yǎng)板中，根據(jù)CCK-8檢測結(jié)果設(shè)置空白對照組、經(jīng)典成骨對照組、淫羊藿苷組、人參皂苷Rg1 組、配伍組。細胞融合度達到70%時更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每3 天更換1 次培養(yǎng)基，分別在成骨誘導(dǎo)16、30 d后進行指標檢測。

1.2.4 鈣化結(jié)節(jié)分析

分別在成骨誘導(dǎo)16、30 d后，棄去6孔培養(yǎng)板中的細胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，1.5%茜素紅染色20 min，去除染色液，用蒸餾水洗滌1~2次終止顯色反應(yīng)，于顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)情況。

1.2.5 實時熒光定量PCR分析

在成骨誘導(dǎo)16、30 d后提取各組細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄實時定量PCR 檢測BMP2、RUNX2、OPN、OCN 等mRNA表達，引物信息見表1。熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸35 s。由PCR 反應(yīng)曲線得到ct值，以β-actin為內(nèi)參，計算相對定量結(jié)果。

表1 基因引物及片段長度

1.2.6 Western blotting分析

在成骨誘導(dǎo)16、30 d后提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，制備12%分離膠和5%濃縮膠加足夠的電泳液后上樣電泳。濃縮膠電壓75 V，分離膠用120 V。電泳至溴酚藍剛跑出即可終止電泳，在200 mA條件下轉(zhuǎn)膜1 h。5%的脫脂牛奶（0.5%TBST配），封閉1 h，稀釋比例為1∶1 000的一抗孵育過夜，稀釋比例為1∶5 000 的二抗孵育30 min。洗膜、曝光、顯影定影，Image J軟件處理系統(tǒng)分析目標帶光密度值。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以±s表示（n=3），用ANOVA 進行統(tǒng)計學檢驗，組間比較P＜0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物濃度的篩選

2.1.1 淫羊藿苷和人參皂苷Rg1對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的影響

與對照組相比，加入淫羊藿苷和人參皂苷Rg1 均能夠促進細胞增殖，淫羊藿苷的最佳濃度為1μmol／L，人參皂苷Rg1 的最佳濃度為10μmol／L，與對照組相比均有顯著差異（P＜0.05）（圖1）。

圖1 淫羊藿苷和人參皂苷Rg1單體對BMMSCs增殖的影響

2.1.2 最佳配伍濃度的確定

CCK-8 細胞增殖檢測結(jié)果顯示，與對照組相比淫羊藿苷和人參皂苷Rg1配伍組均能夠增加細胞增殖能力，并且高于淫羊藿苷和人參皂苷的單體作用，配伍組合中淫羊藿苷1μmol／L 與人參皂苷Rg1 20μmol／L組合促進細胞增殖作用最強，與對照組相比，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（表2）。

表2 淫羊藿苷和人參皂苷Rg1不同配伍對BMMSCs增殖的影響

2.2 鈣化結(jié)節(jié)分析

成骨誘導(dǎo)16 d 后空白對照組無鈣化現(xiàn)象，淫羊藿苷與人參皂苷Rg1 配伍組鈣化程度高于其他各組；成骨誘導(dǎo)30 d 后空白對照組發(fā)生自分化出現(xiàn)鈣化現(xiàn)象，但鈣化程度小于其他處理組，淫羊藿苷與人參皂苷Rg1配伍組鈣化程度高于其他各組（圖2）。

圖2 不同處理條件下茜素紅染色結(jié)果（100x）

2.3 實時熒光定量PCR分析

與誘導(dǎo)16 d相比，誘導(dǎo)30 d細胞BMP2、Runx2、OSX以及OPN mRNA的表達水平均呈上升趨勢。在誘導(dǎo)16 d和30 d后，與空白對照組及經(jīng)典成骨對照組相比，淫羊藿苷單體組、人參皂苷Rg1單體組、聯(lián)合用藥組均能夠增加BMP2、Runx2、OSX 以及OPN mRNA 的表達量，配伍組各基因表達水平高于其他組，且與空白對照組和經(jīng)典成骨對照組均具有顯著差異（P＜0.05）（圖3）。

圖3 不同處理對BMMSCs成骨相關(guān)基因表達的影響

2.4 Western Blotting分析

BMP2、Runx2、OSX 及OPN 蛋白的表達水平隨誘導(dǎo)時間增加均呈上升趨勢。與空白對照組及經(jīng)典成骨對照組相比，淫羊藿苷單體組、人參皂苷Rg1 單體組、配伍組均能夠增加BMP2、Runx2、OSX 以及OPN 蛋白的表達量，配伍組各蛋白表達水平高于其他組，且與空白對照組和經(jīng)典成骨對照組均具有顯著差異（圖4）。

圖4 不同處理對BMMSCs成骨相關(guān)蛋白表達的影響

3 討論與結(jié)論

在研究淫羊藿苷和人參皂苷Rg1單體對C57小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖作用時，分別對3 個濃度進行檢測，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷和人參皂苷Rg1 單體最佳濃度分別為1μmol／L 和10μmol／L，與對照組相比有顯著差異（P＜0.05）。兩者交互配比結(jié)果表明淫羊藿苷和人參皂苷Rg1配伍均能促進C57小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖，1 μmol／L 淫羊藿苷和20 μmol／L 人參皂苷Rg1組合效果最佳，細胞增殖大于單體用藥，與對照組相比差異顯著（P＜0.01）。

在淫羊藿苷濃度固定為1μmol／L，人參皂苷Rg1濃度依次為10、20、40μmol／L時，結(jié)果表明：人參皂苷濃度依次增大，并未呈現(xiàn)出量效關(guān)系；而是與20μmol／L人參皂苷Rg1 配伍效果最佳，提示配伍量效關(guān)系出現(xiàn)了拐點，應(yīng)進一步細化濃度配伍的測試點，繪制出精密的量效關(guān)系圖。

文中首次運用淫羊藿苷配伍人參皂苷Rg1研究其在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化中的作用。加藥后各組鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量均多于空白對照和經(jīng)典成骨對照，配伍組鈣結(jié)節(jié)分化最為顯著，直觀地證明了淫羊藿苷配伍人參皂苷Rg1對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨的促進作用。

實時熒光定量PCR 和Western Blotting 分析結(jié)果表明，淫羊藿苷配伍人參皂苷Rg1 能夠上調(diào)骨髓間充質(zhì)干細胞中BMP2、Runx2、Osx、OPN 等成骨分化標志因子（P＜0.05）。BMP2 作為成骨誘導(dǎo)因子，可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，抑制其向其他類型的細胞分化［9］。Runx2 過表達導(dǎo)致新骨形成［10］。Osx 也是一種重要的調(diào)節(jié)成骨細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，在成骨分化及骨形成過程中起到非常重要的作用［11］。OPN 與成骨分化晚期相關(guān)，表達在成熟的成骨細胞中［12］。

綜上所述，淫羊藿苷與人參皂苷Rg1 配伍能夠增加BMMSCs 成骨能力，這可能與上調(diào)成骨因子促進BMMSCs 向成骨分化形成新的骨細胞并且抑制BMMSCs 向其它細胞分化相關(guān)。并且淫羊藿苷和人參皂苷Rg1能夠顯著促進BMMSCs增殖，未見明顯的毒性反應(yīng)，具有良好的治療骨質(zhì)疏松癥前景。