富含納豆激酶抹茶納豆酸奶的發(fā)酵工藝研究

周艷華，李 濤 *，黃小波，劉 穎，陳嘉正

（1.長沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，湖南 長沙 410111）

納豆（natto）是由大豆接種納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto）發(fā)酵而成的一種具有悠久歷史的豆制品，起源于中國，盛行于日本[1]。納豆富含納豆激酶（nattokinase，NK），其具有多種生理功能，如抗血栓[2]、抗高血壓[3]、抗凝血[4]、抗動脈粥樣硬化[5]、降低膽固醇等[6-7]。隨著我國人口老齡化日益嚴(yán)重，老年病如高血壓、高血脂、高血糖等發(fā)病率越來越高，據(jù)世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）數(shù)據(jù)顯示，全世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)約占全世界死亡總?cè)藬?shù)的1/3，我國心腦血管疾病死亡人數(shù)最高[8]。

納豆激酶是一種絲氨酸蛋白酶，納豆雖富含NK，具保健功能，但因其強烈的“氨臭味”一直未被國人所接受[9]。因此改良納豆風(fēng)味，消除掩蓋其“氨臭味”，提高消費者的接受度尤為重要。目前，改良納豆風(fēng)味的方法主要有優(yōu)化發(fā)酵菌種、添加發(fā)酵底物和添加輔料等[10]。隨著“健康中國2030”國民營養(yǎng)計劃的開啟，消費者的營養(yǎng)健康意識不斷增強，具有功能性的酸奶的研究開發(fā)逐漸成為熱點[11]，目前關(guān)于納豆酸奶的研究報道甚少，僅見于個別專利中[12]，因此開發(fā)具有一定保健功能的納豆酸奶具有重要的意義。

抹茶是采用覆蓋栽培的茶樹鮮葉經(jīng)蒸汽（或熱風(fēng)）殺青后、干燥制成的葉片為原料，經(jīng)研磨工藝加工而成的微粉狀茶產(chǎn)品，抹茶粉因清新爽口的茶香味可起到掩蔽劑的作用[13]。因此，本研究采用添加輔料抹茶粉和通過乳酸菌發(fā)酵的方式消除掩蓋納豆的“氨臭味”，以納豆豆?jié){和復(fù)原乳為主要原料，制備富含NK抹茶納豆酸奶，分別采用單因素試驗及正交試驗優(yōu)化其發(fā)酵工藝，并從感官、理化、微生物指標(biāo)方面對成品進(jìn)行品質(zhì)評價。以期為富含NK功能食品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

大豆、抹茶粉、白砂糖、全脂奶粉（蛋白質(zhì)含量22.0g/100g、脂肪26.0 g/100 g、碳水化合物45.5 g/100 g）：市售；乳酸菌發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）二者比例為1∶1）：北京川秀有限公司；納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilisnatto）（BNCC 185324）：北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1.0 L，pH 7.0。121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；EFG4H恒溫振蕩器：常州智博瑞儀器制造有限公司；SLS-60高壓均質(zhì)機：上海申鹿均質(zhì)機有限公司；SWCJ-IFD潔凈工作臺：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；YXQ-LS-I8SI不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DJ13B-D08型家用豆?jié){機：九陽股份有限公司；UV-5100紫外分光光度計：上海精密儀器儀表有限公司；AL104-01電子分析天平、PHS-3C精密酸度計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KPB-V1358攪拌機：深圳市康佳電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 富含NK抹茶納豆酸奶加工工藝流程及操作要點

操作要點：

納豆芽孢桿菌發(fā)酵劑的制備：將200 μL 納豆芽孢桿菌發(fā)酵劑凍干粉倒入10 mL營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基試管中，置于30 ℃復(fù)活、增殖24 h，即為后期所用的發(fā)酵劑。

納豆豆?jié){的制備：篩選顆粒飽滿的大豆100 g，清洗后置于800 mL純凈水中25 ℃浸泡12 h，去皮瀝干，按豆水比1∶9（g∶mL）加入豆?jié){機中磨漿，經(jīng)80目濾網(wǎng)過濾得豆?jié){[14]。將豆?jié){煮沸，經(jīng)冷卻后按1%的接種量接種納豆芽孢桿菌，并于37 ℃有氧發(fā)酵24 h，即得納豆豆?jié){。

復(fù)原乳的制備：將全脂乳粉與蒸餾水在50 ℃條件下按照料液比1∶6（g∶mL）混合，加入6%～8%白砂糖，不斷攪拌至完全溶解?；旌先橐涸跍囟?0 ℃、10～20.0 MPa條件下均質(zhì)10 min，在90 ℃條件下滅菌10～15 min，立刻冷卻至42 ℃，即得復(fù)原乳。

納豆乳液：將納豆豆?jié){與復(fù)原乳按比例6%～8%混合均勻，即得納豆乳液。

接種、發(fā)酵：無菌條件下，向納豆乳液中按比例迅速接種乳酸菌0.2%～0.4%，抹茶粉0.5%～0.7%，攪拌均勻，置于42 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，直至凝乳形成。

后熟：發(fā)酵完成后，置于4 ℃條件下冷藏后熟12 h，即得富含NK抹茶納豆酸奶成品。

1.3.2 富含NK抹茶納豆酸奶發(fā)酵工藝優(yōu)化

單因素試驗：在白糖添加量6%、抹茶粉添加量0.5%、乳酸菌接種量0.3%、發(fā)酵時間4 h的基本條件下，以感官評分為評價指標(biāo)，考察納豆豆?jié){添加量（2%、4%、6%、8%、10%）對富含NK抹茶納豆酸奶感官品質(zhì)的影響。在此基礎(chǔ)上，依次考察白砂糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、抹茶粉添加量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）、乳酸菌接種量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、發(fā)酵時間（4 h、6 h、8 h，10 h、12 h）對富含NK抹茶納豆酸奶感官品質(zhì)的影響。

正交試驗：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以感官評分為評價指標(biāo)，選擇對抹茶納豆酸奶的評分有較大影響的4個因素納豆豆?jié){添加量（A）、白砂糖添加量（B）、抹茶粉添加量（C）、乳酸菌接種量（D），采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化富含NK抹茶納豆酸奶發(fā)酵工藝。正交試驗因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation process optimization

1.3.3 分析檢測

納豆激酶酶活的測定：參考改良的紫外分光光度法[15]；蛋白質(zhì)的測定：參考GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》[16]；脂肪的測定：參考GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》[17]；非脂乳固體的測定：參考GB 5413.39—2010《乳和乳制品中非脂乳固體的測定》[18]；酸度的測定：參考GB 5009.239—2016《食品酸度的測定》[19]：微生物指標(biāo)檢測：參考GB 4789.18—2016《食品微生物學(xué)檢驗乳與乳制品檢驗》[20]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析，并采用Duncan法檢驗數(shù)據(jù)的差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

1.3.5 富含NK抹茶納豆酸奶感官評價

采用主觀賦權(quán)法，選取20名專業(yè)品評員對富含NK抹茶納豆酸奶進(jìn)行感官評分（滿分100分），并取其平均值[21]。感官指標(biāo)評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 富含納豆激酶抹茶納豆酸奶感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of matcha natto yogurt rich in nattokinase

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 納豆豆?jié){添加量的確定

納豆豆?jié){添加量對富含NK抹茶納豆酸奶感官評分的影響見圖1。

圖1 納豆豆?jié){添加量對富含納豆激酶抹茶納豆酸奶感官品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of natto milk addition on sensory quality of matcha natto yogurt rich in nattokinase

由圖1可知，納豆豆?jié){添加量對感官評分有顯著的影響（P＜0.05）。當(dāng)納豆豆?jié){添加量＜6%時，感官評分變化不大。當(dāng)納豆添加量過少時，酸奶拉絲現(xiàn)象不明顯，保健功能不突出，因此在感官評分無顯著差異的情況下，應(yīng)盡可能選擇高的納豆豆?jié){添加量，以提高富含NK抹茶納豆酸奶的功效；當(dāng)納豆豆?jié){添加量為6%時，感官評分最高，為76.8分；但當(dāng)納豆豆?jié){添加量＞6%時，感官評分有顯著差異（P＜0.05），其感官評分急劇下降，這主要是由于隨著納豆豆?jié){添加量的增高，納豆中的“氨臭味”也逐漸突出，適口性差，導(dǎo)致其感官評分逐漸下降。因此，選擇最適納豆豆?jié){添加量為6%。

2.1.2 白砂糖添加量的確定

白砂糖添加量對富含NK抹茶納豆酸奶感官評分的影響見圖2。由圖2可知，白砂糖添加量對感官評分有顯著的影響（P＜0.05），當(dāng)白砂糖添加量＜8%時，其感官評分隨著白糖添加量的增加而增高；當(dāng)白砂糖添加量為8%時，其感官評分最高，為85.0分；當(dāng)白砂糖添加量＞8%時，其感官評分隨著白砂糖添加量的增加而逐漸趨于平緩。因此，考慮到生產(chǎn)成本等因素，選擇最適白砂糖的添加量為8%。

圖2 白砂糖添加量對富含納豆激酶抹茶納豆酸奶感官品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of sugar addition on sensory quality of matcha natto yogurt rich in nattokinase

2.1.3 抹茶粉添加量對富含NK抹茶納豆酸奶品質(zhì)的影響

抹茶粉添加量對富含NK抹茶納豆酸奶感官評分的影響見圖3。

圖3 抹茶粉添加量對富含納豆激酶抹茶納豆酸奶感官品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of matcha powder addition on sensory quality of matcha natto yogurt rich in nattokinase

由圖3可知，抹茶粉添加量對感官評分有顯著的影響（P＜0.05），抹茶粉添加量在0～0.7%范圍內(nèi)，隨抹茶粉添加量的增加，其感官評分逐漸增高；抹茶粉添加量增加至0.7%，感官評分最高，為85.6分；當(dāng)繼續(xù)增加至0.9%時，感官評分稍有下降。添加抹茶粉不僅可賦予酸奶良好的風(fēng)味，還增加了酸奶的營養(yǎng)價值，抹茶粉中的茶多酚為NK抹茶納豆酸奶增加了抗氧化等功效，并具有一定的掩蓋納豆“氨臭味”的作用。抹茶粉添加量為0.5%～0.7%時，感官評分趨于平穩(wěn)。因此，考慮到生產(chǎn)成本，選擇最適抹茶粉的添加量為0.5%。

2.1.4 乳酸菌接種量的確定

乳酸菌接種量對富含NK抹茶納豆酸奶的感官評分影響見圖4。由圖4可知，乳酸菌接種量對感官評分有顯著的影響（P＜0.05），乳酸菌接種量在0.1～0.3%范圍內(nèi)增加時，感官評分變化呈上升趨勢；當(dāng)乳酸菌添加量為0.3%時，感官評分達(dá)到最大值，為84.9分，隨著乳酸菌接種量的繼續(xù)增加，感官評分逐漸下降。乳酸菌接種量過少時，酸奶發(fā)酵不完全，容易出現(xiàn)酸奶酸度不夠，滋味不柔和，香氣不協(xié)調(diào)，酸奶凝固性不好等問題；當(dāng)乳酸菌接種量過高時，發(fā)酵過度，產(chǎn)酸過快、過多，導(dǎo)致酸甜不協(xié)調(diào)，滋味不柔和，感官評分降低。因此，選擇最適的乳酸菌接種量為0.3%。

圖4 乳酸菌接種量對富含納豆激酶抹茶納豆酸奶的感官品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of lactic acid bacteria inoculum on sensory quality of matcha natto yogurt rich in nattokinase

2.1.5 發(fā)酵時間對富含NK抹茶納豆酸奶品質(zhì)的影響

發(fā)酵時間對富含NK抹茶納豆酸奶感官評分的影響見圖5。

圖5 發(fā)酵時間對富含納豆激酶抹茶納豆酸奶感官品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of fermentation time on sensory quality of matcha natto yogurt rich in nattokinase

由圖5可知，發(fā)酵時間對感官評分有顯著的影響（P＜0.05），隨著發(fā)酵時間在4～12 h范圍內(nèi)的延長，其感官評分變化呈明顯上升趨勢。但當(dāng)發(fā)酵時間超過6 h，其感官評分變化隨著發(fā)酵時間的延長而逐漸趨于平緩，此時，乳酸菌基本發(fā)酵完全，對酸奶的影響不大。而當(dāng)發(fā)酵時間低于6 h時，因乳酸菌發(fā)酵不完全，酸奶沒有完全凝固，滋味不柔和，酸甜不協(xié)調(diào)。因此，考慮到生產(chǎn)成本等綜合因素，選擇最適的發(fā)酵時間為6 h。

2.2 富含NK抹茶納豆酸奶發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以感官評分為評價指標(biāo)，選擇納豆豆?jié){添加量（A）、白砂糖添加量（B）、抹茶粉添加量（C）、乳酸菌接種量（D）為影響因素，采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化富含NK抹茶納豆酸奶發(fā)酵工藝，正交試驗結(jié)果與分析見表3。

表3 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果及分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation process optimization

由表3可知，影響富含NK抹茶納豆酸奶感官評分的因素大小依次為：乳酸菌接種量＞抹茶粉添加量＞納豆豆?jié){添加量＞白砂糖添加量，最優(yōu)發(fā)酵工藝方案為A2B2C3D2，即納豆豆?jié){添加量6%，白砂糖添加量8%，抹茶粉添加量0.7%，乳酸菌添加量0.3%。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行驗證試驗，其感官評分為88.6分。

2.3 富含NK抹茶納豆酸奶的品質(zhì)

2.3.1 感官指標(biāo)

富含NK抹茶納豆酸奶的感官指標(biāo)見表4。由表4可知，采用上述優(yōu)化后的工藝生產(chǎn)的富含NK抹茶納豆酸奶的感官指標(biāo)符合GB 19302—2010《發(fā)酵乳》[22]中風(fēng)味發(fā)酵乳感官要求。產(chǎn)品感官評價良好的原因可能是由于以下幾個方面，納豆芽孢桿菌與乳酸菌嗜熱鏈球菌共同發(fā)酵可以改良納豆風(fēng)味[23]。抹茶所具有的濃厚的茶香味能起到良好的掩蓋其他異味的作用[24]；添加白砂糖發(fā)酵酸奶，經(jīng)后熟過程可改良納豆的風(fēng)味[25]。

表4 富含納豆激酶抹茶納豆酸奶的感官評價指標(biāo)Table 4 Sensory evaluation indexes of matcha natto yogurt rich in nattokinase

2.3.2 理化指標(biāo)

富含NK抹茶納豆酸奶的理化指標(biāo)見表5。由表5可知，采用上述優(yōu)化后的工藝生產(chǎn)的富含NK抹茶納豆酸奶的理化指標(biāo)均符合GB 19302—2010《發(fā)酵乳》[22]中理化指標(biāo)要求。此外，采用此法制備的富含NK抹茶納豆酸奶的NK活性為688.6 U/mL，具有較強的保健功能。

表5 富含納豆激酶抹茶納豆酸奶的理化指標(biāo)Table 5 Physicochemical indexes of matcha natto yogurt rich in nattokinase

2.3.3 微生物指標(biāo)

富含NK抹茶納豆酸奶的微生物指標(biāo)見表6。由表6可知，采用上述優(yōu)化后的工藝生產(chǎn)的富含NK抹茶納豆酸奶的微生物指標(biāo)符合GB 19302—2010《發(fā)酵乳》[22]中微生物指標(biāo)的規(guī)定要求。

表6 富含納豆激酶抹茶納豆酸奶的微生物指標(biāo)Table 6 Microbiological indexes of matcha natto yogurt rich in nattokinase

3 結(jié)論

該研究以富含NK的納豆豆?jié){和復(fù)原乳為主要原料，制備富含NK的抹茶納豆酸奶。通過單因素和正交試驗得到的富含NK抹茶納豆酸奶的最適發(fā)酵工藝條件為：納豆豆?jié){添加量6%，白砂糖添加量8%，抹茶粉添加量0.7%，乳酸菌添加量0.3%。在此條件下，酸奶的感官評分為88.6分，具有良好的口感，滋味純正，香氣協(xié)調(diào)，質(zhì)地順滑，有拉絲。酸度、脂肪、蛋白質(zhì)、非脂乳固體含量分別為82°T、3.15 g/100 g、3.08 g/100 g、8.25 g/100 g，NK活性為688.6 U/mL。乳酸菌數(shù)為5.8×108CFU/mL，各指標(biāo)均符合國標(biāo)GB 19302—2010《發(fā)酵乳》要求。該產(chǎn)品并具有溶血栓、降血壓、降血脂等多種功效，具有廣闊的開發(fā)前景。