基于響應(yīng)面法優(yōu)化氫氧化鈉預(yù)處理甘蔗渣的酶解條件

呂曉靜，吳躍華，蔣旭紅，程杏安，李江濤*

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 天然產(chǎn)物化學(xué)研究所，廣東 廣州 510225）

甘蔗渣是制糖工業(yè)的主要副產(chǎn)物，是一種可再生生物質(zhì)資源[1]。中國是僅次于巴西和印度的第三大甘蔗種植國。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年我國華南地區(qū)甘蔗年產(chǎn)量達(dá)1.05億t，而甘蔗渣的產(chǎn)量約為2 940萬t，數(shù)目十分龐大[2]。甘蔗渣的成分主要以纖維素、半纖維素等多糖以及木質(zhì)素為主，其中多糖經(jīng)處理轉(zhuǎn)化為單糖后可被再利用[3]。甘蔗渣等木質(zhì)纖維素有望替代傳統(tǒng)的糧食作物，作為原料用于燃料乙醇的制備，此技術(shù)被認(rèn)為是一種先進(jìn)的清潔能源技術(shù)[4]。近年來，木質(zhì)纖維素燃料乙醇以其經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、實(shí)用等優(yōu)勢(shì)，受到世界各國專家學(xué)者的廣泛關(guān)注，其產(chǎn)業(yè)化有望成為緩解日益緊缺的化石能源問題的一種有效途徑[5-6]。

目前，甘蔗渣等木質(zhì)纖維素燃料乙醇的生產(chǎn)工藝主要分為三個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)，即預(yù)處理、酶解和微生物發(fā)酵[7]。堿法被普遍認(rèn)為是有效且具開發(fā)潛力的一種木質(zhì)纖維素預(yù)處理方法，如氨處理、石灰預(yù)處理、碳酸鈉預(yù)處理等，其中氫氧化鈉預(yù)處理備受關(guān)注，已在工業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用[8]。然而，酶解成本較高仍是當(dāng)下限制甘蔗渣等木質(zhì)纖維素燃料乙醇規(guī)模化生產(chǎn)的主要因素。據(jù)報(bào)道，在木質(zhì)纖維素燃料乙醇的生產(chǎn)中，水解酶成本占總生產(chǎn)成本的50%～60%[9]。國內(nèi)外研究者已針對(duì)此問題進(jìn)行了廣泛探索，但高酶成本仍是木質(zhì)纖維素燃料乙醇規(guī)模化生產(chǎn)的主要障礙[10]。此外，高濃度可發(fā)酵糖的獲得是實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物發(fā)酵或轉(zhuǎn)化的重要前提，也是實(shí)現(xiàn)甘蔗渣等木質(zhì)纖維素燃料產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要基礎(chǔ)[11-12]。為了實(shí)現(xiàn)甘蔗渣等木質(zhì)纖維素燃料乙醇的規(guī)?；a(chǎn)，有效降低酶的使用成本以及提高可發(fā)酵糖產(chǎn)量仍任重道遠(yuǎn)，而通過優(yōu)化酶解條件來提高酶的利用效率，獲得較高可發(fā)酵糖產(chǎn)量以及減少相關(guān)高成本酶的用量，被認(rèn)為是有效的途徑之一[13]。

響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，被認(rèn)為是一種全面、簡潔、高效的方法，已成功用于高效工藝的開發(fā)[14-15]。本研究首先采用單因素試驗(yàn)探究纖維素酶量、酶解時(shí)間和酶解轉(zhuǎn)速對(duì)氫氧化鈉預(yù)處理甘蔗渣酶解效果的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以氫氧化鈉預(yù)處理甘蔗渣為原料，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取纖維素酶量、酶解時(shí)間和酶解轉(zhuǎn)速3個(gè)因素為影響因子，以甘蔗渣總可發(fā)酵糖得率（total fermentable sugar yield，TFSY）作為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法探討和優(yōu)化氫氧化鈉預(yù)處理甘蔗渣的酶解工藝條件，以期為木質(zhì)纖維素堿法預(yù)處理與高效酶解糖化技術(shù)的構(gòu)建，提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘蔗渣：來源于廣東中科天元新能源科技有限公司；纖維素酶Cellic CTec 2（酶活為60.4 FPU/mL）：美國Sigma-Aldrich公司；四環(huán)素：青島生工生物科技有限公司；制霉菌素：安徽酷爾生物工程有限公司；氫氧化鈉（分析純）：南京化學(xué)試劑股份有限公司；一水合檸檬酸和二水合檸檬酸三鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2802紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；SPH-100B型空氣恒溫振蕩器：上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；H1650型臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；MS2型渦旋混合器：德國IKA公司；LC-15C型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 氫氧化鈉預(yù)處理甘蔗渣的制備

準(zhǔn)確稱取適量風(fēng)干的100～200目甘蔗渣（約100 μm），按照料液比1∶10（g∶mL），將其與2%NaOH混勻，于121 ℃條件下處理1 h，冷卻至室溫，離心去除上清液，固體部分用去離子水洗至pH中性，烘干至恒質(zhì)量，粉碎，經(jīng)測(cè)定其主要成分含量分別為葡聚糖55.32%、木聚糖26.31%、酸不溶木質(zhì)素9.83%、酸溶木質(zhì)素4.01%。

1.3.2 甘蔗渣的酶解

準(zhǔn)確稱取適量經(jīng)過氫氧化鈉預(yù)處理甘蔗渣樣品于螺口玻璃瓶中，加入pH 4.8的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（含有四環(huán)素和制霉菌素），使底物質(zhì)量濃度為2g/100mL；再加入適量纖維素酶Cellic CTec 2，進(jìn)行酶解反應(yīng)；每隔一定時(shí)間取樣1 mL，沸水浴10 min進(jìn)行酶滅活處理，冷卻至室溫后，12 000 r/min離心5 min收集上清，接著用10%硫酸對(duì)其進(jìn)行酸化處理，再經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，得到甘蔗渣酶解液。

1.3.3 分析檢測(cè)

參考美國可再生能源實(shí)驗(yàn)室（National Renewable Energy Laboratory，NREL）提供的分析方法[16]，采用高效液相色譜法進(jìn)行甘蔗渣酶解液中葡萄糖和木糖含量的測(cè)定。

1.3.4 計(jì)算公式

固體回收率、原始甘蔗渣、總可發(fā)酵糖濃度（total fermentable sugarconcentration，TFSC）及總可發(fā)酵糖得率（total fermentable sugar yield，TFSY）計(jì)算公式如下：

1.3.5 甘蔗渣的酶解工藝條件優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：以總可發(fā)酵糖濃度（TFSC）和總可發(fā)酵糖得率（TFSY）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)對(duì)纖維素酶量（18FPU/g、21FPU/g、24FPU/g、27FPU/g、30 FPU/g、33 FPU/g、36 FPU/g）、酶解時(shí)間（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h）、酶解轉(zhuǎn)速（120r/min、140r/min、160r/min、180r/min、200r/min）進(jìn)行分析。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)：在單因素試驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，以總可發(fā)酵糖得率（TFSY）（Y）作為響應(yīng)值，以纖維素酶添加量（X1）、酶解時(shí)間（X2）和酶解轉(zhuǎn)速（X3）為自變量，設(shè)計(jì)3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

為了體現(xiàn)自變量和因變量的關(guān)系，采用二次多項(xiàng)式方程進(jìn)行擬合，預(yù)測(cè)二次多項(xiàng)式方程形式如下：

式中：Yi為總可發(fā)酵糖得率（TFSY），g/g；Xi、Xj為自變量，表示纖維素酶量、酶解時(shí)間、酶解轉(zhuǎn)速；β0為截距，βi、βii、βij分別為一次項(xiàng)、二次項(xiàng)及交互項(xiàng)系數(shù)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0和OriginPro 9.0進(jìn)行分析并作圖。數(shù)據(jù)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。差異性檢驗(yàn)采用獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)、單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）以及最小顯著差檢驗(yàn)（least significant difference，LSD）多重比較，其中P＜0.05的結(jié)果被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理甘蔗渣酶解工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同纖維素酶添加量對(duì)甘蔗渣酶解效果的影響

本研究選用的纖維素酶Cellic CTec 2，除主要具有纖維素酶活外，還具有一定木聚糖酶活性，因此甘蔗渣酶解過程中除產(chǎn)生葡萄糖外還會(huì)有部分木糖產(chǎn)生。又因葡萄糖和木糖均可被大多數(shù)發(fā)酵微生物所利用，故將葡萄糖和木糖的總量分別統(tǒng)稱為總可發(fā)酵糖濃度和總可發(fā)酵糖得率，即TFSC和TFSY。在相同酶解時(shí)間和酶解轉(zhuǎn)速的條件下，首先比較了不同纖維素酶量對(duì)預(yù)處理甘蔗渣酶解效果的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著纖維素酶添加量從18～36 FPU/g的增加，預(yù)處理甘蔗渣酶解的TFSC和TFSY均顯著增加（P＜0.05）；當(dāng)纖維素酶量在33 FPU/g時(shí)，TFSC和TFSY均達(dá)到最高，分別為17.85 g/L和51.93%；纖維素酶添加量＞33 FPU/g之后，TFSC和TFSY雖有所增加，但變化均不顯著（P＞0.05）。同樣的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象也出現(xiàn)在前人的研究中[17-18]。纖維素酶在作用于纖維素時(shí)，主要分為三步，首先纖維素酶吸附到纖維素的表面，使纖維素水解轉(zhuǎn)化成糖，然后纖維素酶的吸附作用消失。纖維素酶完成這三步之后，其活性減弱，不再具有吸附作用[19]。在一定范圍內(nèi)增加纖維素酶量，能夠提高酶解反應(yīng)速率和產(chǎn)物產(chǎn)量，但是酶的成本顯著增加。因此，選擇纖維素酶添加量為30 FPU/g、33 FPU/g、36 FPU/g進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖1 不同纖維素酶添加量對(duì)甘蔗渣酶解效果的影響Fig.1 Effect of different cellulase addition on enzymatic hydrolysis of sugar cane bagasse

2.1.2 不同酶解時(shí)間對(duì)甘蔗渣酶解效果的影響

在相同纖維素酶量和酶解轉(zhuǎn)速的條件下，分析比較了不同酶解時(shí)間對(duì)預(yù)處理甘蔗渣酶解效果的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著酶解時(shí)間從24 h到84 h，預(yù)處理甘蔗渣酶解的TFSC和TFSY均顯著增加（P＜0.05）；當(dāng)酶解時(shí)間為84 h時(shí)，TFSC和TFSY均達(dá)到最大，分別為18.73 g/L和54.43%；酶解時(shí)間＞84 h之后，對(duì)應(yīng)TFSC和TFSY變化均不顯著（P＞0.05），在數(shù)值上呈現(xiàn)略微下降的趨勢(shì)。在酶解過程中，纖維素酶能夠在短時(shí)間內(nèi)反應(yīng)迅速，酶解前期底物濃度增加速率較快，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，產(chǎn)物濃度增加則抑制酶促反應(yīng)速度，導(dǎo)致底物濃度不會(huì)再顯著增加。因此，選擇酶解時(shí)間為72 h、84 h、96 h進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 不同酶解時(shí)間對(duì)甘蔗渣酶解效果的影響Fig.2 Effect of different enzymatic hydrolysis time on enzymatic hydrolysis of sugar cane bagasse

2.1.3 不同酶解轉(zhuǎn)速對(duì)甘蔗渣酶解效果的影響

由圖3可知，在相同纖維素酶量和酶解時(shí)間的條件下，酶解轉(zhuǎn)速對(duì)預(yù)處理甘蔗渣酶解效果有較大影響，隨著酶解轉(zhuǎn)速從120r/min提升至180r/min，預(yù)處理甘蔗渣酶解的TFSC和TFSY均顯著增加（P＜0.05）；當(dāng)酶解轉(zhuǎn)速達(dá)到180 r/min時(shí)，TFSC和TFSY均達(dá)到最大，分別為18.70 g/L和54.24%；隨后繼續(xù)提高酶解轉(zhuǎn)速，對(duì)應(yīng)TFSC和TFSY均顯著降低（P＜0.05）。類似的結(jié)果也出現(xiàn)在前人的研究中[20]。主要原因可能是適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速能保證底物和纖維素酶之間充分的混合，增加有效接觸的概率，以及提高反應(yīng)體系內(nèi)的熱量和質(zhì)量傳遞。然而，過高的轉(zhuǎn)速可能降低酶的活性和反應(yīng)速度。在較高轉(zhuǎn)速下，也會(huì)產(chǎn)生底物與底物間剪切力，從而影響酶的活性[21]。因此，選擇酶解轉(zhuǎn)速為160 r/min、180 r/min、200 r/min進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 不同酶解轉(zhuǎn)速對(duì)甘蔗渣酶解效果的影響Fig.3 Effect of different enzymatic hydrolysis speed on enzymatic hydrolysis of sugar cane bagasse

2.2 酶解條件優(yōu)化響應(yīng)面分析

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken設(shè)計(jì)原理[22]，以總可發(fā)酵糖得率（TFSY）（Y）作為響應(yīng)值，以纖維素酶添加量（X1）、酶解時(shí)間（X2）和酶解轉(zhuǎn)速（X3）為自變量，設(shè)計(jì)了17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中因素分析試驗(yàn)組12個(gè)，誤差估計(jì)試驗(yàn)組5個(gè)。Box-Behnken試驗(yàn)方案和結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

2.2.2 數(shù)學(xué)模型的建立

根據(jù)Box-Behnken原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)并測(cè)得預(yù)處理甘蔗渣的TFSY，經(jīng)Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件處理表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行回歸擬合，建立總可發(fā)酵糖得率（Y）對(duì)纖維素酶添加量（X1）、酶解時(shí)間（X2）和酶解轉(zhuǎn)速（X3）的數(shù)學(xué)模型。模型回歸方程如下：

2.2.3 方差分析

該模型決定系數(shù)R2為0.998 3，表明模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值相關(guān)度較高。校正決定系數(shù)R2adj為0.996 2，表明僅有0.38%的總差異不能用該數(shù)學(xué)模型分析。模型變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）值為0.36%，小于上限值10%，說明模型的精確度和可信度較高。信噪比為64.63，大于下限值4，說明模型平均預(yù)測(cè)誤差小，擬合度好[23-24]。

經(jīng)Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件處理表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，失擬項(xiàng)的P值為0.940 8＞0.05，表明該模型的失擬項(xiàng)不顯著，由此說明該模型在被研究的整個(gè)回歸區(qū)域內(nèi)擬合良好?；貧w模型的P值＜0.000 1，說明回歸方程極顯著，模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際情況擬合度高，可用此模型對(duì)氫氧化鈉預(yù)處理甘蔗渣TFSY的變化情況進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。一次項(xiàng)X1、X2、X3、二次項(xiàng)X12、X22、X32對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)X1X2、X1X3對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。根據(jù)F值的大小可以判斷各因素影響效果的主次，F(xiàn)值越大，則對(duì)應(yīng)因素的影響越主要。從方差分析結(jié)果可知，X1（纖維素酶添加量）、X2（酶解時(shí)間）和X3（酶解轉(zhuǎn)速）的F值分別為637.72、800.01、17.21，因此3個(gè)因素對(duì)甘蔗渣TFSY變化影響主次順序?yàn)槊附鈺r(shí)間＞纖維素酶添加量＞酶解轉(zhuǎn)速。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.4 各因素交互作用對(duì)TFSY變化影響的響應(yīng)面分析

回歸模型的三維響應(yīng)曲面圖和等高線圖能比較直觀地解釋各變量和變量之間對(duì)響應(yīng)值的影響。根據(jù)上述回歸方程，繪制出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖和等高線，結(jié)果見圖4。在固定一個(gè)變量的情況下，即將三個(gè)響應(yīng)變量中的一個(gè)變量固定在其較優(yōu)值水平，對(duì)另外兩個(gè)變量交互影響TFSY的效應(yīng)進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)。由圖4可知，各兩變量間的交互作用所對(duì)應(yīng)的響應(yīng)曲面均是向上凸起的形狀圖，故各曲面會(huì)形成一個(gè)穩(wěn)定點(diǎn)，即甘蔗渣的TFSY具有最大值。

圖4 纖維素酶添加量、酶解時(shí)間及酶解轉(zhuǎn)速交互作用對(duì)預(yù)處理甘蔗渣總可發(fā)酵糖得率影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and counter lines of effects of cellulase addition,enzymatic hydrolysis time and enzymatic hydrolysis speed on total fermentable sugar yield of sugar cane bagasse

由圖4A可知，纖維素酶量和酶解時(shí)間交互作用對(duì)甘蔗渣TFSY影響顯著（P＜0.05）。隨著纖維素酶量的增加和酶解時(shí)間的延長，甘蔗渣TFSY均呈現(xiàn)先增加后基本穩(wěn)定的趨勢(shì)，當(dāng)纖維素酶量為31.3 FPU/g底物，酶解時(shí)間為96 h時(shí)，甘蔗渣TFSY可達(dá)最大值。

由圖4B可知，纖維素酶量和酶解轉(zhuǎn)速交互作用對(duì)甘蔗渣TFSY影響顯著（P＜0.05）。當(dāng)纖維素酶量一定時(shí)，甘蔗渣TFSY隨著酶解轉(zhuǎn)速的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)酶解轉(zhuǎn)速增至180.91 r/min，甘蔗渣TFSY達(dá)到最大；當(dāng)酶解轉(zhuǎn)速一定時(shí)，甘蔗渣TFSY隨著纖維素酶量的增加呈現(xiàn)先增加后基本穩(wěn)定的趨勢(shì)。

由圖4C可知，酶解轉(zhuǎn)速和酶解時(shí)間交互作用不顯著（P＞0.05）。當(dāng)酶解時(shí)間一定時(shí)，隨著酶解轉(zhuǎn)速的增加，甘蔗渣TFSY呈先增加后下降的趨勢(shì)；當(dāng)酶解轉(zhuǎn)速一定時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長，甘蔗渣TFSY呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定。

2.2.5 最佳酶解條件的確定和試驗(yàn)驗(yàn)證

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析，最優(yōu)酶解工藝條件為：纖維素酶添加量為31.3 FPU/g底物，酶解時(shí)間為96 h，酶解轉(zhuǎn)速為180.91 r/min。模型預(yù)測(cè)條件下，甘蔗渣TFSY預(yù)測(cè)值為56.52%。為了便于實(shí)際操作，修正酶解條件為纖維素酶添加量31 FPU/g 底物，酶解時(shí)間為96 h，酶解轉(zhuǎn)速為180 r/min。在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到甘蔗渣TFSY實(shí)際值為55.37%，模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際驗(yàn)證值相對(duì)誤差僅為2%，說明該優(yōu)化模型有較好可靠性，即回歸方程能夠比較好地反映纖維素酶量、酶解時(shí)間及酶解轉(zhuǎn)速變化對(duì)預(yù)處理甘蔗渣酶解效果的影響[25]。

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面法分析，氫氧化鈉預(yù)處理甘蔗渣的最佳酶解條件為纖維素酶添加量31 FPU/g 底物，酶解時(shí)間96 h，酶解轉(zhuǎn)速180 r/min?？偪砂l(fā)酵糖得率為55.37%。本研究建立了氫氧化鈉預(yù)處理甘蔗渣的酶解工藝條件，初步實(shí)現(xiàn)了氫氧化鈉預(yù)處理甘蔗渣的高效糖化，對(duì)研究和開發(fā)高效的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)酶解工藝具有重要指導(dǎo)意義。