霍氏腸桿菌β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶的制備及其應(yīng)用

魏 濤，王 敏，張志平，段乃心，楊 旭，黃 申，毛多斌*

（鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

β-紫羅蘭酮[4-（2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯基）-3-丁烯-2-酮]又名芷香酮，是一種具有木香帶紫羅蘭花香的名貴香料，同時也是合成維生素A、E、視黃酸及β-胡蘿卜素的重要中間體，廣泛應(yīng)用于食品、香料、化妝品和醫(yī)藥工業(yè)中[1-3]。β-紫羅蘭酮是環(huán)化的類異戊二烯的代表，具有較強(qiáng)的生物活性[4]，對腫瘤的發(fā)生有抑制作用[5]，且在抗癌、抗真菌和降血脂都有一定的效果[6-9]。β-紫羅蘭酮是植物次級代謝產(chǎn)物，采用提取的方法從植物得到的含量較低且成本昂貴[10-11]。目前，β-紫羅蘭酮主要來源于以檸檬醛為原料的化學(xué)合成，但一般采用化學(xué)合成方法得到的物質(zhì)為混合物[12-14]，且化學(xué)方法的工藝較為復(fù)雜、產(chǎn)生的廢液污染環(huán)境。生物酶法制備β-紫羅蘭酮是近年來發(fā)展起來的新方法，該方法具有生產(chǎn)成本低、專一性強(qiáng)、操作方便和環(huán)境友好等優(yōu)勢[15-16]。由于受健康生活觀念的影響，消費者傾向于選擇天然香料，因此天然香料具有良好的市場前景，而微生物酶法得到的香料被視為“天然香料”[17]。鄭堅強(qiáng)等[18]利用西方許旺酵母（Schwanniomyces occidentalis）發(fā)酵液轉(zhuǎn)化β-胡蘿卜素生成β-紫羅蘭酮，發(fā)酵時間8 d，產(chǎn)物中β-紫羅蘭酮的含量只有22.36%；SCHWARTZ S H等[19]將類胡蘿卜素裂解雙加氧酶成功導(dǎo)入大腸桿菌（Escherichia coli）中進(jìn)行表達(dá)，并證明了該酶能對類胡蘿卜素中第9和第10個碳原子之間的雙鍵進(jìn)行有效切割。NACKE C等[20]利用類胡蘿卜素裂解雙加氧酶大腸桿菌（Escherichia coli）工程菌的細(xì)胞破碎液催化β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為β-紫羅蘭酮，產(chǎn)率達(dá)到60%。

目前生物酶法制備β-紫羅蘭酮存在主要問題是：催化專一性不高，反應(yīng)產(chǎn)物較多，反應(yīng)時間較長及β-紫羅蘭酮產(chǎn)率不高等問題。本研究將源自霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）的β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶基因在大腸桿菌中BL21（DE3）中克隆表達(dá)，利用生物酶法催化水解β-胡蘿卜素生成β-紫羅蘭酮，獲得一種適用于工業(yè)化生產(chǎn)β-紫羅蘭酮的新型酶催化劑，優(yōu)化酶法制備β-紫羅蘭酮反應(yīng)條件，研究成果預(yù)期為實現(xiàn)香精香料的綠色合成奠定理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）：本實驗室篩選獲得，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（China committee for culture collection of microorganisms，CCCCM），保藏號為CGMCC No.1.10608?？寺∨c表達(dá)質(zhì)粒載體pET15b-SM：本實驗室構(gòu)建與保存。

1.1.2 試劑

β-胡蘿卜素（純度96%）：上海麥克林生化科技有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、限制性內(nèi)切酶NdeI和SalI、PyrobestTMDNA聚合酶、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）連接試劑盒（kit ver.2.1）、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（kit ver.3.0）：日本TAKARA公司；大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）：德國Novagen公司；蔗糖（分析純）、酵母浸粉（生化試劑）、氯霉素（分析純）、10×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）（分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.0%，酵母浸粉0.5%，NaCl 1.0%。

含氨芐青霉素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，NaCl 1.0%，氨芐青霉素質(zhì)量濃度為100 mg/L，氯霉素質(zhì)量濃度為34 mg/L。

改良察氏培養(yǎng)基[21-22]：K2HPO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，NaNO30.2%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005%，KCl 0.1%，蔗糖5%，酵母浸粉0.5%。

以上所有培養(yǎng)基均在121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Y92-Ⅲ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；Alltech Prevail C18色譜柱（25 cm×4.6 cm）：美國奧泰公司；JB-680B全自動凝膠成像分析儀：上海培清科技有限公司；15K低溫離心機(jī)：美國Sigma-Aldrich公司；LC2010A/C型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、SPD-M10A二極管陣列檢測器：日本島津公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取霍氏腸桿菌基因組DNA（提取方法見試劑盒說明書）。按照目前已經(jīng)報道類胡蘿卜素9、10'雙加氧酶保守氨基酸序列，設(shè)計一對引物：上游引物5'-CGCCATATGGGAGAAGTAGCGAAGGAGGAAGTAGAAG-3'，下游引物5'-CTAGTCGACTCAGTCGGTTGCTGCCA-3'，其中，CATATG為上游引物NdeI酶切位點，GTCGAC為下游引物SalI酶切位點。以霍氏腸桿菌全基因組序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系（50 μL）如下：模板（25 ng）1 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（25 mmol/L）1 μL，引物（100 μmol/L）各0.5 μL，10×PBS緩沖液5 μL，ProbestTMDNA聚合酶（5 U/μL）1 μL，超純水41 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，51 ℃退火60 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)NdeI酶和SalI酶雙酶切后，連接到經(jīng)同樣內(nèi)切酶酶切的pET15b-SM上，雙酶切反應(yīng)體系（20 μL）如下：PCR產(chǎn)物/pET15b-SM（400 ng）16 μL，NdeI內(nèi)切酶（15 U/μL）1 μL，SalI內(nèi)切酶（15 U/μL）1 μL，10×PBS緩沖液2 μL。雙酶切反應(yīng)混合液37 ℃反應(yīng)4 h。

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α，篩選重組質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切及測序驗證，經(jīng)測序分析鑒定得到β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶基因的序列和β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶的氨基酸序列。pET15b-SM是在Novogen原核表達(dá)載體pET15b基礎(chǔ)上改造而成，在原多克隆位點添加了SalI和NsiI酶切位點，便于基因克隆以及提高蛋白表達(dá)量。

1.3.2 基因的誘導(dǎo)表達(dá)與蛋白質(zhì)的純化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）。帶有重組質(zhì)粒的表達(dá)菌在含氨芐青霉素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，然后按1%接種量接到300 mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h，使OD600nm值為0.5；加入終濃度0.5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，4 ℃、12 000×g離心15 min。使用破壁緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol/L NaCl）懸浮收集菌體，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎菌體，12 000×g離心15 min，得到粗酶液。進(jìn)一步采用鎳柱親和層析（洗脫緩沖液：20mmol/LTris-HCl，pH 7.5，500 mmol/L NaCl，300 mmol/L imidazole）和分子篩Sephacryl TM S-200 HR column（洗脫緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，100 mmol/L NaCl；洗脫速度為：1 mL/min）純化后，得到純化的酶蛋白，并利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelectrophoresis，SDS-PAGE）來檢測純化效果。

1.3.3β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶酶活力的測定

β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶的酶活標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系如下[23-25]：0.5 mg/mLβ-胡蘿卜素、10 mmol/L三（2-甲酰乙基）膦鹽酸鹽（tris（2-carboxylethyl）phosphine hydrochloride，TCEP）、5%辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷（octylthioglucoside，OTG）、10 mmol/L FeSO4·7H2O、0.5%Tween 80、1 mmol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、100mmol/LNaCl、80mmol/L Tricine/KOH緩沖液（pH8.5）和0.4 U/mL雙加氧酶酶液。以不含有酶液的上述反應(yīng)體系作對照組，40 ℃酶解60 min，加入37%的甲醛終止反應(yīng)。測定酶活計算相對酶活。相對酶活：以最適反應(yīng)條件下，對應(yīng)酶活為參考值，其他條件下酶活與最適反應(yīng)條件下酶活的比值。

β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶酶活力單位定義為：在一定條件下，每分鐘生成1 μmol的β-紫羅蘭酮所需要的酶量為一個活力單位（U/mL）。

高效液相色譜（HPLC）法檢測反應(yīng)產(chǎn)物，其色譜條件為：色譜柱為Alltech Prevail C18柱（25 cm×4.6 cm），采用二極管陣列檢測器，流動相為正己烷∶甲基叔丁基醚（95∶5，V/V），洗脫速度為1.0 mL/min，在波長460 nm檢測。分別量取0、30 μL、50 μL、100 μL、200 μL、400 μL、500 μL、700 μL、800 μL、900 μLβ-胡蘿卜素儲備液于10支25 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，分光光度法測460 nm處吸光度值，以蒸餾水為空白對照，根據(jù)所得數(shù)據(jù)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性方程為y=0.2764x+0.0051（相關(guān)系數(shù)R2=0.9999）。式中，x表示β-胡蘿卜素水溶液的質(zhì)量濃度（μg/mL），y表示峰面積。

1.3.4 重組β-胡蘿卜素9，10'雙加氧酶酶學(xué)性質(zhì)研究

（1）最適反應(yīng)溫度

在不同溫度（22.5～50 ℃）下反應(yīng)60 min，比較酶活性的大小，確定最適溫度。

（2）最適反應(yīng)pH值

在不同pH值（6.0～10.5）的緩沖液中檢測酶活，所用緩沖液為磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 6.0～7.5）、Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH7.5～9.0）和CAPS緩沖液（50 mmol/L，pH 9.0～10.5），再確定最適反應(yīng)pH值。

（3）酶濃度對β-紫羅蘭酮產(chǎn)量的影響

在反應(yīng)體系中分別添加不同質(zhì)量濃度的β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶（0～0.6 U/mL），檢測β-紫羅蘭酮產(chǎn)量。

（4）底物濃度對β-紫羅蘭酮產(chǎn)量的影響

在酶活為4 U/mL的反應(yīng)體系中添加不同濃度底物濃度的β-胡蘿卜素（0～800 mg/L），檢測β-紫羅蘭酮產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果驗證

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α，篩選重組質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切，結(jié)果見圖1。由圖1可知，β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶基因的PCR擴(kuò)增的堿基長度約為1 500 bp。經(jīng)過對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，得到編碼β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶的核苷酸為1 485 bp。

圖1 β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶基因的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 PCR amplification electrophoresis of β-carotene-9,10'-dioxygenase gene

2.2 β-胡蘿卜素9，10'雙加氧酶基因序列分析

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α，篩選重組質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切的基因序列分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，該β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶基因包含1 485 bp堿基，編碼494個氨基酸。

圖2 β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶基因的序列Fig.2 Sequence of β-carotene-9,10'-dioxygenase gene

2.3 β-胡蘿卜素9，10'雙加氧酶基因的擴(kuò)增及表達(dá)

重組質(zhì)粒在E.coliBL21（DE3）中表達(dá)后，通過超聲波破壁、鎳柱親和層析和分子篩Sephacryl TM S-200 HR column處理，得到純化重組胡蘿卜素9,10'雙加氧酶，SDS-PAGE分析結(jié)果見圖3。由圖3可知，該酶分子質(zhì)量約57 kDa。

圖3 β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶SDS-PAGE純化結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE purification results of β-carotene-9,10'-dioxygenase

2.4 β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶催化反應(yīng)產(chǎn)物β-紫羅蘭酮

β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)物和β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶水解產(chǎn)物HPLC分析結(jié)果見圖4。由圖4可知，β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶具有裂解β-胡蘿卜素9,10'雙鍵的活性，β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶可以轉(zhuǎn)化β-胡蘿卜素制備β-紫羅蘭酮。

圖4 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)物（a）和β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶水解產(chǎn)物（b）HPLC分析結(jié)果Fig.4 HPLC analyse results of β-carolene slandard (a) and β-carotene-9,10'-dioxygenase hydrolysates (b)

2.5 β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.5.1β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶的最適反應(yīng)溫度

溫度對β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著溫度在22.5～40 ℃范圍內(nèi)的升高，相對酶活也在逐漸升高；當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到40 ℃時，β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶的相對酶活達(dá)到最大值；當(dāng)反應(yīng)溫度高于40 ℃時，酶活逐漸降低。因此，β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃。

圖5 β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶的最適反應(yīng)溫度Fig.5 The optimal reaction temperature of β-carotene-9,10'-dioxygenase

2.5.2β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶的最適反應(yīng)pH值

pH值會改變位于酶活性中心、底物和輔酶的解離狀態(tài)，進(jìn)而改變酶與底物的結(jié)合狀態(tài)以及催化水平[26-27]。pH值對β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶的影響結(jié)果見圖6。由圖6可知，隨著pH值在6.0～8.5范圍內(nèi)的增加，相對酶活逐漸增加；當(dāng)pH值為8.5時，相對酶活達(dá)到最大值；當(dāng)pH值＞8.5時，相對酶活下降。因此，β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶最適反應(yīng)pH值為8.5。

圖6 β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶的最適反應(yīng)pH值Fig.6 Optimal reaction pH of β-carotene-9,10'-dioxygenase

2.5.3 酶濃度對β-紫羅蘭酮產(chǎn)量的影響

酶濃度對β-紫羅蘭酮產(chǎn)量的影響見圖7。由圖7可知，隨著酶活在0～0.4 U/mL范圍內(nèi)的增加，β-紫羅蘭酮的相對產(chǎn)量逐漸增加；當(dāng)酶活為0.4 U/mL時，β-紫羅蘭酮的產(chǎn)量達(dá)到最大值，為115.9 mg/L；隨著酶活＞0.4 U/mL之后，β-紫羅蘭酮的產(chǎn)量逐漸下降。因此，最適酶活為0.4 U/mL。

圖7 酶活對β-紫羅蘭酮產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of enzyme activity on β-ionone production

2.5.4 底物濃度對β-紫羅蘭酮產(chǎn)量的影響

底物濃度對β-紫羅蘭酮產(chǎn)量的影響見圖8。由圖8可知，隨著底物質(zhì)量濃度在0～500 mg/L范圍內(nèi)的增加，β-紫羅蘭酮產(chǎn)量逐漸增加；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為500 mg/L時，β-紫羅蘭酮的產(chǎn)量達(dá)到最大值，為123.6 mg/L；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度＞500 mg/L之后，β-紫羅蘭酮產(chǎn)量逐漸下降。因此，最適底物質(zhì)量濃度為500 mg/L。

圖8 底物質(zhì)量濃度對β-紫羅蘭酮產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of substrate mass concentration on β-ionone production

2.6 最佳反應(yīng)條件下β-紫羅蘭酮產(chǎn)量

在溫度40℃，pH值8.5，β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度為500mg/L，β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶酶活0.4 U/mL的最佳反應(yīng)條件下，β-紫羅蘭酮產(chǎn)量結(jié)果見圖9。由圖9可知，β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶在最佳條件下反應(yīng)12 h，生成的β-紫羅蘭酮產(chǎn)量為142.3 mg/L，產(chǎn)率達(dá)到79.4%。結(jié)果表明，該酶可以高效催化合成β-紫羅蘭酮，具有很好的工業(yè)應(yīng)用價值。

圖9 在最佳反應(yīng)條件下β-紫羅蘭酮產(chǎn)量Fig.9 β-ionone yield under the optimal reaction conditions

3 結(jié)論

本實驗在霍氏腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了一種能夠高效催化降解β-胡蘿卜素的類胡蘿卜素9,10'雙加氧酶的菌株，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.1.10608。采用基因工程方法在大腸桿菌E.coli中克隆表達(dá)該雙加氧酶基因，經(jīng)鎳柱親和層析和分子篩Sephacryl TM S-200等方法制備了該酶蛋白，分子質(zhì)量為57 kDa。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該酶的最適反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH值分別為40 ℃和8.5。在最佳反應(yīng)條件：底物β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度500 mg/L，類胡蘿卜素9,10'雙加氧酶酶質(zhì)量濃度0.4 U/mL，反應(yīng)溫度40 ℃，水解反應(yīng)12 h，反應(yīng)pH 8.5，β-紫羅蘭酮產(chǎn)量為142.3 mg/L，產(chǎn)率達(dá)到79.4%。綜上所述，霍氏腸桿菌β-胡蘿卜素9,10'雙加氧酶具有良好的催化活性，可以高效催化降解β-胡蘿卜素，制備β-紫羅蘭酮，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。