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    lncRNA TUG1在潰瘍性結(jié)腸炎患兒血清中的表達(dá)及意義

    2022-02-06 11:49:00王璐張媛羅靜彭韶盛光耀
    廣東醫(yī)學(xué) 2022年12期
    關(guān)鍵詞:活動期潰瘍性結(jié)腸炎

    王璐, 張媛, 羅靜, 彭韶, 盛光耀

    鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科(河南鄭州 450052)

    兒童潰瘍性結(jié)腸炎是發(fā)生在直腸與結(jié)腸的炎癥性腸病[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn),潰瘍性結(jié)腸炎患兒腸黏膜組織內(nèi)存在免疫炎癥細(xì)胞浸潤,如單核巨噬細(xì)胞等,其主要癥狀為腹痛、腹瀉、便血等,嚴(yán)重時會出現(xiàn)消化道穿孔、腸梗阻等[2-3]。近幾年,隨著我國人民生活方式改變,兒童潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率逐年上升,且與成人相比,兒童更易出現(xiàn)較為嚴(yán)重的潰瘍性結(jié)腸炎,病情易遷延不愈[4]。目前潰瘍性結(jié)腸炎病因尚不明確,但大部分學(xué)者認(rèn)為與自身免疫失調(diào)、環(huán)境因素等有關(guān)[5]。兒童潰瘍性結(jié)腸炎主要治療方法包括免疫治療、手術(shù)治療等,但部分患兒經(jīng)治療后出現(xiàn)難治性、復(fù)發(fā)性潰瘍性結(jié)腸炎,導(dǎo)致治療失敗[6]。因此,尋找潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制,對于控制潰瘍性結(jié)腸炎復(fù)發(fā)有重要意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)廣泛存在于血漿、血清及組織中,其可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)等[7]。?;撬嵘险{(diào)基因1(taurine up-regulated gene 1,TUG1)具有炎癥反應(yīng)的作用[8]。血漿lncRNA TUG1在冠心病患者中表達(dá)上調(diào),且與白細(xì)胞介素(interleukin,IL)6表達(dá)水平呈正相關(guān)[9]。猜測lncRNA TUG1可能在潰瘍性結(jié)腸炎中也發(fā)揮作用。因此,本研究擬納入89例潰瘍性結(jié)腸炎患兒,分析lncRNA TUG1在潰瘍性結(jié)腸炎患兒血清中的表達(dá)及臨床意義,以期為臨床上研究潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 選擇2018年10月至2020年1月本院收治的活動期潰瘍性結(jié)腸炎患兒89例(研究組),男48例,女41例,年齡6~12歲,平均(8.85±2.03)歲。病發(fā)部位:直腸11例,左側(cè)結(jié)腸14例,廣泛結(jié)腸64例。

    納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合2010版《兒童炎癥性腸病診斷規(guī)范共識意見》中兒童潰瘍性結(jié)腸炎[10]診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)兒童潰瘍性結(jié)腸炎疾病活動指數(shù)(Pediatric ulcerative colitis activity,PUCAI)≥10分;(3)患兒家長能全面了解、描述患兒近期飲食情況;(4)患兒家長知情同意并簽署知情同意書。

    排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并活動性結(jié)核;(2)合并結(jié)腸穿孔、腸道細(xì)菌性感染、病毒性感染腸炎;(3)合并惡性腫瘤;(4)合并嚴(yán)重心、肝、腎障礙性疾病;(5)伴有自身免疫性疾病。

    同期選擇在本院體檢的健康兒童101例為對照組,男52例,女49例,年齡6~12歲,平均(8.63±2.11)歲。研究組、對照組性別、年齡比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)同意(SS-2018-36)。

    1.2 內(nèi)鏡下潰瘍性結(jié)腸炎嚴(yán)重程度評價(jià) 采用PUCAI評價(jià)病情程度[4],輕度活動期為10~34分,中度活動期為35~64分,重度活動期為65~85分。PUCAI總分范圍為0~85分,PUCAI分值越高,表示疾病活動性越強(qiáng)。依據(jù)PUCAI將活動期潰瘍性結(jié)腸炎患者分為輕度組(10~34分)36例,中度組(35~64分)31例,重度組(65~85分)22例。

    1.3 方法

    1.3.1 樣本采集 采集健康兒童體檢當(dāng)天和潰瘍性結(jié)腸炎兒童入院檢查時清晨空腹靜脈血3~4 mL,離心(4℃,3 000 r/min,25 min),留上清,凍存于-80℃冰箱。

    1.3.2 實(shí)時熒光定量PCR檢測血清中l(wèi)ncRNA TUG1表達(dá) 用總RNA提取試劑盒(購于北京索萊寶科技有限公司)提取總血清RNA,然后用nanodrop1000微量紫外可見分光光度計(jì)(購于美國NanoDrop Tech公司)測定RNA分別在280 nm和260 nm處吸光度,并計(jì)算A260/280值,A260/280值介于1.8~2.0,表示提取的RNA可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)探究。用Qiagen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購于德國Qiagen公司)逆轉(zhuǎn)錄RNA合成cDNA。用HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix(購于翌圣生物科技(上海)股份有限公司)建立25 μL熒光反應(yīng)體系,引物由擎科生物科技有限公司合成,見表1。用7300實(shí)時熒光定量PCR儀(購于美國ABI公司)對lncRNA TUG1及內(nèi)參β-actin進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件:95℃,3 min;95℃,30 s;59℃,30 s;72℃,40 s;35個循環(huán)。采用2-ΔΔCt算法計(jì)算lncRNA TUG1的相對表達(dá)量。

    表1qRT-PCR引物序列

    1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)檢測血清中IL-1β、IL-6水平 用ELISA法檢測血清IL-1β、IL-6水平,操作步驟依據(jù)IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒(購于美國abcam公司)詳細(xì)步驟說明書。

    1.4 隨訪 所有患兒出院后,隨訪2年,隨訪方式為門診復(fù)查或電話隨訪。隨訪內(nèi)容為:記錄患兒病情復(fù)發(fā)情況,分為復(fù)發(fā)組52例和未復(fù)發(fā)組37例。隨訪終點(diǎn)為患兒潰瘍性結(jié)腸炎復(fù)發(fā)或隨訪結(jié)束。復(fù)發(fā)定義[11]:患兒經(jīng)治療進(jìn)入緩解期后,隨訪中表現(xiàn)出臨床癥狀加重,需要增加藥量或改用其他藥物控制,或需要外科干預(yù)治療。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)數(shù)資料用例(%)表示,采用2檢驗(yàn)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組比較行單因素方差分析,兩組間均數(shù)進(jìn)一步相比行SNK-q檢驗(yàn)。Pearson法分析血清lncRNA TUG1與IL-1β、IL-6的相關(guān)性。用受試者工作特征(ROC)曲線評價(jià)血清lncRNA TUG1水平診斷潰瘍性結(jié)腸炎的價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組細(xì)胞因子IL-1β和IL-6的ELISA檢測水平的比較 與對照組相比,研究組血清IL-1β、IL-6水平較高(P<0.05),見表2。

    表2 細(xì)胞因子IL-1β和IL-6的ELISA檢測水平的比較

    2.2 兩組血清lncRNA TUG1 PCR檢測水平比較 與對照組相比,研究組血清lncRNA TUG1相對表達(dá)水平較高(P<0.05),見表3。

    表3 兩組血清lncRNA TUG1 PCR檢測水平比較

    2.3 亞組血清lncRNA TUG1 PCR檢測水平比較 與輕度組比較,中度組、重度組血清lncRNA TUG1相對表達(dá)水平較高(P<0.05),與中度組比較,重度組血清lncRNA TUG1相對表達(dá)水平較高(P<0.05),見表4。

    2.4 研究組血清中l(wèi)ncRNA TUG1 PCR水平與IL-1β、IL-6 ELISA水平相關(guān)性分析Pearson法分析顯示,血清中l(wèi)ncRNA TUG1 PCR水平與IL-1β、IL-6 ELISA水平呈正相關(guān)(r=0.544,P=0.000;r=0.714,P=0.000),見圖1~2。

    表4 亞組血清lncRNA TUG1 PCR檢測水平比較

    圖1 血清lncRNA TUG1表達(dá)水平與IL-1β相關(guān)性分析

    圖2 血清lncRNA TUG1表達(dá)水平與IL-6相關(guān)性分析

    2.5 血清lncRNA TUG1表達(dá)水平診斷潰瘍性結(jié)腸炎的敏感度和特異度 ROC曲線顯示,lncRNA TUG1診斷潰瘍性結(jié)腸炎的曲線下面積(area under curve,AUC)為0.861(95%CI:0.802~0.920),其敏感度為82.00%,特異度為89.10%。見圖3。

    圖3 血清lncRNA TUG1表達(dá)水平診斷潰瘍性結(jié)腸炎的ROC曲線

    2.6 復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組血清lncRNA TUG1表達(dá)水平比較 與未復(fù)發(fā)組比較,復(fù)發(fā)組血清lncRNA TUG1相對表達(dá)水平較高(P<0.05),見表5。

    表5 復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組血清lncRNA TUG1表達(dá)水平比較

    3 討論

    兒童潰瘍性結(jié)腸炎是炎癥性腸病,病變多累及結(jié)腸黏膜及黏膜下層,病理上由直腸連續(xù)擴(kuò)散至結(jié)腸甚至全結(jié)腸[12]。潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制已在免疫細(xì)胞活化、炎癥級聯(lián)反應(yīng)及環(huán)境等方面展開研究,但目前仍未清楚其發(fā)病機(jī)制[13]。Chapuy等[14]研究顯示,潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜中炎癥反應(yīng)依賴于IL-1β表達(dá)水平升高。張鏢等[15]研究顯示,IL-1β、IL-6在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠中具有重要作用,可影響病情進(jìn)展。本研究顯示,研究組血清IL-1β、IL-6水平明顯高于對照組,提示活動期潰瘍性結(jié)腸炎患兒體內(nèi)存在炎癥。

    lncRNA已被證明是調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要因子,通過與染色質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、RNA和蛋白質(zhì)的相互作用發(fā)揮其功能[16]。lncRNA可通過調(diào)控NF-κB信號通路、炎癥反應(yīng)等生理過程而參與潰瘍性結(jié)腸炎病理過程[17]。lncRNA TUG1是一種有價(jià)值的lncRNA,在多種人類疾病中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)失調(diào)[18]。Tian等[19]研究顯示,在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中發(fā)現(xiàn),TUG1過表達(dá)通過抑制 miR-29b-3p表達(dá),促進(jìn)CDK2 表達(dá),從而促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖并抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡,最終減弱了小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的進(jìn)展。本研究顯示,研究組血清lncRNA TUG1相對表達(dá)水平明顯高于對照組,且輕度組、中度組、重度組血清lncRNA TUG1相對表達(dá)水平依次顯著升高,提示lncRNA TUG1可能參與兒童活動期潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生、發(fā)展。但本研究結(jié)果與Tian等[19]結(jié)果不同,可能因?yàn)槿伺c小鼠是不同物種,TUG1表達(dá)結(jié)果不一致。李彥等[20]研究顯示,膿毒癥大鼠肺組織中l(wèi)ncRNA TUG1呈高表達(dá),lncRNA TUG1高表達(dá)通過下調(diào)miR-26a而促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)。Yue等[21]研究顯示,多發(fā)性硬化癥小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中,lncRNA TUG1呈高表達(dá),并促進(jìn)腫瘤壞死因子-α、IL-6水平表達(dá)增加,此過程依賴于lncRNA TUG1促進(jìn)NF-κB信號通路。本研究進(jìn)一步研究顯示,lncRNA TUG1與IL-1β、IL-6呈正相關(guān),提示lncRNA TUG1可能通過影響患兒體內(nèi)炎癥進(jìn)而影響兒童病情。猜測lncRNA TUG1可能通過影響某種機(jī)制來影響患兒體內(nèi)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致兒童活動期潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生。Zhu等[22]研究顯示,lncRNA TUG1在慢性心力衰竭患者血清中呈上調(diào),對慢性心力衰竭具有一定的診斷價(jià)值,并且可評估慢性心力衰竭患者2年生存率。ROC曲線顯示,lncRNA TUG1診斷潰瘍性結(jié)腸炎的AUC為0.861,其敏感度為82.00%,特異度為89.10%,提示血清lncRNA TUG1對兒童活動期潰瘍性結(jié)腸炎具有診斷價(jià)值,可為兒童活動期潰瘍性結(jié)腸炎的診斷提供參考。為探究lncRNA TUG1與潰瘍性結(jié)腸炎患兒預(yù)后關(guān)系,本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)組血清lncRNA TUG1相對表達(dá)水平顯著高于未復(fù)發(fā)組,提示lncRNA TUG1水平變化可能對活動期潰瘍性結(jié)腸炎預(yù)后也有影響。綜合本研究,猜測lncRNA TUG1可能與兒童活動期潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制有關(guān),可為臨床上兒童活動期潰瘍性結(jié)腸炎的的診斷提供指導(dǎo)。

    綜上所述,潰瘍性結(jié)腸炎患兒血清lncRNA TUG1表達(dá)水平上升,lncRNA TUG1對潰瘍性結(jié)腸炎具有診斷價(jià)值,可能影響患兒體內(nèi)炎癥反應(yīng)及預(yù)后。但本研究尚未深入探究lncRNA TUG1影響兒童活動期潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制,后續(xù)仍需探究。

    利益相關(guān)聲明:所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

    作者貢獻(xiàn)說明:王璐、彭韶:負(fù)責(zé)提出研究選題、設(shè)計(jì)研究方案、實(shí)施研究過程、采集整理和分析數(shù)據(jù);王璐、張媛、羅靜:負(fù)責(zé)調(diào)研整理文獻(xiàn)、設(shè)計(jì)論文框架、起草論文、修訂論文、終審論文;王璐、盛光耀:負(fù)責(zé)獲取研究經(jīng)費(fèi)、技術(shù)或材料支持和指導(dǎo)性支持。

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