HE4、miR-149-3p在尖銳濕疣患者組織中的表達及其與HPV感染的關系*

周蜜, 許文芳, 陳將南, 張寶軍, 王章善, 付雙杏, 方曉波

紹興文理學院附屬醫(yī)院 1皮膚科， 2檢驗科(浙江紹興 312000)

尖銳濕疣(condyloma acuminatum，CA)是由人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染引起的一種良性細胞增殖性疾病，CA組織類似良性腫瘤。CA主要感染群體為21～50歲的中青年男女[1]。HPV能引起人體皮膚黏膜鱗狀上皮細胞增殖，表現(xiàn)為尋常疣、CA等癥狀[2]。一般感染低危型HPV可引起生殖道、陰莖、宮頸等部位病損，而高危型HPV可引起反復、持續(xù)感染[3]。目前臨床上低危型HPV是CA的主要發(fā)病原因，低危型中以HPV6、HPV11兩種最為常見[4]。miR-149-3p在多種癌癥類型的腫瘤抑制中發(fā)揮重要作用。Zhou等[5]研究顯示，低表達miR-149-3p可促進宮頸癌遷移和侵襲。人附睪蛋白4(human epididymis protein 4，HE4)是醫(yī)學界近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤標志物，主要表達于生殖系統(tǒng)上皮細胞[6]。Shi等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在結直腸癌中miR-149可通過調控WFDC2(編碼HE4蛋白的基因)。因此，本研究選取CA患者80例為研究對象，探究miR-149-3p、HE4在CA組織中表達及與HPV感染的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2021年8月本院收治的80例CA患者為研究對象(CA組)，年齡22～56歲，平均(37.18±8.93)歲。納入標準：(1)符合CA診斷標準[8]；(2)入組前未經任何治療。排除標準：(1)伴其他惡性腫瘤；(2)伴梅毒、艾滋病、生殖器皰疹等其他性病、增生性皮膚病；(3)既往有外生殖器疾病史；(4)1個月內服用免疫抑制劑或免疫調節(jié)劑、糖皮質激素。另選取50例在本院行包皮環(huán)切術患者為對照組，納入標準：行包皮環(huán)切術。排除標準同CA組排除標準相同且無HPV感染。對照組年齡20～54歲，平均(35.42±8.86)歲。CA組、對照組年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 組織取樣：CA組患者在本院就診時切下疣體組織，分兩份，置于液氮中保存，然后凍存于-80℃。對照組于本院行包皮環(huán)切術時留取正常包皮組織，置于液氮中保存，然后凍存于-80℃。

血液樣本取樣：CA組患者和對照組在本院檢查當天，清晨空腹時抽取靜脈血6 mL，離心，留上清液，凍存于-80℃。

1.2.2 實時熒光定量PCR法檢測組織中miR-149-3p的水平 使用Trizol RNA提取試劑盒(大連生物工程公司)提取組織總RNA，采用反轉錄試劑盒(大連生物工程公司)按照操作步驟反轉錄得到cDNA。miR-149-3p以管家基因U6為內參，采用實時熒光定量PCR儀對組織中miR-149-3p及內參U6進行擴增反應。反應條件：95℃ 3 min；95℃ 30 s；58℃ 30 s；72℃ 30 s；30個循環(huán)。用2-ΔΔCT法計算miR-149-3p相對表達量。引物序列見表1。

表1qRT-PCR引物序列

1.2.3 檢測組織中HE4表達 采用免疫組化法(SP法)檢測組織中HE4表達，將獲取的組織進行石蠟包埋，二甲苯脫臘，梯度酒精水化，3%過氧化氫清除內源性氧化物酶，再進行抗原修復，加山羊血清封閉，滴加一抗，4℃過夜，滴加二抗，孵育，滴加顯色液，終止反應，復染、分化、脫水、透明、封片，由兩位經驗豐富的病理科醫(yī)生用高倍鏡對每張切片隨機選5個視野進行分析。按陽性染色面積所占百分比評分：<10%計0分，10%～39%計1分，40%～69%計2分，≥70%計3分。按染色強度評分：不著色計0分，黃色計1分，棕黃色計2分，黃褐色計3分。兩次評分乘積為最終綜合評分，≤2分為陰性表達，>2分為陽性表達。

1.2.4 檢測血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10水平 采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測定血清γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-10(interleukin 10，IL-10)水平(試劑盒均由美國R&D公司提供)。

1.3 HPV病毒載量分析 取出CA組織，待解凍后，研磨成組織勻漿，離心2次(12 000 r/min，8 min)，沉淀經過DNA提取裂解后，采用HPV6/11 PCR熒光檢測試劑盒處理DNA樣品。配制PCR反應管，設置陰性對照、陽性對照標準品梯度。擴增條件：93℃ 2 min，93℃ 45 s，55℃ 60 s，10個循環(huán)；然后93℃ 30 s，55℃ 45 s,30個循環(huán)。確定基線和閾值，基線閾值設定，設定原則為3～15個循環(huán)的熒光信號，且Ct值為0.00。建立標準曲線，讀取DNA含量，單位為DNA模板平均拷貝數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用統(tǒng)計軟件SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料用例(%)表示，采用2檢驗。計量資料均符合正態(tài)分布，以平均值±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。采用Spearman法分析CA組織中miR-149-3p與HE4及miR-149-3p、HE4與IFN-γ、TNF-α、IL-10水平的相關性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CA組和對照組組織中miR-149-3p和HE4的水平比較 與對照組相比，CA組組織中miR-149-3p水平較低(P<0.05)，HE4陽性表達率較高(P<0.05)，見表2、3及圖1。

表2 CA組和對照組組織中miR-149-3p的水平比較

表3 CA組和對照組組織中HE4表達比較 例

圖1CA組及對照組組織中HE4表達(×400)

2.2 CA組和對照組血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10水平比較 與對照組相比，CA組血清IFN-γ、TNF-α水平較低(P<0.05)，血清IL-10水平較高(P<0.05)，見表4。

表4 CA組和對照組血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10水平比較

2.3 CA患者組織中HPV病毒載量和miR-149-3p、HE4的水平比較 80例CA患者中HPV6/HPV11陽性檢出率為82.50%(66/80)。與病毒載量為103～105組相比，105～107組、>107組組織中miR-149-3p水平較低(P<0.05)，HE4陽性表達率較高(P<0.05)，見表5。

表5 HPV6/HPV11陽性CA患者組織中HPV病毒載量和miR-149-3p、HE4的水平關系

2.4 HPV6/HPV11陽性CA患者miR-149-3p和HE4表達水平相關性分析 根據(jù)66例HPV6/HPV11陽性CA患者miR-149-3p表達水平中位值(0.55)，將其分為miR-149-3p高表達組33例，miR-149-3p低表達組33例。經Spearman相關分析顯示，CA組織中HE4與miR-149-3p表達水平呈負相關(r=-0.445，P<0.05)。見表6。

表6 CA組織中miR-149-3p和HE4表達水平的相關性 例

2.5 CA患者中miR-149-3p和HE4表達水平與IFN-γ、TNF-α、IL-10水平相關性分析 分析顯示，miR-149-3p與IFN-γ、TNF-α呈正相關(P<0.05)，與IL-10呈負相關(P<0.05)；HE4與IFN-γ、TNF-α呈負相關(P<0.05)，與IL-10呈正相關(P<0.05)。見表7。

表7 相關性分析

3 討論

HPV是一種DNA病毒，根據(jù)HPV所侵犯的上皮細胞所在部位分為生殖道型HPV和皮膚型HPV[9]。有學者發(fā)現(xiàn)，感染機體HPV后，細胞免疫可清除體內HPV，體液免疫可防止機體被同一亞型HPV再次感染。有學者發(fā)現(xiàn)，輔助性T細胞(Th細胞)在機體的免疫系統(tǒng)中扮演關鍵角色，機體處于健康狀態(tài)時，Th1細胞與Th2細胞可處于動態(tài)平衡，當機體被病毒感染后，兩者平衡被打破，病毒感染機體后可引起機體Th1向Th2漂移，如宮頸癌的發(fā)生[10]。Th1細胞可分泌IFN-γ、TNF-α，介導細胞免疫，Th2細胞可分泌IL-10介導體液免疫。當Th2細胞占優(yōu)時，Th2細胞因子會過表達，導致機體細胞免疫功能受到抑制。本研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，CA組血清IFN-γ、TNF-α血清較低，血清IL-10水平較高，提示CA患者可能存在細胞免疫功能抑制。

microRNA在基因轉錄后調控中發(fā)揮關鍵作用，參與細胞增殖，免疫調節(jié)等生物過程。miR-149-3p具有多種生理功能。越來越多的證據(jù)表明，miR-149-3p是一種新型的癌癥相關microRNA，在抑制增殖、遷移方面發(fā)揮著重要作用[11]。Yang等[12]研究顯示，過表達miR-149-3p可抑制膀胱癌的增殖、遷移和侵襲。有研究報道，miR-149-5p是調控HPV陽性的宮頸鱗狀細胞癌的關鍵因子，在HPV陽性宮頸鱗狀細胞癌發(fā)展中起關鍵作用[13]。本研究顯示CA組組織中miR-149-3p水平較對照組低，105～107組、>107組組織中miR-149-3p水平較103～105組低，提示miR-149-3p的降低可能參與CA疾病發(fā)生，且miR-149-3p水平變化可能與HPV感染有關。miR-149-3p還可調節(jié)機體炎癥，Shen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-149-3p過表達可抑制NF-κB信號通路并減弱TNF-α的分泌，減輕慢性阻塞性肺疾病患者炎癥反應。Xu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-149-3p可減少調節(jié)性T細胞分化從而抑制食管癌小鼠發(fā)生免疫逃逸，過表達miR-149-3p可降低IL-10水平。本研究顯示miR-149-3p與IFN-γ、TNF-α呈正相關，與IL-10、HE4呈負相關，提示miR-149-3p可能與HE4、IFN-γ、TNF-α、IL-10共同作用調控CA病情。

HE4也稱為WFDC2，在位于人附睪遠端的上皮細胞上首次發(fā)現(xiàn)其存在。HE4是一種新型腫瘤生物標志物。有研究表明，HE4在子宮內膜癌中具有重要的診斷價值[16]。有分子細胞學實驗也表明，HE4可通過調控多個分子通路參與腫瘤的增殖、侵襲等惡性生物學行為[17]。王元元等[18]研究顯示，HE4對宮頸癌的診斷具有較高診斷價值。本研究結果顯示，CA組組織中HE4陽性表達率明顯高于對照組，105～107組、>107組組織中HE4陽性表達率明顯高于103～105組，提示HE4可能與CA疾病發(fā)生有關，且HE4水平變化可能與HPV DNA載量有關。Zhang等[19]研究顯示，卵巢癌患者血清中HE4水平與IL-10呈正相關。另有研究發(fā)現(xiàn)，接受依伐卡托的囊性纖維化患者的血清HE4水平與肺功能改善程度呈負相關，囊性纖維化患者血清中HE4水平隨血清IL-10、IL-6水平升高而升高[20-21]。本研究分析顯示，CA組織中HE4與IFN-γ、TNF-α呈負相關，與IL-10呈正相關，提示HE4可能與IFN-γ、TNF-α、IL-10共同作用調控CA病情。

綜上所述，HPV6/HPV11病毒載量高CA組織中miR-149-3p表達水平較低、HE4陽性表達率較高，miR-149-3p、HE4均與IFN-γ、TNF-α、IL-10密切相關，但本研究尚未深入探討miR-149-3p、HE4與CA發(fā)病機制的關系，仍需擴大樣本量深入探討。

利益相關聲明：所有作者聲明無利益沖突。

作者貢獻說明：周蜜：提出研究選題、設計方案、論文撰寫；許文芳、陳將南：實驗操作、分析實驗數(shù)據(jù)；張寶軍、王章善、付雙杏、方曉波：臨床及病理資料收集、數(shù)據(jù)整理。