早期糖尿病腎病患者血清lncRNA MIAT和miR-361-3p的關(guān)系*

李春, 張穎裕, 彭慧芳

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1內(nèi)分泌科， 2內(nèi)分泌遺傳代謝實(shí)驗(yàn)室(河南洛陽 471023)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病患者常見的微血管特異性并發(fā)癥，已成為導(dǎo)致終末期腎病的第二大病因[1]。早期DN以微量白蛋白尿?yàn)樘卣鳎⒅饾u進(jìn)展為大量白蛋白尿，血清肌酐和尿素氮水平升高，隨著疾病進(jìn)展將導(dǎo)致終末期腎病發(fā)生，DN占終末期腎病的30%～47%，也是導(dǎo)致死亡的主要誘因[2]。此外，糖尿病引起的腎功能損傷還會增加心血管疾病和中風(fēng)等風(fēng)險(xiǎn)。既往研究顯示，非編碼RNA(ncRNA)通過調(diào)節(jié)炎癥、細(xì)胞凋亡、自噬、細(xì)胞增殖和其他病理過程參與DN發(fā)病機(jī)制，ncRNA被認(rèn)為是DN的治療靶點(diǎn)或生物標(biāo)志物[3]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(MIAT)在DN患者腎組織中上調(diào)表達(dá)，參與系膜細(xì)胞增殖和纖維化，以及介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷過程[4-5]。微小RNA(miR)-361-3p在高糖處理的人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)中下調(diào)表達(dá)，參與HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[6]。本研究通過觀察早期DN患者血清lncRNA MIAT和miR-361-3p表達(dá)水平，探討兩者異常表達(dá)與該病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院2020年6月至2021年9月收治的130例2型糖尿病患者，均符合中國2型糖尿病防治指南(2017年)[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)一步依據(jù)尿白蛋白/肌酐比值(UACR)將患者分為微量白蛋白尿(MA)組(UACR 30～300 mg/g，61例)，正常白蛋白尿(NA)組(UACR<30 mg/g，69例)。對照組(65例)為體檢健康者。其中，NA組男、女分別35、34例，年齡(57.15±8.52)歲；MA組男、女分別32、29例，年齡(57.48±8.95)歲；對照組男、女分別34、31例，年齡(56.90±9.36)歲，3組間性別(2=0.049，P=0.976)、年齡(F=0.066，P=0.936)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2022-07-B023)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)UACR >300 mg/g或終末期腎病者；(2)非2型糖尿病引起的腎臟疾病史；(3)合并急慢性感染；(4)急性高血糖紊亂；(5)腎功能損傷病史。

1.2 臨床資料及試驗(yàn)方法 研究對象均在入院時(shí)統(tǒng)計(jì)以下基線資料：性別、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、收縮壓(SBP)、年齡、空腹血糖(FPG)、糖尿病病程、尿素氮(BUN)、舒張壓(DBP)、肌酐(Scr)、總膽固醇(TC)、空腹胰島素(FINS)、糖化血紅蛋白(HbA1C)、UACR、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。其中，胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=FINS×FBG/22.5。腎小球?yàn)V過率(eGFR)計(jì)算采用改良MDRD公式，175×Scr-1.234×年齡-0.179×(女性×0.79)[8]。

1.3 qRT-PCR技術(shù)檢測血清lncRNA MIAT和miR-361-3p表達(dá)水平

1.3.1 lncRNA MIAT表達(dá)水平的檢測 使用血清總RNA提取試劑盒(貨號：B0901，新?；蚬?提取總RNA，在nano-800+超微量核酸蛋白分析儀(型號：JP-nano3000，上海金鵬分析儀器有限公司)上檢測RNA濃度和質(zhì)量，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：R312-01，諾唯贊公司)得到cDNA；利用定量PCR試劑盒(貨號：Q421-02，諾唯贊公司)配制反應(yīng)體系10 μL，并在CFX384 Touch檢測儀器(Bio-Rad)上進(jìn)行PCR反應(yīng)。以GADPH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法檢測lncRNA MIAT表達(dá)水平。

1.3.2 miR-361-3p表達(dá)水平的檢測 取血清樣品，miRNA抽提試劑盒(貨號：B1804，新?；蚬?得到總miRNA，取2 μg RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：MR101-01，諾唯贊公司)以及定量試劑盒(貨號：MQ101-01，諾唯贊公司)說明書操作，將混合液在CFX384 Touch定量儀器上進(jìn)行PCR反應(yīng)。見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，組間比較行2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以表示，3組間比較行one-way ANOVA檢驗(yàn)，組內(nèi)兩兩比較行LSD法。Pearson法分析miR-361-3p與lncRNA MIAT以及BMI、UACR、TC等臨床指標(biāo)的相關(guān)性。多因素logistic回歸分析影響miR-361-3p的因素。血清lncRNA MIAT、miR-361-3p診斷早期DN價(jià)值利用受試者工作特征(ROC)曲線，曲線下面積(AUC)比較采用Z檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 3組在TC、Scr、BUN方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對照組相比，MA組的BMI、UACR、TC、SBP、HOMA-IR、FPG、TG、DBP、FINS、LDL-C、HbA1C水平明顯升高，HDL-C、eGFR水平均下降(P<0.05)；與NA組相比，MA組糖尿病病程、SBP、FPG、FINS、HOMA-IR、UACR水平明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 3組一般資料比較

2.2 血清lncRNA MIAT和miR-361-3p表達(dá)水平比較 3組血清lncRNA MIAT和miR-361-3p表達(dá)水平結(jié)果顯示，對照組、NA組及MA組血清lncRNA MIAT表達(dá)水平依次升高，miR-361-3p表達(dá)水平呈依次降低趨勢(P<0.05)。見表3。

表3 3組間血清lncRNA MIAT和miR-361-3p表達(dá)水平分析

2.3 MA組血清lncRNA MIAT和miR-361-3p表達(dá)水平的相關(guān)性 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，lncRNA MIAT與miR-361-3p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。相關(guān)性分析顯示，MA組血清lncRNA MIAT與miR-361-3p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.628，P=0.000)，見圖2。

圖1 lncRNA MIAT序列中含有與miR-361-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

圖2 MA組血清lncRNA MIAT和miR-361-3p表達(dá)水平的相關(guān)性

2.4 血清miR-361-3p表達(dá)水平與臨床指標(biāo)相關(guān)性 血清miR-361-3p與HOMA-IR、TC、HbA1C、FINS、UACR、FPG呈負(fù)相關(guān)，與HDL-C、eGFR呈正相關(guān)。見表4。

表4 miR-361-3p與各臨床指標(biāo)相關(guān)性

2.5 多因素logistic回歸分析影響miR-361-3p表達(dá)水平的相關(guān)因素 以miR-361-3p表達(dá)水平中位數(shù)為界限，將其轉(zhuǎn)換為二分類變量，以FPG、UACR、TC、eGFR、HbA1C、HOMA-IR、lncRNA MIAT、FINS、HDL-C為自變量，納入logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)FINS、FPG、lncRNA MIAT是miR-361-3p的獨(dú)立影響因素，見表5。

表5 多因素logistic回歸分析影響miR-361-3p表達(dá)水平的相關(guān)因素

2.6 血清lncRNA MIAT和miR-361-3p診斷早期DN的效能 血清lncRNA MIAT診斷早期DN的AUC為0.895(95%CI：0.838～0.952)，截?cái)嘀等?.87時(shí)，對應(yīng)特異度為82.60%，敏感度為88.50%；miR-361-3p診斷早期DN的AUC為0.874(95%CI：0.815～0.933)，截?cái)嘀等?.71時(shí)，特異度為72.50%，敏感度為86.90%；lncRNA MIAT與miR-361-3p聯(lián)合診斷的AUC為0.943(95%CI：0.900～0.986)，敏感度為95.10%，特異度為88.40%。AUC比較顯示，lncRNA MIAT與miR-361-3p比較的Z=0.434、P=0.664，lncRNA MIAT與聯(lián)合比較Z=2.783、P=0.005，miR-361-3p與聯(lián)合比較Z=2.788、P=0.005。見圖3。

圖3 血清lncRNA MIAT和miR-361-3p診斷早期DN的ROC曲線

3 討論

糖尿病是一種常見的慢性終身性疾病，僅在2019年該病導(dǎo)致超過150萬人死亡，且其發(fā)病率仍在持續(xù)增加[9]。DN是糖尿病常見并發(fā)癥，近年來DN發(fā)病率呈上升趨勢，疾病晚期通常需要透析或腎移植，增加了全因死亡和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。DN具體分子機(jī)制尚不清楚，目前仍缺乏有效治療方法[10]。一系列研究表明，非編碼RNA中的lncRNA、miRNA參與DN腎小球足細(xì)胞損傷、腎小管上皮細(xì)胞損傷、腎小球系膜細(xì)胞增殖和纖維化、微血管病變、炎癥反應(yīng)等過程，與DN的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且部分非編碼RNA也被提議作為DN無創(chuàng)診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[11]。

lncRNA MIAT參與微血管功能障礙等多種疾病過程[12]。近期，Ji等[4]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MIAT在DN患者腎活檢組織中上調(diào)表達(dá)，能夠靶向抑制miR-147a，介導(dǎo)E2F3表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖和纖維化。而系膜細(xì)胞是腎小球重要組成部分，系膜細(xì)胞中增殖的失調(diào)和細(xì)胞外基質(zhì)積累有助于DN進(jìn)展。本研究通過qRT-PCR技術(shù)檢測了61例微量白蛋白尿患者(MA組)、69例正常白蛋白尿患者(NA組)及65例健康對照組血清中l(wèi)ncRNA MIAT表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，NA組中血清lncRNA MIAT表達(dá)水平明顯升高；與NA組相比，MA組血清lncRNA MIAT表達(dá)水平明顯增高，提示lncRNA MIAT的表達(dá)水平增高可能對DN進(jìn)展起著積極推動作用。足細(xì)胞附著在腎小球基底膜(GBM)外側(cè)，與內(nèi)皮細(xì)胞和GBM一起形成腎小球?yàn)V過屏障；足細(xì)胞損傷是DN發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素，DN損傷后足細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化包括足細(xì)胞肥大、足細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化、足細(xì)胞脫離和足細(xì)胞凋亡以及足細(xì)胞自噬的功能改變[13]。有學(xué)者利用高糖(30 mmol/L)培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)lncRNA MIAT表達(dá)水平升高，通過調(diào)控p38MAPK磷酸化介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷過程，特異性敲除lncRNA MIAT表達(dá)能夠緩解足細(xì)胞損傷[5]。此外，lncRNA MIAT還可以與miR-130b-3p結(jié)合來增強(qiáng)足細(xì)胞損傷和G2/M期阻滯，而抑制lncRNA MIAT通過恢復(fù)裂隙隔膜完整性、防止去分化和抑制G2/M期阻滯，改善足細(xì)胞損傷和有絲分裂異常[14]。以上研究說明，lncRNA MIAT雖為非編碼RNA，但其通過調(diào)控靶標(biāo)miRNA，參與DN過程中的系膜細(xì)胞增殖和纖維化、足細(xì)胞損失和有絲分裂過程，在DN中扮演重要角色。目前，lncRNA MIAT診斷DN的效能還鮮有報(bào)道，本研究采用ROC曲線分析lncRNA MIAT對早期DN的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)lncRNA MIAT單獨(dú)診斷早期DN的AUC為0.895(95%CI：0.838～0.952)，說明lncRNA MIAT有作為臨床診斷早期DN標(biāo)志物潛能。

有關(guān)miR-361-3p的研究主要集中于在非小細(xì)胞肺癌、透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌、宮頸癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用[15]，而糖尿病及其并發(fā)癥中miR-361-3p功能研究較少。Huang等[16]發(fā)現(xiàn)高糖處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中miR-361-3p表達(dá)水平減少，能夠特異性結(jié)合SOCS3，負(fù)調(diào)控SOCS3，從而抑制HUVECs細(xì)胞凋亡，阻止炎癥因子分泌，表明miR-361-3p參與DM血管內(nèi)皮損傷。此外，miR-361-3p的異常表達(dá)與脂肪酸介導(dǎo)的胰島素抵抗和博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化有關(guān)[17]。目前，早期DN血清中miR-361-3p表達(dá)變化還未有報(bào)道。本研究利用qRT-PCR技術(shù)證實(shí)miR-361-3p在早期DN患者血清中呈現(xiàn)低表達(dá)，說明miR-361-3p的下調(diào)參與DN形成過程。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-361-3p過表達(dá)后能夠抑制淀粉樣β蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷、炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激[18]。近期，柳越等[6]發(fā)現(xiàn)miR-361-3p在高糖處理的人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)中下調(diào)表達(dá)，過表達(dá)后能夠減弱HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡。本研究中，miR-361-3p與臨床指標(biāo)UACR存在負(fù)相關(guān)，與eGFR存在正相關(guān)，說明在2型糖尿病進(jìn)展為早期DN過程中，miR-361-3p下調(diào)表達(dá)，同時(shí)UACR升高，eGFR降低，提示miR-361-3p對早期DN進(jìn)展有阻止作用。糖代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗也是DN進(jìn)展的病理機(jī)制。本研究中miR-361-3p與FPG、TC、HbA1C、FINS、HOMA-IR存在負(fù)相關(guān)，與HDL-C呈正相關(guān)，且FPG、FINS是miR-361-3p降低的影響因素。而FPG、FINS是臨床檢驗(yàn)中常用的血糖、胰島素指標(biāo)，對FPG、FINS水平檢測可以準(zhǔn)確、直觀反映出機(jī)體血糖、胰島素水平[19]。這說明miR-361-3p與早期DN進(jìn)展中的胰島素抵抗、糖脂代謝有關(guān)。

lncRNA可以作為“核酸海綿”，通過吸附靶miRNA來影響基因表達(dá)和下游信號通路。已有研究顯示，lncRNA MIAT能夠直接靶向miR-182-5p，促進(jìn)GPRC5A表達(dá)，從而進(jìn)一步影響高糖處理的HK-2細(xì)胞的NF-κB通路和生物學(xué)行為(增殖、凋亡和炎癥)[20]。miR-361-3p在DN中受lncRNA MALAT1靶向調(diào)控，介導(dǎo)高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥[16]。基于此，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA MALAT1與miR-361-3p存在互補(bǔ)核酸序列，血清中二者表達(dá)水平存在負(fù)相關(guān)性，且lncRNA MALAT1是導(dǎo)致miR-361-3p表達(dá)水平降低的影響因素，本研究推測lncRNA MALAT1還可能通過與miR-361-3p結(jié)合，可參與調(diào)控DN中的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥或足細(xì)胞損傷等過程。目前，DN診斷指標(biāo)包括UACR、eGFR，但二者穩(wěn)定性均不足，Scr和尿素在早期腎功能障礙中特異性欠缺，部分患者在DN進(jìn)展中不會出現(xiàn)微量白蛋白尿或肌酐改變[21]；GFR評估較為費(fèi)力，導(dǎo)致臨床使用受限；腎活檢具有侵入性，因此仍需要篩選能夠用于臨床無創(chuàng)診斷且敏感、特異性生物標(biāo)志物[22]。本研究ROC曲線分析顯示，miR-361-3p診斷早期DN的AUC為0.874(95%CI：0.815～0.933)，lncRNA MIAT與miR-361-3p聯(lián)合診斷的AUC為0.943(95%CI：0.900～0.986)；進(jìn)一步比較AUC，發(fā)現(xiàn)lncRNA MIAT或miR-361-3p單獨(dú)診斷的AUC比較差異無顯著性，lncRNA MIAT、miR-361-3p單獨(dú)診斷與聯(lián)合診斷的AUC比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明lncRNA MIAT與miR-361-3p聯(lián)合可用于臨床診斷早期DN。

綜上所述，早期DN患者血清lncRNA MALAT1表達(dá)水平增加，miR-361-3p表達(dá)水平降低，二者呈負(fù)相關(guān)，lncRNA MALAT1是miR-361-3p降低的影響因素，二者聯(lián)合診斷早期DN效能較佳，可能參與早期DN病理過程。本研究不足之處在于：首先，單中心研究，樣本量較少，限制了研究結(jié)果的普適性，仍需要擴(kuò)大樣本量、擴(kuò)大研究對象范圍進(jìn)一步明確研究結(jié)果。其次，本研究僅通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1與miR-361-3p存在互補(bǔ)核酸序列，然后利用Pearson相關(guān)性證實(shí)二者具有明顯負(fù)相關(guān)性，但二者在DN中的具體調(diào)控機(jī)制仍有待后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等明確。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：李春：提出研究方向、設(shè)計(jì)研究方案、實(shí)施研究過程、撰寫論文；張穎裕、彭慧芳：收集數(shù)據(jù)、分析整理數(shù)據(jù)、修訂論文；張穎裕：審閱論文、指導(dǎo)研究。