生防菌復(fù)合基質(zhì)對西瓜幼苗的促生作用及枯萎病的防治效果

崔夢嬌，楊 洋，李敬蕊，吳曉蕾，宮彬彬，高洪波，呂桂云

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071000）

西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum ＆ Nadai]是世界第5 大水果，中國的西瓜種植面積最大、總產(chǎn)量和人均消費量均最高（FAO，2017）。因為多年連茬種植，西瓜枯萎病日益嚴重，在西瓜生產(chǎn)中造成了重大的產(chǎn)量損失，病田可減產(chǎn)30%～80%，甚至絕產(chǎn)，枯萎病成為西瓜生產(chǎn)中主要限制因素之一［1-2］。西瓜枯萎病的防治方法主要有培育抗性品種、輪作、嫁接、化學(xué)防治等，但市場上尚無能對西瓜枯萎病所有生理小種產(chǎn)生抗性的品種，且還存在病原菌發(fā)展進化的問題［3］；由于我國人均土地占有面積較少，輪作措施不易實行；嫁接要求較高的技術(shù)和成本，且容易對西瓜品質(zhì)造成影響［4］；化學(xué)防治會造成農(nóng)藥抗性、農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染，且目前為止還沒有能夠有效控制枯萎病發(fā)生的化學(xué)藥劑［5］。生防菌以綠色、無污染、保護生態(tài)環(huán)境的優(yōu)勢成為目前的研究熱點。近年來，在利用生防菌防治土傳病害方面的研究已取得了一定的進展，篩選出的生防菌包括木霉菌（Trichodermaspp.）［6］、鏈霉菌（Streptomycesspp.）［7］、假單胞菌（Pseudomunasspp.）［8］、芽孢桿菌（Bacillus subtili）［9］、放線菌（Actinomycetes）［10］等，并在生產(chǎn)中起到一定效果，但因受各種環(huán)境因素和土壤因素的影響，生防菌田間防控效果存在不穩(wěn)定的問題［11］。利用育苗期間將生防菌添加到育苗基質(zhì)里，可以提早讓生防菌定殖在植株根際，通過大量繁殖形成生物屏障，提高植株定植后的防病效果，并可以減少生防菌用量［12］。目前，生防菌功能育苗基質(zhì)已在棉花黃萎?。?3］、煙草青枯?。?4］、香蕉枯萎?。?5］、黃瓜枯萎?。?6］中得到應(yīng)用，但關(guān)于西瓜枯萎病生防菌功能基質(zhì)的研究還未見報道。

本試驗在前人研究的基礎(chǔ)上，在西瓜育苗基質(zhì)中添加生防菌劑，進行育苗、枯萎病防治效果試驗，探究生防菌復(fù)合基質(zhì)對西瓜幼苗的生長和枯萎病的影響，以期為西瓜枯萎病功能性生防菌基質(zhì)的研發(fā)提供依據(jù)，為西瓜枯萎病綠色防治提供新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

西瓜品種‘早佳8424’；試驗用育苗基質(zhì)為山東商道生物科技股份有限公司育苗基質(zhì)；枯萎病菌生理小種1（Fusarium oxysporumf. sp.niveumrace 1）由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實驗室保存。選用的6 種生防菌菌劑包括5 種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌劑和1 種多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）菌劑，均為已在西瓜枯萎病田間防治應(yīng)用效果比較好的菌劑。具體編號及信息、含量及劑量見表1。

表1 生防菌菌劑列表Table 1 The list of biocontrol bacteria agents

1.2 試驗處理

1.2.1 西瓜種子處理 選取飽滿優(yōu)質(zhì)的西瓜種子在1.5%（有效氯含量）次氯酸鈉溶液中消毒20 min，然后清水浸種6 h，在28 ～30 ℃ 培養(yǎng)箱催芽，選取發(fā)芽一致的種子播種。

1.2.2 生防菌基質(zhì)對西瓜幼苗生長及生理指標的影響 試驗于2021 年4—6 月在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)科技園溫室中進行。將6 種生防菌劑配置成菌液，濃度為25×108cfu/L，將配置好的菌液分別與5 L 育苗基質(zhì)混合，以只添加滅菌水的基質(zhì)作為對照（CK），每個處理25 株苗，進行3 次重復(fù)。待幼苗兩葉一心時，測定各處理西瓜幼苗的株高、莖粗、植株地上部和地下部鮮質(zhì)量、干質(zhì)量，葉綠素含量、根系活力，西瓜幼苗根系指標采用臺式掃描儀圖像分析軟件測定，葉綠素含量的測定采用乙醇、丙酮、水體積比4.5 ∶4.5 ∶1。

浸提法，根系活力的測定采用TTC 法，壯苗指數(shù)=(莖粗/株高+地下部干質(zhì)量/地上部干質(zhì)量)×全株干質(zhì)量

1.2.3 生防菌基質(zhì)對西瓜枯萎病的防治效果 待幼苗兩葉一心時，各處理選取生長一致的幼苗進行移栽。移栽3 d 后采用灌根法對每株西瓜苗接種10 mL濃度為5×106cfu /mL 的西瓜枯萎病菌菌懸液。接種病原菌10、15 d 后調(diào)查西瓜枯萎病的發(fā)生情況，計算病情指數(shù)及防治率［17-18］。

病情指數(shù)=100×∑（各級病株數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級代表值）

防病效果（%）=（對照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)）/對照組病情指數(shù)×100

1.2.4 生防菌基質(zhì)對西瓜植株維管束的影響 在接種病原菌13 d 時，取各處理相同病害等級的植株進行莖基部橫切，用尼康體視鏡SMZ1270 觀察維管束變色情況，各處理3 次重復(fù)。

1.2.5 生防菌菌株對西瓜枯萎病菌的影響 采用平板對峙法［19］，將西瓜枯萎病菌菌餅放于PDA 平板中央，在其兩側(cè)2.5 cm 處均放置濾紙片，取2.5 μL生防菌菌液滴于濾紙片上。3 次重復(fù)，以只接枯萎病菌菌餅的平板為對照，在28 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，測量對照菌落生長直徑及對峙培養(yǎng)平板的菌落直徑，計算抑菌率。

抑菌率 =（對照病原菌菌落直徑 - 與生防菌對峙培養(yǎng)的病原菌菌落直徑）/ 對照病原菌菌落直徑×100%

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用 Microsoft Excel 2016、SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用 Duncan 新復(fù)極差檢驗法進行多重比較（P＜0.05）檢驗差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生防菌基質(zhì)對西瓜幼苗生長的影響

不同生防菌基質(zhì)處理下西瓜幼苗的長勢和葉色有明顯的差異（圖1）。綜合所有指標，

圖1 不同生防菌基質(zhì)處理下西瓜幼苗的生長狀況Fig.1 The growth of watermelon seedlings treated with different biocontrol bacteria substrates

GXDYB-1 和HBKYB-5 表現(xiàn)最好，西瓜苗株高、莖粗、地上部鮮重、地上部干重均顯著高于對照；株高以HBKYB-5 最顯著，為對照的127.5%；莖粗以GXDYB-1 效果最好，比對照高37.2%。與對照 相 比， GXDYB-1、HBKYB-4、HBKYB-5 壯 苗指數(shù)較大，分別比對照增加33.2%、17.7%、39.2%（表2）。以上結(jié)果表明：GXDYB-1 和HBKYB-5對西瓜幼苗促生效果較為顯著。

表2 不同生防菌基質(zhì)對西瓜幼苗生長指標的影響Table 2 Effects of diffrnent biocontrol bacteria substrates on growth of watermelon seedlings

2.2 不同生防菌基質(zhì)對西瓜幼苗葉綠素和根系活力的影響

葉綠素在光合作用的光吸收中起核心作用。不同生防菌基質(zhì)處理的西瓜幼苗色素含量有明顯差異。GXDYB-1 處理下西瓜苗葉片葉綠素含量顯著優(yōu)于對照和其它處理，SDKYB-2、HBKYB-5 處理下葉片葉綠素含量分別比對照增加115.8%、111.6%。除 JSKYB-3 根系活力與對照相同外，其它5 種生防菌劑對西瓜幼苗的根系活力均有一定的促進作用，HBKYB-5、GXDYB-1、SDKYB-1 促進作用較顯著，分別為對照的124.7%、121.2%、120%（圖2）。結(jié)合上面的結(jié)果，GXDYB-1 和HBKYB-5 對西瓜幼苗促生作用可能與其比較強的根系活力有關(guān)。

圖2 不同生防菌基質(zhì)對西瓜幼苗葉綠素和根系活力的影響Fig. 2 Effects of different biocontrol bacterial substrates on chlorophyll and root vitality of watermelon seedlings

2.3 不同生防菌基質(zhì)對西瓜枯萎病防控的影響

6 種生防菌基質(zhì)處理對西瓜枯萎病均起到了一定的防治作用（表3）。在接種枯萎病菌15 d后，HBKYB-5 處理對枯萎病的防效達到74.05%，SDKYB-1 處理防效也較好，為69.43%，JSKYB-3處理防效最低，僅為37.25%。當(dāng)西瓜幼苗侵染枯萎病后，幼苗的莖基部會變黃、變褐甚至開裂。如圖3 所示，在體視鏡下觀察各處理莖基部切片，可以看出各處理植株莖基部維管束顏色變化有明顯差異，對照處理幼苗維管束褐化最嚴重，其次是JSKYB-3 和SDKYB-2，HBKYB-5 處理維管束顏色最輕，與其病情指數(shù)基本相一致。

圖3 不同生防菌基質(zhì)對西瓜植株維管束的影響Fig. 3 Effects of different biocontrol bacteria substrates on basal cross section root-stems of watermelon plants

表3 不同生防菌復(fù)合基質(zhì)對西瓜枯萎病的防治效果Table 3 The effect of different biocontrol bacteria compound substrates on controlling watermelon Fusarium wilt

2.4 不同生防菌株對西瓜枯萎病菌生長的影響

6 種生防菌菌株與西瓜枯萎病菌生理小種1 的對峙培養(yǎng)結(jié)果如圖4，抑菌帶的產(chǎn)生說明6 種菌株對致病菌均具有拮抗作用，與只接種致病菌的對照相比，培養(yǎng)6 d 后，6 種生防菌的抑菌率為22.38%～56.82%，HBKYB-5 抑菌效果最顯著，抑菌圈直徑為對照的43.4% ( 表4)。

圖4 不同生防菌菌株對西瓜枯萎病菌菌絲生長的抑制作用Fig. 4 Inhibition of different biocontrol strains on mycelial growth of Fusarium oxysporum f. sp. niveum

表4 不同生防菌菌株對西瓜枯萎病菌生長的影響Table 4 Effects of different biocontrol strains on the growth of Fusarium oxysporum f.sp. nivem

3 結(jié)論與討論

生物防治過程綠色安全、保護生態(tài)環(huán)境，是一種適合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的病害防治方法，尤其是在土傳病害的防治上。在西瓜枯萎病的防治中，生防菌主要通過重寄生、競爭作用、溶菌作用、抗生作用、促進植物生長和誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性等機理來提高西瓜對枯萎病的抗性［20］。張麗榮等［21］觀察到木霉菌菌絲附著或者纏繞在病原菌絲上并吸取營養(yǎng)，導(dǎo)致病原菌絲發(fā)生變形、斷裂、甚至消解；Jiang 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）F21 通過分泌具有抗菌活性的次級代謝產(chǎn)物和誘導(dǎo)西瓜對枯萎病的系統(tǒng)抗性，來抑制枯萎病的生長；Xu 等［23］篩選出一株芽孢桿菌（Bacillus spp.）WB，通過產(chǎn)生抗真菌化合物、破壞分生孢子結(jié)構(gòu)等來控制西瓜枯萎病。本試驗中GXDYB-1 和HBKYB-4 對西瓜幼苗的促生作用與其接種病原菌后的防控率不完全一致，說明生防菌的防控效果并不完全受其促生效果的影響；在平板對峙試驗中，其中5 種菌劑都能明顯抑制枯萎病菌的生長，且抑制率差異不顯著，但將其添加到基質(zhì)中進行育苗后，發(fā)現(xiàn)各菌株對枯萎病的防控效果并不一致，說明在育苗基質(zhì)中添加生防菌對枯萎病的防控效果受多方面的影響，可能與生防菌促生作用、在基質(zhì)中定殖、對基質(zhì)中的微生物種群影響等方面都有關(guān)系，其具體生防機理還有待進一步研究。

生防菌能夠促進植物的生長發(fā)育，孫洪寶等［24］研究發(fā)現(xiàn)，在枯萎病菌侵染條件下，接種利迪鏈霉菌（Streptomyces lydicus）A02 固態(tài)菌劑，提高了西瓜幼苗的凈光合速率和植物內(nèi)源激素含量，幼苗株高、莖粗、鮮重和干重均有增加；梁宏等［25］將添加解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）hj1 的新型生物有機肥施用后，顯著提高了根際細菌和放線菌含量，通過分泌多種抗生素和激素類物質(zhì)，促進了植株生長，西瓜植株株高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量在所有處理中均為最高；Faheem 等人［7］向盆栽土中施用生物有機肥富集的鏈霉菌（Streptomyces goshikiensis）YUCU 菌株，西瓜植株的鮮重和干重顯著增加。在本試驗中，GXDYB-1、HBKYB-5 生防菌基質(zhì)育苗可顯著提高西瓜幼苗的株高、莖粗、地上部鮮重及壯苗指數(shù)，結(jié)合根系活力數(shù)據(jù)，推測生防菌可能通過提高根系活力，來促進植株地上部的生長。

生防菌基質(zhì)是在成品基質(zhì)中添加有益微生物，使基質(zhì)具有促進植株生長、防治病害等功能的一類基質(zhì)。利用生防菌育苗基質(zhì)的方式來育苗，可以使生防菌在植株苗期定殖，更早發(fā)揮防治作用，并可以減少生防菌用量。楊會款［14］應(yīng)用枯草芽孢桿菌和多粘類芽孢桿菌育苗基質(zhì)，降低了煙草青枯病的發(fā)病率，在發(fā)病高峰期相對防治效果可達41.33%；戚秀秀等［26］將解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）LY11 添加到育苗基質(zhì)中，水稻紋枯病發(fā)病率降低89.32%；張曉琳等［12］發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)中添加多粘芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌后的黃瓜枯萎病發(fā)病率均顯著降低，其中多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）NSY4 處理防治效果最高，可達62.5%。目前關(guān)于抗西瓜枯萎病生防菌育苗基質(zhì)的研究還未見報道，在本試驗中，在育苗基質(zhì)中添加HBKYB-5 對西瓜枯萎病防治效果可達到74.05%，為生防菌育苗基質(zhì)推廣應(yīng)用提供依據(jù)，同時也為西瓜枯萎病的生物防治提供了新方法。