基于TLR4 信號(hào)通路探討丹參多糖緩解LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺炎癥的作用機(jī)制

靳國(guó)忠，張 迪，劉 維，竇萌萌，焦玉蘭,3，吳占軍，史萬玉,2，包永占

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 中獸醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；2. 河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071000；3. 瑞普生物藥業(yè)有限公司，河北 保定 071000；4.河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所,河北 石家莊 050035）

乳腺炎是奶牛養(yǎng)殖中常見的疾病之一，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)奶牛乳腺炎是包括衛(wèi)生條件、擠奶方式、乳房血液循環(huán)和諸多病原微生物等在內(nèi)的多方面因素共同作用的結(jié)果［1］?？茖W(xué)的養(yǎng)殖和管理可以最大程度的降低由飼養(yǎng)方面不足引發(fā)乳腺炎的概率，抗生素可以有效的治療由病原菌引起的乳腺炎癥反應(yīng)。但抗生素的長(zhǎng)期使用和濫用會(huì)提高細(xì)菌的耐藥性，抗生素還容易在動(dòng)物食品制品中殘留［2］。考慮到食品安全和耐藥殘留的問題，人們已經(jīng)開始積極尋找新的治療方法和藥物以求減少抗生素的使用［3］。天然中草藥及其提取物逐漸成為研究熱點(diǎn)［4］。

LPS 是革蘭氏陰性菌外膜的重要組成部分，在發(fā)病機(jī)制中經(jīng)常發(fā)揮關(guān)鍵作用［5］。炎癥過程中，LPS 的刺激會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞中Toll 樣受體信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)。更多的研究表明，Toll 樣受體4（TLR4）在LPS 誘導(dǎo)的炎癥過程中扮演了重要的角色［6］。LPS 侵入機(jī)體后，首先與脂多糖結(jié)合蛋白（LBP）結(jié)合，形成的結(jié)合體可以更好的與CD14 分子結(jié)合，之后將LPS 快速的呈遞給TLR4/MD-2 受體復(fù)合物，調(diào)節(jié)LPS 的識(shí)別［7］。TLR4 信號(hào)通路激活后，主要通過調(diào)節(jié)下游MyD88 和NF-κB 等蛋白來傳遞炎癥的發(fā)生［8］。使用藥物促進(jìn)機(jī)體內(nèi)清除脂多糖并調(diào)控TLR4 信號(hào)通路因子表達(dá)水平可以成為緩解炎癥損傷的研究方向。

中藥丹參是唇形科植物丹參的干燥塊莖和根部，有活血祛瘀，涼血消癰之功效［9］。SMPs 是丹參主要的水提物之一，現(xiàn)代研究證實(shí)，SMPs 具有調(diào)節(jié)免疫、減輕肝臟損傷、抗腫瘤、抗氧化和抗炎等多種作用［10］。然而，SMPs 在脂多糖誘導(dǎo)的奶牛乳腺炎模型中的抗炎作用及其分子機(jī)制尚不清楚。本試驗(yàn)選取小鼠作為試驗(yàn)對(duì)象，研究SMPs 的日常添加對(duì)乳腺炎是否具有調(diào)節(jié)作用，探討SMPs 調(diào)節(jié)乳腺炎的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠共80 只，雌性60 只，雌性20 只，8 周齡，體重35 ～40 g，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后按照雌性和雄性比例3∶1 合籠，提供充足的水和飼料，雌鼠懷孕后單籠飼養(yǎng)。分娩1 周后建立小鼠乳腺炎模型。

1.2 試劑與材料

丹參多糖（杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司）；脂多糖干粉試劑（SIGMA）；TLR4，MyD88，P65抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；MPO 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；TNF-α，IL-6 和IL-1β ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；總RNA 提取試劑盒；反轉(zhuǎn)錄試劑盒；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物（見表1）；免疫熒光試劑（寶生物工程（大連）有限公司）。

表1 目的基因引物序列、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度及序列號(hào)Table 1 Target gene primer sequence, amplified fragment length and sequence number

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與乳腺炎模型建立

本試驗(yàn)將母鼠隨機(jī)分為5 組：對(duì)照組、模型組（0.2 mg/mL）、SMPs 低劑量（250 mg/kg）組、SMPs 中劑量組（500 mg/kg）組、SMPs 高劑量組（750 mg/kg）組，每組12 只。待母鼠分娩后，按照分組使用不同濃度SMPs 溶液對(duì)雌鼠進(jìn)行1 周的灌胃，對(duì)照組和模型組用等體積生理鹽水代替；1 周后，母鼠第4 對(duì)乳頭注射LPS 進(jìn)行乳腺炎造模。對(duì)照組用等量PBS 緩沖液代替。LPS 造模24 h 后，頸椎脫臼處死母鼠，取乳腺一部分使用4%甲醛溶液固定，一部分在-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 小鼠乳腺的組織學(xué)評(píng)價(jià)

按照石蠟切片的制作流程對(duì)4%甲醛溶液固定好的乳腺組織進(jìn)行石蠟切片制作。制作好的切片進(jìn)行H＆E 染色，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察各組乳腺組織病理學(xué)變化。

1.5 小鼠乳腺組織MPO 活性及炎性因子的測(cè)定

-80 ℃冰箱中取出凍存的小鼠乳腺組織，稱取適量，加入生理鹽水將乳腺組織磨成10%的勻漿，在4 ℃下12 000 r/min 離心10 min，然后按照廠家說明書操作步驟，用試劑盒對(duì)MPO 活力和各炎性因子進(jìn)行評(píng)價(jià)測(cè)定。

1.6 Western blot 檢測(cè)小鼠乳腺組織中TLR4 信號(hào)通路變化

利用組織蛋白提取液提取乳腺組織內(nèi)蛋白，用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度。將各組小鼠乳腺組織中總蛋白濃度調(diào)至同一水平，蛋白樣品用10% 的SDS-PAGE 分離，隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并在5%脫脂牛奶中封閉。隨后，特異性一抗GAPDH、TLR4、MyD88 和p65 在4 ℃下孵育PVDF 膜過夜。室溫下用 TBST 洗滌3 次，每次5 min，然后使用特定二抗抗體孵育PVDF 膜2 h 后暗處進(jìn)行顯色操作。

1.7 RT-qPCR 檢測(cè)各組小鼠乳腺組織中TNF-α，IL-6 和IL-1β 的mRNA 表達(dá)水平變化

按照總RNA 提取試劑盒的說明在無菌無酶的條件下使用經(jīng)高壓的器械嚴(yán)格操作進(jìn)行總mRNA 的提取，測(cè)定和調(diào)整濃度后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作。使用反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR 說明書操作進(jìn)行各因子的mRNA 水平檢測(cè)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±SEM 表示。這些數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism7 (Manufacturer, La Jolla, CA,USA)采用單因素方差分析和Tukey 多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 丹參多糖對(duì)各組小鼠乳腺組織中炎癥發(fā)生程度的影響

空白對(duì)照組小鼠乳腺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，細(xì)胞核清晰可見且排列有序，代表腺泡結(jié)構(gòu)完整沒有病理損傷。模型組乳腺組織中出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡邊界模糊難以觀察，乳腺組織結(jié)構(gòu)變形被破壞，乳腺組織發(fā)生嚴(yán)重炎癥反應(yīng)。SMPs 低劑量組乳腺組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，腺泡結(jié)構(gòu)比較清晰。SMPs中劑量組乳腺組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度顯著減輕。SMPs 高劑量組乳腺組織中基本無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，整體更趨近于健康狀態(tài)（見圖1）。

圖1 SMPs 對(duì)乳腺炎小鼠乳腺組織病理學(xué)變化的影響Fig. 1 Effect of SMPs on mammary histopathological changes in mastitis mice

2.2 丹參多糖對(duì)小鼠乳腺組織內(nèi)MPO 活性和促炎因子表達(dá)水平的影響

在造模24 h 后，各組小鼠乳腺組織內(nèi)MPO 活性和促炎因子表達(dá)水平發(fā)生不同變化（見圖2）。與空白對(duì)照組相比，小鼠乳腺組織內(nèi)髓過氧化物酶（MPO）活力與炎性因子TNF-α，IL-1β 和IL-6的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著上升（P＜0.01），而與模型組相比，SMPs 各劑量組小鼠乳腺組織中MPO活性和炎性因子表達(dá)水平與模型組相比顯著下降（P＜0.01），且呈一定的劑量依賴性。

圖2 SMPs 對(duì)小鼠乳腺組織中MPO 及炎性因子表達(dá)的影響Fig. 2 Effects of SMPs on MPO and inflammatory factors expression in mouse mammary tissue

2.3 丹參多糖對(duì)小鼠乳腺組織內(nèi)TLR4 炎癥信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的影響

炎癥發(fā)生后，不同組別小鼠乳腺組織內(nèi)TLR4信號(hào)通路中蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)差異（見圖3）。與空白對(duì)照組相比，模型組TLR4 通路關(guān)鍵蛋白TLR4、MyD88 和NF-κB 表達(dá)水平顯著上升。與模型組相比，SMPs 低、中、高劑量組中TLR4 蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)顯著降低，且劑量越高降低趨勢(shì)越顯著。在MyD88蛋白表達(dá)水平上，SMPs 低劑量組中MyD88 蛋白表達(dá)水平與模型組之間變化不顯著，SMPs 中、高劑量組MyD88 蛋白表達(dá)水平均有顯著下降。SMPs 低、中、高劑量組中NF-κB 蛋白表達(dá)水平與模型組相比均有顯著降低。

圖3 SMPs 對(duì)小鼠乳腺組織中TLR4 信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響Fig. 3 Effects of SMPs on key protein expression in TLR4 signaling pathway in mouse mammary tissue

2.4 丹參多糖對(duì)小鼠乳腺組織內(nèi)TNF-α，IL-6 和IL-1β mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的影響

為了驗(yàn)證炎性因子mRNA 表達(dá)水平是否受到調(diào)節(jié)，采用RT-qPCR 法檢測(cè)因子TNF-α，IL-1β 和IL-6 mRNA 在乳腺組織內(nèi)的表達(dá)水平。如圖4 所示，LPS 刺激顯著上調(diào)了乳腺組織中TNF-α，IL-1β和IL-6 因子mRNA 表達(dá)水平（P＜0.01）。與模型組比，SMPs 各用藥組組內(nèi)TNF-α，IL-1β 和IL-6 mRNA 表達(dá)水平有不同程度的顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。

圖4 SMPs 對(duì)小鼠乳腺組織中TNF-α，IL-1β 和IL-6 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig. 4 Effects of SMPs on mRNA transcription levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in mouse mammary tissue

3 結(jié)論與討論

在炎癥發(fā)生過程中，組織內(nèi)炎性因子表達(dá)水平會(huì)發(fā)生明顯變化，據(jù)報(bào)道，TNF-α，IL-6 和IL-1β等促炎因子表達(dá)水平在乳腺組織炎癥中顯著上升［11］，有研究指出， IL-1β 的產(chǎn)生會(huì)加重組織的損傷程度，通過調(diào)控IL-1β 的產(chǎn)生可以改變機(jī)體對(duì)損傷的抵抗能力［12］。有研究表明， IL-6 的相應(yīng)抗體或阻斷劑，可以用來治療關(guān)節(jié)炎［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組炎性炎因子TNF-α，IL-6 和IL-1β 的表達(dá)水平較空白對(duì)照組顯著上升，SMPs 各劑量組乳腺組織中炎性因子的表達(dá)水平與模型組相比明顯下降。這說明SMPs 的使用降低了炎性因子的表達(dá)水平，在一定程度上減輕了炎癥對(duì)乳腺組織的損傷。

TLR4 受體在LPS 誘導(dǎo)的炎癥中活化表達(dá)，之后通過一定的復(fù)合物二聚體可以激活MyD88 依賴途徑，進(jìn)一步調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的表達(dá)，最終形成一條完整的炎癥傳遞鏈條［14］。為了闡明丹參多糖的抗炎機(jī)制，采用Westen Blot 法檢測(cè)TLR4 信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白TLR4,MyD88 和NF-κB 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，這些蛋白表達(dá)水平在炎癥過程中顯著上升。眾多研究中，Zhou Ershun 等人使用封花素（CEP）抑制了NF-κB 因子在乳腺炎小鼠模型中的活化，從而實(shí)現(xiàn)了藥物的抗乳腺炎作用［15］。Xingxing Chen 等人進(jìn)一步探究了藥物荷花堿（Nuciferine）是通過抑制TLR4-NF-κB 信號(hào)通路來改善LPS 誘導(dǎo)的乳腺炎癥［16］。盧勁曄等人采取NLRP3 抑制劑預(yù)處理，可以減輕大腸桿菌所致的乳腺組織損傷并且降低炎癥小體表達(dá)［17］。Maiju Rinne 等人闡釋了米托蒽酮、吡哌酮和米托蒽酮（2 羥乙基）哌 嗪（Mitoxantrone, pixantrone and mitoxantrone（2-hydroxyethyl)piperazine）等藥物在拮抗TLR4 受體方面的機(jī)制，這些藥物可以通過拮抗TLR4 進(jìn)一步達(dá)到抑制NF-κB 激活和TNF-α 生成的作用［18］，這說明抑制信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)可以減輕炎癥。并不是所有的藥物都通過MyD88 依賴途徑來調(diào)節(jié)炎癥，在試驗(yàn)中也對(duì)SMPs 的具體作用路徑進(jìn)行探究［19-20］。本試驗(yàn)表明，SMPs 抑制了TLR4,MyD88和NF-κB 蛋白在LPS 誘導(dǎo)的小鼠乳腺組織炎癥中的表達(dá)水平，說明SMPs 可能是通過MyD88 依賴途徑來調(diào)控TLR4/NF-κB 信號(hào)通路以達(dá)到保護(hù)乳腺組織的作用。

乳腺組織在炎癥發(fā)生時(shí)，促炎因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6）的mRNA 轉(zhuǎn) 錄 水 平 會(huì) 上 升，這 與宿主防御系統(tǒng)的免疫應(yīng)答有關(guān)［21］。黃永周等人使用梔子苷治療患乳腺炎的小鼠，檢測(cè)結(jié)果顯示小鼠乳腺上皮細(xì)胞中炎性因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平下降［22］。本試驗(yàn)中模型組的促炎因子mRNA 水平顯著上升，用藥組的水平呈劑量依賴性下降，這直觀的說明了SMPs 在乳腺組織中可以發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，SMPs 可以通過抑制TLR4 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)來調(diào)節(jié)炎癥；同時(shí)還可以抑制組織內(nèi)促炎因子的表達(dá)來緩解炎癥對(duì)乳腺組織的損傷。SMPs 可以成為預(yù)防奶牛乳腺炎的潛在藥物。