核桃內(nèi)種皮脂質(zhì)和氨基酸組成分析

謝素雅，曹尚橋，李紅波，張小勇，劉振彬，胡梁斌，莫海珍

（1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.中糧工科（西安）國際工程有限公司，陜西 西安 710082）

核桃種植遍布世界各地，我國擁有最大的種植面積和產(chǎn)量。作為重要的堅(jiān)果樹種和木本糧油樹種，核桃具有很高的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益[1]。核桃的全系產(chǎn)業(yè)鏈價(jià)值十分可觀，但就目前而言，產(chǎn)品的附加值開發(fā)程度整體較低。為了提高核桃油的加工品質(zhì)，在產(chǎn)品加工過程中需要脫掉核桃內(nèi)種皮（俗稱核桃仁囊衣），有助于改善核桃油脂色澤、消除不良風(fēng)味，但也意味著核桃內(nèi)種皮在加工過程中被丟棄而造成資源浪費(fèi)。

核桃的內(nèi)種皮是包裹在核桃仁表面的一層薄膜，成熟干制后呈金黃色，有苦澀味[2]。中醫(yī)認(rèn)為，核桃皮可以入藥，也可以泡水。核桃皮的性溫、味苦辛，歸肝、膽、胃經(jīng)，有養(yǎng)胃健胃、疏肝衛(wèi)膽、潤通腸胃、治療頑癬、殺蟲止癢的功效，也有一定的補(bǔ)腎潤肺、養(yǎng)身補(bǔ)氣的功效。有研究表明，核桃內(nèi)種皮總酚含量和抗氧化能力遠(yuǎn)高于核桃仁[2-4]。萬政敏等人[5]發(fā)現(xiàn)核桃內(nèi)種皮中富含多種酚酸類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)，榮瑞芬等人[6]對核桃內(nèi)種皮的營養(yǎng)及功能成分（蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等）進(jìn)行了初步分析，結(jié)果表明其中含有較豐富的脂肪和蛋白質(zhì)。但是目前有關(guān)研究僅限于含量測定，對于內(nèi)種皮中氨基酸及脂質(zhì)組成尚未深入探討，極大地限制了其產(chǎn)業(yè)開發(fā)應(yīng)用及核桃內(nèi)種皮油脂的深度梯次加工。

以陜西香玲核桃為研究對象，通過分析核桃內(nèi)種皮中氨基酸的組成、內(nèi)種皮油脂中脂質(zhì)成分、脂肪酸及甘油酯的組成，以期為核桃內(nèi)種皮高值化產(chǎn)品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，減少資源浪費(fèi)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料：香玲核桃，山東省果樹所1978年雜交育成的早實(shí)，產(chǎn)地為陜西延安。

試驗(yàn)試劑：氯仿、甲醇、濃硫酸、氯化鈉、2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）均為分析純，天津天力化學(xué)試劑有限公司提供；正己烷、甲醇均為色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑廠提供。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；MD200-1型氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司產(chǎn)品；JA2003N型電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品；FW-100D型高速萬能粉碎機(jī)，天津鑫博得儀器有限公司產(chǎn)品；RE100-Pro型冷凍干燥機(jī)，四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展（北京）有限公司產(chǎn)品；RE100-Pro型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司產(chǎn)品；GC-MS 6800型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，江蘇天瑞儀器股份有限公司產(chǎn)品；LCMSMS液 質(zhì) 聯(lián) 用 儀 （Q Exactive Orbitrap LCMSMS），賽默飛世爾科技（中國）有限公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀，滕州市滕海分析儀器有限公司產(chǎn)品；HH-S6L型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

核桃去殼置于沸水中浸泡一段時(shí)間后去皮處理，收集核桃內(nèi)種皮裝入密封袋放入-80℃冰箱中備用。

1.3.2 蛋白質(zhì)、脂肪含量測定

蛋白質(zhì)參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》的方法進(jìn)行測定，脂肪參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》的方法測定。

1.3.3 氨基酸組成測定

氨基酸組成的測定參照《HRZ/ZDS-GF-015-2020飼料中氨基酸的測定高效液相色譜法》。

1.3.4 核桃內(nèi)種皮油脂的提取

油脂提取采用Folch J等人[7]的方法稍作修改，將核桃內(nèi)種皮粉碎后冷凍干燥，溶劑以氯仿∶甲醇∶水=2∶1∶0.75（V/V/V）的比例，樣品和溶劑以1∶15的比例進(jìn)行制備，其中加入0.005%的BHT做抗氧化處理，超聲波（40 kHz，100 W）輔助萃取20 min，溫度設(shè)置為30℃，靜置分層后真空抽濾，去除樣品殘?jiān)蟮谷敕忠郝┒缝o置，收集下層溶液進(jìn)行旋蒸，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀溫度設(shè)置40℃，每種樣品重復(fù)3次萃取，旋蒸后還殘存的有機(jī)溶劑用氮吹儀輔助去除得到核桃仁種皮油脂。

1.3.5 脂質(zhì)組成測定

將100 μL樣品加入到有聚四氟乙烯襯里帽的玻璃離心管中，加入0.75 mL預(yù)冷的甲醇，渦旋振蕩。加入2.5 mL預(yù)冷的甲基叔丁基醚，在搖床上室溫孵育1 h加入0.625 mL質(zhì)譜級水混勻，使有機(jī)相分層，室溫孵育10 min后，以轉(zhuǎn)速1 000 r/min離心10 min。收集上層有機(jī)相，向下層（水和甲醇）加入1 mL混合溶劑（甲基叔丁基醚/甲醇/水（10∶3∶25，V/V/V））再次萃取，收集上層有機(jī)相。將2次收集的有機(jī)相用氮吹儀進(jìn)行氮吹濃縮。用100 μL混合溶劑異丙醇進(jìn)行復(fù)溶，之后用LC-MS/MS系統(tǒng)檢測分析，從每個已處理好的樣本中取等量上清液混勻作為QC樣本。色譜分析條件：色譜柱Thermo Accucore C30；柱溫40℃；流速為0.35 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；流動相A：（乙腈∶水=60∶40）+0.1%甲酸+10 mmol/L乙酸銨；流動相B：（異丙醇∶乙腈=90∶10）+0.1%甲酸+10 mmol/L乙酸銨。質(zhì)譜分析條件：正負(fù)離子模式下：鞘氣，20個任意單位；掃描氣體，1任意單位；輔助氣量，5（負(fù)離子：7）；噴霧電壓，3 kV；毛細(xì)管溫度，350℃；加熱溫度，400℃；S-透鏡射頻水平，50；掃描范圍，114～1 700 m/z；自動增益控制目標(biāo)，1e6；標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量，25、30（負(fù)離子，20、24、28）；注入時(shí)間，100 ms；隔離窗口，1 m/z；自動增益控制目標(biāo)（MS2），1e5；動態(tài)排除，15 s。

1.3.6 脂肪酸組成測定

脂肪酸甲酯化：取20 μL油脂樣品放入具塞試管，加入1%的硫酸甲醇溶液1.5 mL，于80℃水浴鍋中水浴1 h，期間不時(shí)搖晃試管，水浴后依次加入飽和的NaCl溶液1 mL，去離子水1 mL，色譜純正己烷2 mL，靜置分層后從上層吸取750 μL放至進(jìn)樣瓶進(jìn)行GC-MS分析。檢測脂肪酸甲酯使用安捷倫7000D三重四極桿GC-MS儀進(jìn)行分析。配有Agilent DB-23型色譜柱（內(nèi)徑30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm）。所有測量在全掃描模式下（50～500 m/z）執(zhí)行以下程序：初始溫度為130℃，保溫時(shí)間為1 min，然后以5℃/min上升至230℃，最終溫度為230℃，保溫5 min，總運(yùn)行時(shí)間為26 min。采用自動進(jìn)樣器分流（1∶20），進(jìn)樣量為1 μL。

1.3.7 甘油酯組成測定

采用高效液相色譜（NP-HPLC，折射率檢測器）對甘油酯進(jìn)行分析，HPLC儀器分析條件：Phenomenex Luna硅膠柱（內(nèi)徑250 mm×4.6 mm×5 μm）；流動相為正己烷、2-丙醇和甲酸（21∶1∶0.003，V/V/V），流速1 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣體積為10 μL；每個樣品檢測時(shí)間為45 min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)運(yùn)用利用EXCEL 2003、Origin 8.5來繪制圖形，SPSS軟件進(jìn)行方差及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃內(nèi)種皮的蛋白質(zhì)、脂肪分析

核桃內(nèi)種皮與核桃仁蛋白質(zhì)、脂肪含量對比（100 g干質(zhì)量）見表1。

表1 核桃內(nèi)種皮與核桃仁蛋白質(zhì)、脂肪含量對比（100 g干質(zhì)量）/g

和文獻(xiàn)[8]中報(bào)道的核桃仁營養(yǎng)成分比較，內(nèi)種皮中蛋白質(zhì)的含量相對較高，約為13.94%，比一般核桃仁中的蛋白質(zhì)高出3.85 g/100 g；而脂肪含量相對較少，比一般核桃仁中的脂肪少約41.55 g/100 g。蛋白質(zhì)含量是企業(yè)收購核桃原料時(shí)主要考量因素之一[9]?？梢钥闯觯颂覂?nèi)種皮中富含較高的蛋白，具有一定利用價(jià)值。

2.2 核桃內(nèi)種皮的氨基酸組成分析

通過HPLC發(fā)現(xiàn)核桃內(nèi)種皮中富含16種氨基酸，包含7種必需氨基酸和9種非必需氨基酸。

核桃內(nèi)種皮氨基酸組成及含量見表2。

由表2可以看出，核桃內(nèi)種皮的總氨基酸（TAA）含量為77.96 mg/g，其中必需氨基酸（EAA）含量為25.85 mg/g，占比33.16%；非必需氨基酸（NEAA）含量為52.11 mg/g。必需氨基酸中亮氨酸的含量最高，達(dá)到6.13 mg/g，甲硫氨酸的含量最低，僅有0.84 mg/g；非必需氨基酸中谷氨酸（13.98 mg/g）和精氨酸（8.87 mg/g）的含量較高，胱氨酸的含量最低，為0.78 mg/g。必需氨基酸中的亮氨酸是復(fù)配氨基酸靜脈注射液的重要成分，對維持危重病人的營養(yǎng)需求有著積極的作用，同時(shí)亮氨酸在調(diào)節(jié)氨基酸和蛋白質(zhì)代謝等方面也有重要作用；苯丙氨酸是氨基酸類抗癌藥物的中間體，也是生產(chǎn)腎上腺素、甲狀腺素和黑色素的原料。非必需氨基酸中的谷氨酸是鮮味氨基酸，在促進(jìn)紅細(xì)胞生成、改善腦細(xì)胞營養(yǎng)及活躍思維等方面發(fā)揮重要作用[10]。核桃內(nèi)種皮中氨基酸的含量及種類十分豐富，具有較大的開發(fā)應(yīng)用潛力。

表2 核桃內(nèi)種皮氨基酸組成及含量

2.3 核桃內(nèi)種皮的脂質(zhì)組成分析

通過液相二級質(zhì)譜LC-MS/MS對核桃內(nèi)種皮脂質(zhì)組成進(jìn)行分析研究，發(fā)現(xiàn)在正負(fù)離子模式下核桃內(nèi)種皮共檢測出了10類甘油磷脂（PC，PE，PS，PEtOH，PMeOH，HBMP，PG，PI，PA，CL）、3類鞘脂（SM，Cer，GlcCer）、4類甘油酯（AcylGlcADG，GlcADG，DAG，TAG）、2類糖脂（MGDG，SQDG）、1類脂肪酰，共451種脂質(zhì)代謝物。

甘油磷脂類有232種，其中包含磷脂酰膽堿（PC）96種、磷脂酰乙醇胺（PE）58種、磷脂酰絲氨酸（PS）11種、磷脂酰乙醇（PEtOH）1種、磷脂酰甲醇（PMeOH）1種、半雙（單?；└视土姿狨ィ℉BMP）12種、磷脂酰甘油（PG）14種、磷酯酰肌醇（PI）18種、磷脂酸（PA）20種、心磷脂（CL）1種，測定結(jié)果顯示PC、PE的含量比較豐富。檢測出的96個PC分子種，其主要種類為17∶1/17∶1和18∶2/18∶2。

核桃內(nèi)種皮甘油磷脂類PC分子種相對定量分析結(jié)果見表3。

由表3可知，檢測出的58種PE分子種的主要種類為16∶0/17∶1。PC、PE是細(xì)胞膜中最豐富的磷脂，其合成底物為三磷酸胞苷（CTP），可用于激活代謝物。機(jī)體組織中PC、PE含量的變化與代謝紊亂（如動脈粥樣硬化、胰島素抵抗和肥胖）有關(guān)[11]。

表3 核桃內(nèi)種皮甘油磷脂類（PC）分子種相對定量分析結(jié)果

核桃內(nèi)種皮甘油磷脂類PE分子種相對定量分析結(jié)果見表4。

表4 核桃內(nèi)種皮甘油磷脂類（PE）分子種相對定量分析結(jié)果

鞘脂類共有77種，其中包含22種鞘磷脂

（SM），34種神經(jīng)酰胺（Cer），21種葡萄糖神經(jīng)酰胺（GlcCer）。鞘脂類（SM）的含量比較豐富，檢測出鞘磷脂的主要種類為15∶1/27∶1以及23∶1/13∶0。鞘磷脂是具有潛在的抑癌作用的一種脂類，與人體內(nèi)的膽固醇、脂肪酸、毒枝菌素所引起的疾病有密切關(guān)系，已發(fā)現(xiàn)了鞘磷脂在一定程度上能夠預(yù)防動物的結(jié)腸癌與動脈硬化的形成[12]。甘油酯類共有132種，其中包含8種?；咸烟侨┧峄８视停ˋcyl-GlcADG），12種葡萄糖醛酸基二酰甘油（GlcADG），11種二酰甘油（DAG），101種三酰甘油（TAG）。糖脂類共有9種，其中包含7種單半乳糖二酰甘油酯（MGDG）和2種硫代異鼠李糖甘油二酯（SQDG）。脂肪酰類僅檢測出一種羥基脂肪酸脂肪酸酯（FAHFA），其種類為18∶1/18∶1。

核桃內(nèi)種皮鞘脂類（SM）分子種相對定量分析結(jié)果見表5。

表5 核桃內(nèi)種皮鞘脂類（SM）分子種相對定量分析結(jié)果

2.4 核桃內(nèi)種皮的脂肪酸組成分析

通過GC-MS對核桃內(nèi)種皮脂肪酸組成進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。核桃內(nèi)種皮中飽和脂肪酸總含量為9.39%，其中棕櫚酸含量6.43%，硬脂酸含量為2.7%，豆蔻酸和十五烷酸的含量最低，僅為0.03%。單不飽和脂肪酸含量達(dá)23.28%，其中油酸含量高達(dá)23%，棕櫚油酸含量為0.08%。核桃內(nèi)種皮中含有豐富的多不飽和脂肪酸，含量高達(dá)66.4%，其中亞油酸含量占51.9%，α-亞麻酸含量占14.5%。

不少研究發(fā)現(xiàn)，不飽和脂肪酸在降低膽固醇，預(yù)防、緩解心腦血管疾病、糖尿病和肥胖癥方面具有重要的功效，既可以作為輔助治療血栓的藥物，也可作為高級食用油，同時(shí)又可以開發(fā)成保健產(chǎn)品[13-14]。單不飽和脂肪酸對降膽固醇和降血糖都有明顯的作用，油酸不僅可以保護(hù)動脈免受損傷，而且對人體的循環(huán)系統(tǒng)也具有一定的保護(hù)功能[15-16]。多不飽和脂肪酸對癌細(xì)胞有毒性作用[17]。亞油酸能抑制膽固醇在小腸中的吸收，促進(jìn)肝臟內(nèi)膽固醇的降解和排除，改變體內(nèi)膽固醇的分布，預(yù)防動脈硬化[18-20]。亞麻酸是機(jī)體的必需脂肪酸，在降低血脂血壓、抗血栓、改善心血管疾病、提高記憶力、保護(hù)神經(jīng)組織、預(yù)防過敏性疾病、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、延緩衰老等方面具有重要的生理學(xué)功能[19，21-22]。核桃內(nèi)種皮富含油酸、必需脂肪酸亞油酸和α-亞麻酸，因此可以將其加工成高級食用油滿足消費(fèi)者的飲食需求，也可以用來開發(fā)成新型保健產(chǎn)品、輔助治療相關(guān)病癥的藥物。

核桃內(nèi)種皮脂肪酸組成及含量見表6。

表6 核桃內(nèi)種皮脂肪酸組成及含量

2.5 核桃內(nèi)種皮的甘油酯組成分析

通過HPLC檢測發(fā)現(xiàn)核桃內(nèi)種皮中甘油二酯（DAG）含量為2.93%，其中1,3-甘油二酯含量為0.26%，1,2-甘油二酯含量為2.67%。甘油三酯（TAG）含量達(dá)到96.96%，游離脂肪酸（FFA）含量為0.11%。DAG是公認(rèn)安全的食品成分，有研究表明，DAG具有減少內(nèi)臟脂肪、抑制體重增加、降低血脂的作用。

核桃內(nèi)種皮脂肪酸組成及含量見表7。

表7 核桃內(nèi)種皮脂肪酸組成及含量

3 結(jié)論

對陜西香玲核桃內(nèi)種皮的氨基酸組成及油脂中的脂質(zhì)分子、脂肪酸和甘油酯組成進(jìn)行綜合分析，結(jié)果表明核桃內(nèi)種皮中蛋白質(zhì)和脂肪含量分別為13.94 g/100 g和19.06 g/100 g；氨基酸種類豐富，包括7種必需氨基酸和9種非必需氨基酸，其中谷氨酸含量達(dá)到13.98 mg/g；內(nèi)種皮油脂中鑒定出甘油磷脂類、鞘脂類、甘油酯類、糖脂類及脂肪酰類共451種脂質(zhì)分子，其中PC、PE、SM及ADG相對含量較高；油脂中不飽和脂肪酸含量高達(dá)89.69%，其中油酸、亞油酸、α-亞麻酸含量最高；甘油三酯含量達(dá)到96.96%并含有少量的甘油二酯（2.93%）。核桃內(nèi)種皮具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值，可能為核桃內(nèi)種皮的高值化利用提供理論基礎(chǔ)，減少資源浪費(fèi)。