炎癥性腸病與腸道菌群

閆一帆 姜 敏 孫明軍

炎癥性腸病（IBD）包括潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克羅恩病（CD），是一類病因和發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚的腸道炎性反應(yīng)性疾病。有關(guān)IBD發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在遺傳易感性、腸道免疫異常及腸道菌群改變。近年來越來越多的研究認(rèn)為，IBD可能主要由遺傳易感體質(zhì)決定，腸道免疫調(diào)節(jié)紊亂是關(guān)鍵的直接發(fā)病機(jī)制，腸道菌群是這種免疫損傷過程的重要激發(fā)因素，環(huán)境、精神等因素可能是發(fā)病的誘因，這一觀點(diǎn)得到大多數(shù)學(xué)者的支持。本文重點(diǎn)介紹IBD患者的腸道菌群變化及微生態(tài)制劑（MEA）在IBD中的應(yīng)用。

1 腸道菌群與分布

正常生理狀態(tài)下人類腸道內(nèi)含近500種細(xì)菌，成人腸道菌群主要集中在結(jié)腸和末端小腸，有多達(dá)1 013種不同類型和數(shù)量的細(xì)菌，約是人體內(nèi)真核細(xì)胞的10倍［1］。上段小腸中需氧菌及革蘭陰性菌占絕大多數(shù)；回盲部細(xì)菌密集，厭氧菌占優(yōu)勢（如類桿菌、雙歧桿菌、真菌、乳酸菌及梭狀芽孢桿菌）；結(jié)腸中厭氧菌數(shù)量更多，優(yōu)勢菌為類桿菌、雙歧桿菌和真菌，革蘭陰性球菌、梭狀芽孢桿菌、腸球菌、腸桿菌等也常見于結(jié)腸中［2］。盲腸內(nèi)的細(xì)菌約25%為兼性厭氧菌，尤其是腸桿菌屬。腸道的菌群大致可分為3類：（1）與宿主共生的生理性細(xì)菌，為專性厭氧菌，是腸道的優(yōu)勢菌群，分別是類桿菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、C.1ept u m菌屬、C.coccoides菌屬和腸菌屬，具有營養(yǎng)及免疫調(diào)節(jié)作用；（2）與宿主共棲的條件致病菌，以兼性需氧菌為主，為腸道非優(yōu)勢菌群（腸球菌和腸桿菌），當(dāng)腸道菌群紊亂或不平衡時對人體有害；（3）病原菌，大多為過路菌，長期定植的機(jī)會少，體內(nèi)生態(tài)平衡時即便存在，由于數(shù)量少，不足以致病，一旦數(shù)量超出正常則致病（變形桿菌和假單胞菌）。但腸道細(xì)菌的組成目前尚未明確，只有10%～40%腸道細(xì)菌可以用培養(yǎng)的方法來鑒別［3］，主要原因是取樣和培養(yǎng)比較困難。腸道菌群相互制約、相互依存，保持微生物的生態(tài)平衡，對宿主具有消化、吸收、營養(yǎng)和生物拮抗等生理作用，是宿主生命必需的組成部分。

2 IBD患者的腸道菌群變化

IBD的發(fā)病涉及環(huán)境、遺傳易感性和免疫異常，發(fā)病的觸發(fā)點(diǎn)可能是腸道內(nèi)致病菌與正常細(xì)菌比例失調(diào)。誘發(fā)腸道炎性反應(yīng)的因素有［4］：（1）腸道內(nèi)致病菌增多，分泌的腸毒素使腸上皮通透性增加；（2）致病菌分泌免疫抑制性蛋白，導(dǎo)致黏膜免疫失調(diào)；（3）致病菌直接侵襲、損傷上皮細(xì)胞；（4）某些過度生長的細(xì)菌影響腸上皮細(xì)胞的能量代謝，導(dǎo)致上皮細(xì)胞損傷。

2.1 UC與腸道菌群

盡管目前UC的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但腸道菌群與UC發(fā)病的關(guān)系是近年的研究熱點(diǎn)，一系列臨床試驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)均顯示，UC患者的腸道菌群與健康人群存在差異。Kleessen等［5］利用熒光原位雜交技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在83%的UC患者結(jié)腸黏膜標(biāo)本中存在細(xì)菌對腸黏膜的侵襲，但在對照組中并未發(fā)現(xiàn)。Nishikawa等［6］研究細(xì)菌16S r RNA基因的限制性片段的多態(tài)性，從UC患者標(biāo)本中得到的限制性片段的數(shù)量明顯少于健康對照組，說明UC患者腸道菌群多態(tài)性顯著降低的主要原因是腸道共生菌減少。崔海宏等［7］采用梯度稀釋方法進(jìn)行腸道菌群分析，發(fā)現(xiàn)UC急性期患者腸道菌群中腸桿菌、腸球菌等致病菌數(shù)量明顯增加，而乳桿菌等正常菌群數(shù)量明顯減少，緩解期患者的擬桿菌及雙岐桿菌較急性期明顯增加，且與對照組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ohkusa等［8］從UC患者體內(nèi)分離并培養(yǎng)變形梭狀桿菌，用含有變形梭狀桿菌的上清液給小鼠灌腸，24 h后小鼠結(jié)腸細(xì)胞的變化與用丁酸溶液灌注的結(jié)果相同，均出現(xiàn)黏膜下潰瘍、炎性細(xì)胞聚集及細(xì)胞凋亡性改變。劉偉等［9］選取廣州地區(qū)40例腸道病變僅局限于乙狀結(jié)腸以下的UC患者，用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測標(biāo)本中乳酸桿菌、大腸桿菌及雙歧桿菌的含量，結(jié)果顯示UC患者病變腸段的雙歧桿菌、乳酸桿菌含量均較健康者低，大腸桿菌含量較健康者高。Macfarlane等［10］應(yīng)用16S r RNA探針熒光原位雜交法研究UC患者直腸活檢標(biāo)本中的菌群，發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌數(shù)量約為正常對照組的1／30，且UC患者的雙歧桿菌優(yōu)勢菌群與正常對照組亦有明顯不同。多中心研究顯示，UC患者急性期和緩解期細(xì)菌種類增加，但腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌減少［11］。

2.2 CD與腸道菌群

Manichanh等［12］首次采用宏基因組學(xué)方法比較CD患者和健康人糞便樣品中細(xì)菌的多樣性組成情況，發(fā)現(xiàn)CD患者糞便樣品中厚壁菌門的多樣性明顯減少。有研究在CD患者回腸分離出一種能黏附并侵入腸上皮細(xì)胞的菌株，稱為adherentinvasive E.coli（AIEC），結(jié)果顯示在21.7%CD患者的腸黏膜中能檢測到AIEC存在，遠(yuǎn)高于對照組（6.2%），AIEC進(jìn)入腸腔后感染巨噬細(xì)胞，后者釋放干擾素－γ（IFN－γ）和腫瘤壞死因子－α（TNF－α），因此通過此方式能促進(jìn)AIEC的定植，使炎性反應(yīng)不斷 加 重［13］。 有 研 究 還 發(fā) 現(xiàn)，另 一 種 細(xì) 菌Mycobacteriu m aviu m subsp.Paratabercalosis（MAP）能引起反芻動物發(fā)生肉芽腫性炎性反應(yīng)（類似人類CD），并可使無菌飼養(yǎng)的白細(xì)胞介素－10（IL－10）基 因 缺 陷 小 鼠 出 現(xiàn) 結(jié) 腸 炎［14］。Ricanek等［15］采用r RNA分子探針技術(shù)研究CD患者回腸及結(jié)腸病變部位黏膜的細(xì)菌分布情況，結(jié)果顯示，與健康對照組相比，CD患者的桿菌明顯減少（42%比71%）、厚壁菌屬增加（42%比28%）、變形菌增加（15%比0）。國內(nèi)Liu等［16］選取了15例CD患者、23例腸道結(jié)核患者及21名健康志愿者，檢測3組糞便細(xì)菌，結(jié)果顯示CD患者的乳酸桿菌及雙歧桿菌較健康志愿者明顯減少，但擬桿菌增加。上述研究結(jié)果均表明，CD患者腸道菌群的組成與健康個體有明顯的差異。

3 腸道菌群的檢測方法

健康人群糞便中的微生物群數(shù)量和種類具有生理上的穩(wěn)定性和恒定性。當(dāng)出現(xiàn)胃腸道疾病時，糞便菌群在一定程度上反映腸道菌群的異常。因此，對患者糞便的細(xì)菌學(xué)檢查是研究患者腸道菌群分布的重要途徑。

3.1 傳統(tǒng)腸道菌群的檢測方法

傳統(tǒng)腸道菌群的檢測方法包括新鮮糞便涂片鏡檢和糞便細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定。直接涂片糞便菌群分析方法是目前臨床微生物檢驗(yàn)中廣泛采用的方法，主要用于菌群失調(diào)的快速診斷和糞便菌群狀態(tài)的綜合判斷。該方法可綜合判斷糞便菌群狀態(tài)，但其對菌群分布的分析是粗略的，主觀因素較強(qiáng)，只能作為初步評價［17］。糞便中細(xì)菌組成復(fù)雜，多為厭氧菌，需要分別進(jìn)行需氧和厭氧培養(yǎng)，在復(fù)雜的腸道菌群中，只有10%～40%可通過糞便細(xì)菌培養(yǎng)方法得以鑒定和定量，細(xì)菌培養(yǎng)周期長，操作繁瑣，易受操作方法影響，靈敏度低，并且由于各種細(xì)菌的生長條件及生長率不同，使培養(yǎng)鑒定結(jié)果不夠準(zhǔn)確［18］。

3.2 分子生物學(xué)方法

分子生物學(xué)方法不僅能對苛養(yǎng)菌進(jìn)行定量檢測，還可以分析不同人群間腸道微生態(tài)組成的異同，常用的技術(shù)包括ERIC－PCR技術(shù)，16S r RNA基因分析、腸毒素基因篩查等。ERIC－PCR技術(shù)存在的問題是總DNA的ERIC－PCR擴(kuò)增條帶有隨機(jī)性，在ERIC－PCR電泳指紋圖譜中具有相同遷移速度的DNA片段，只能推定它們的相對分子質(zhì)量相近而已，卻不能肯定它們的堿基序列相同［19］。

16S r RNA是核糖體小亞基的骨架，是細(xì)菌染色體上編碼16S r RNA相對應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的染色體基因組中，全長約1 540 bp，其堿基序列含有進(jìn)化速度不同的可變區(qū)和保守區(qū)，保守區(qū)在進(jìn)化過程中保持穩(wěn)定，可變區(qū)包括了不同菌種在進(jìn)化過程中的不同突變差異，兩者相互交錯排列［20］。根據(jù)不同細(xì)菌的16S r RNA設(shè)計(jì)特異性引物，以待測DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物測序，比對基因文庫，既可以進(jìn)行菌種的鑒定，還可以通過實(shí)時熒光PCR定量分析檢測細(xì)菌DNA的拷貝數(shù)［21］。

實(shí)時PCR對病原菌的致病基因進(jìn)行定量檢測，可以判斷腸道中致病菌存在與否及其毒力分型。利用已知腸毒素基因的特異性引物，以待測DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光檢測或瓊脂糖凝膠電泳，可得出標(biāo)本中細(xì)菌的種類及含量。

分子生物學(xué)方法解決了苛養(yǎng)菌難以培養(yǎng)的問題，其敏感性及特異性高，省時省力，但并非十全十美，糞便中含有大量的PCR抑制物如膽紅素、多種血紅蛋白降解產(chǎn)物、植物源性多糖等，會影響PCR體系的擴(kuò)增效率。

4 MEA對IBD的治療作用

MEA包括益生菌、益生元和合生元3大類。益生菌是指活微生物，口服后影響并改變腸道微環(huán)境，最終起到有益作用，Thompson－Chagoyán等［22］將其定義為人體自有的，且對宿主自身無致病性，可定植于腸道并于腸道內(nèi)繁殖，有抗菌作用，可調(diào)節(jié)免疫，并對宿主代謝活動產(chǎn)生影響的多種微生物。目前臨床常用制劑包括雙歧桿菌、乳酸桿菌、地衣芽孢桿菌等。益生元是一種不被消化的食物成分，可被正常細(xì)菌利用，能選擇性地促進(jìn)結(jié)腸內(nèi)有益細(xì)菌的生長或活性，對宿主發(fā)揮有益的作用，主要包括菊粉、乳果糖等多種寡糖類物質(zhì)。合生元是益生菌與益生元的混合物，既補(bǔ)充了益生菌，同時使用益生元也促進(jìn)了益生菌的生長與繁殖。目前根據(jù)細(xì)菌的存活與否將微生態(tài)制劑分為活菌制劑和滅活菌制劑，臨床上除乳酸菌素片和樂托兒是滅活菌制劑外，大部分是活菌制劑。

MEA的作用主要是調(diào)整和保持微生態(tài)平衡、提高宿主的健康水平，有研究表明MEA可能通過以下機(jī)制而起作用：（1）維持腸道內(nèi)菌群的動態(tài)平衡；（2）增強(qiáng)腸黏膜免疫功能，提高免疫力；（3）生物拮抗作用；（4）增強(qiáng)腸道黏膜屏障；（5）抗腫瘤；（6）營養(yǎng)作用。

歧紅陽等［23］應(yīng)用含有以雙歧桿菌為主的4種活菌的益生菌制劑聯(lián)合美沙拉嗪治療輕中度UC患者，其療效優(yōu)于單用美沙拉嗪。秦榮等［24］應(yīng)用枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊（美常安）聯(lián)合5－氨基水楊酸（美迪莎）治療輕中度UC患者，其緩解率明顯高于單用美迪沙。Hegazy等［25］將30例UC患者隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組給予柳氮磺胺吡啶（SASP，2 400 mg／d）＋益生菌，對照組僅給予柳氮磺胺吡啶（2 400 mg／d），在給藥前及治療后8周分別用紫外分光光度法檢測病變部位結(jié)腸髓過氧化物酶的活性，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測病變部位腸黏膜白細(xì)胞介素－6（IL－6）及糞鈣衛(wèi)蛋白的水平，用免疫組化法及RT－PCR方法檢測核因子－κB（NF－κB）、p65及雙歧桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述指標(biāo)均較對照組明顯降低。Macf arlane等［26］給活動期 UC患者口服含有雙歧桿菌的合生元1個月，試驗(yàn)前后均用細(xì)菌學(xué)和直腸活檢方法檢測患者腸內(nèi)細(xì)菌比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)定植在腸黏膜上的雙歧桿菌明顯增加，表明益生菌可改善腸道菌群。Zocco等［27］的研究中，187例靜止期UC患者隨機(jī)接受乳桿菌GG、美沙拉嗪或兩者聯(lián)合治療，結(jié)果顯示乳桿菌GG控制UC復(fù)發(fā)的作用與美沙拉嗪無明顯差異，但在延長復(fù)發(fā)時間上前者更為有效。Steed等［28］對35例活動期CD患者進(jìn)行一項(xiàng)隨機(jī)雙盲對照試驗(yàn)，給予治療組合生元（含雙歧桿菌2×1011CFU／g，2次／d），對患者進(jìn)行病情評估（臨床表現(xiàn)、腸道活檢、細(xì)胞因子），結(jié)果顯示治療組的克羅恩病活動指數(shù)（CDAI）得到明顯改善，而對照組則無明顯改變。有研究觀察非致病性酵母菌對CD的治療作用，對32例臨床緩解期患者分別用5－氨基水楊酸或5－氨基水楊酸聯(lián)合酵母菌治療6個月，結(jié)果顯示單獨(dú)用5－氨基水楊酸組的CD復(fù)發(fā)率為37.5%，而與MEA合用的患者CD復(fù)發(fā)率僅為6.25%［29］。

5 存在的問題和展望

綜上所述，IBD患者的腸道菌群與健康人存在差異，究竟是哪些菌群導(dǎo)致了IBD？是IBD導(dǎo)致腸道菌群變化，還是腸道菌群變化誘導(dǎo)IBD？這些問題均有待進(jìn)一步研究。腸道菌群與IBD的發(fā)病密切相關(guān)，益生菌治療IBD的療效是肯定的，但是存在一些問題，目前缺少對MEA治療IBD的大樣本隨機(jī)雙盲對照臨床試驗(yàn)，MEA治療IBD的時機(jī)、劑量、療程、安全性問題尚不明確。通過深入研究，相信未來益生菌將被廣泛應(yīng)用于臨床治療IBD。

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