傳統(tǒng)插片法接種方法的改進與應用

鄭菲菲 吳志新 李莉娟 黎潔 祝東梅

摘 要：放線菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察是水產(chǎn)微生物學實驗課程的重要實驗之一，實驗教學中一直采用壓片浸染法和印片浸染法觀察放線菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)，但觀察效果不好。采用插片浸染法后，學生通過簡單操作即可清晰地觀察到完整自然的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和分生孢子形態(tài)。傳統(tǒng)插片法接種操作不方便，接種時間長，效率低;改進后的接種方法不僅操作簡單方便省時，而且還大大提高了實驗教學的效果，激發(fā)了學生探索微觀世界的興趣。

關(guān)鍵詞：放線菌;插片法;接種;形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

中圖分類號 G642.0 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2022）01-0138-02

水產(chǎn)微生物學實驗是水產(chǎn)養(yǎng)殖和水族科學與技術(shù)專業(yè)重要的專業(yè)基礎(chǔ)必修課。通過課程的學習，學生不僅可以強化和鞏固對微生物理論知識的理解和認知[1]，還可以掌握從事微生物學及生物學研究的基本方法和技術(shù)。放線菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察是實驗課中重要的實驗內(nèi)容，以前實驗教學一直采用壓片浸染法和印片浸染法來進行觀察，很難清晰地觀察到放線菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，遠遠無法達到預期的實驗教學效果。因此，亟需對實驗方法進行改進和創(chuàng)新。

探尋一種更簡單有效的方法非常必要。蔡信之[2]在1995年就提出采用插片法觀察放線菌的形態(tài)比印片法和涂片法效果更好，可以觀察到放線菌的基內(nèi)菌絲（營養(yǎng)菌絲）、氣生菌絲和分生孢子的完整自然形態(tài)。汪紅等[3]又提出插片結(jié)合浸染法可以增加放線菌菌絲和孢子與背景的反差，從而提高放線菌形態(tài)觀察的效果并增加實驗的趣味性，并且插片浸染法憑借其優(yōu)勢還在放線菌的篩選鑒定和掃描電鏡樣品的制備中得到廣泛應用[4-7]。但是傳統(tǒng)的插片法接種時是先將無菌的蓋玻片以約60°角度插入平板培養(yǎng)基上，再用接種環(huán)取孢子接種于蓋玻片與培養(yǎng)基內(nèi)側(cè)基部結(jié)合處[3]，這種方法接種慢、難度大。因此，本研究在此傳統(tǒng)插片法接種方法上進行了改進，采用先接種后插片的方法，大大降低了實驗準備的操作難度并提高了工作效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院水產(chǎn)養(yǎng)殖國家級實驗教學示范中心保存的紫色直絲鏈霉菌（Streptomyces violaceorectus）。

1.1.2 培養(yǎng)基 無機鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基[6]：可溶性淀粉 10g/L，（NH4）2SO4 2g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4 1g/L，NaCl 1g/L，CaCO3 3g/L，瓊脂1.5%。pH7.0～7.5，1×105Pa高壓蒸汽滅菌20min。

1.1.3 染色液 溶液A：堿性復紅（堿性品紅）0.3g，酒精（95%）10mL，用研缽研磨;溶液B：石碳酸5g、蒸餾水95mL。將溶液A及溶液B進行混合即成石碳酸復紅原液，將原液稀釋5倍用于染色。

1.1.4 無菌蓋玻片 為了方便插片時取片，將25mm×25mm蓋玻片洗凈后單層平放于鋪有濾紙的滅菌盒中，鋪滿蓋玻片后再放1層濾紙，然后繼續(xù)鋪1層蓋玻片，以此類推，鋪好后高壓蒸汽滅菌20min，滅菌結(jié)束后置于干燥箱中60℃烘干備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 放線菌的培養(yǎng) 倒平板：將滅菌之后的無機鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基融化后倒入直徑70mm的無菌培養(yǎng)皿，每個25mL左右，水平放置至凝固，制成厚度約5cm的平板培養(yǎng)基，比正常的培養(yǎng)基要厚，這樣蓋玻片與培養(yǎng)基的接觸面積就會變大。接種：接種環(huán)滅菌后挑取適量紫色直絲鏈霉菌孢子在平板上先從中間橫向接種，然后旋轉(zhuǎn)平板與其垂直方向均勻密實之字劃線（見圖1），以方便后面插片操作。與之前的先插片后接種相比，采用先接種后插片的操作方法可以在相同的平皿相同時間內(nèi)中做更多的插片，并且接種的操作較之前也更方便。插片：鑷子灼燒滅菌冷卻后夾取無菌蓋玻片橫跨劃線線條以與培養(yǎng)基成30°～45°夾角插入固體培養(yǎng)基中（見圖1），夾角不宜過大，否則培養(yǎng)皿蓋子無法蓋好。插片數(shù)量按需而定，一般直徑70mm的平皿可以插25mm×25mm蓋玻片8～10片。插片結(jié)束后倒置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～5d，以滿足實驗教學要求。

1.2.2 放線菌的染色和鏡檢 取片：用鑷子小心夾取菌片，除去多余的培養(yǎng)基，操作過程中動作要輕，以免破壞菌片。浸染：將菌片以一定的角度慢慢放在滴有石碳酸復紅染液的載玻片上（避免產(chǎn)生氣泡）浸染1min左右。鏡檢：用吸水紙將蓋玻片上多余的染液吸干凈，然后在顯微鏡下進行觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

壓片浸染法是用鑷子夾取菌落邊緣放在染液里再用鑷子進行壓片，由于缺乏經(jīng)驗，力度難以控制和取樣方法不好，導致在顯微鏡下觀察到的菌絲層疊在一起，很難分辨清楚基內(nèi)菌絲和氣生菌絲。印片浸染法則只能看到孢子絲和孢子的形態(tài)，偶爾可以觀察到氣生菌絲（表1）。而采用改進之后的插片浸染法能夠發(fā)現(xiàn)菌絲體和孢子圖像背景層次分明、結(jié)構(gòu)清晰。由圖2可知，紫色直絲鏈霉菌是由分枝狀菌絲組成，并且能很好地區(qū)分營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲和孢子?；鶅?nèi)菌絲著色淡、無隔膜、不斷裂、波曲狀;氣生菌絲同樣無隔膜、不斷裂、波曲狀，但著色較深，且比基內(nèi)菌絲粗;當氣生菌絲發(fā)育到一定程度，其頂端可分化形成孢子絲（繁殖菌絲）;孢子成熟后通過橫割分裂的方式產(chǎn)生成串的分生孢子，孢子為橢圓形或短桿狀。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，采用改進的插片接種方法較傳統(tǒng)接種方法有更多優(yōu)點。連續(xù)3年采用改進的插片浸染法進行放線菌形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，老師和學生均反映改進的插片浸染法優(yōu)于之前的壓片浸染法和印片浸染法，實驗效果好、成功率高、節(jié)約時間，并且可以激發(fā)學生探索微觀世界的興趣，提高教學效率和效果。

參考文獻

[1]譚鳳霞，彭本英，羅靜波.水產(chǎn)微生物學實驗教學體系的構(gòu)建與實踐[J].長江大學學報（自然版），2011（8）：270-272.

[2]蔡信之.插片法觀察放線菌霉菌效果好[J].實驗教學與儀器，1995（2）：28.

[3]汪紅，解麗芳，王甜，等.用浸染法提高放線菌形態(tài)觀察的效果[J].西華師范大學學報（自然科學版），2011（3）：256-258.

[4]劉華松，陳羽，戴偉巧，等.1株產(chǎn)α-糖苷酶抑制劑放線菌的篩選與鑒定[J].微生物學雜志，2017（2）：58-61.

[5]涂璇，黃麗麗，高小寧，等.黃瓜內(nèi)生放線菌的分離、篩選及其活性菌株鑒定[J].植物病理學報，2008（3）：244-251.

[6]李應祥，王為鎮(zhèn)，談孝鳳，等.茶云紋葉枯病拮抗放線菌的篩選[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2014（32）：11339-11341.

[7]楊瑞，王歧，張露，等.放線菌掃描電鏡樣品制備方法比較研究[J].電子顯微學報，2014（1）：84-89.

（責編：徐世紅）