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    miR-205-5p負(fù)靶向調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子A對子宮內(nèi)膜異位癥的影響

    2022-02-04 09:28:22閔逸飛應(yīng)小燕
    東南國防醫(yī)藥 2022年6期
    關(guān)鍵詞:異位癥質(zhì)粒基質(zhì)

    閔逸飛,應(yīng)小燕

    0 引 言

    子宮內(nèi)膜異位癥是一種良性的婦科炎癥性疾病,子宮內(nèi)膜組織異常,育齡婦女發(fā)病率高,高達(dá)10%[1]。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示,育齡婦女子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病率高達(dá)15%,全球患者數(shù)量超過2億,近年來發(fā)病率逐年上升。治療方案主要是藥物治療和手術(shù)治療,但藥物治療的不良反應(yīng)普遍比較大,手術(shù)治療風(fēng)險(xiǎn)高,并發(fā)癥多[2]。有文獻(xiàn)報(bào)道,miRNAs在乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等多種婦科疾病中起調(diào)控作用,但在子宮內(nèi)膜異位癥中的研究較少[3-5]。miR-205-5p在子宮內(nèi)膜異位癥患者中表達(dá)降低,且通過靶向子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的 ANGPT2 抑制人類子宮內(nèi)膜異位癥的進(jìn)展[6],但其作用機(jī)制尚不完全清楚。眾所周知,miRNAs通常與其靶mRNA共同作用,通過mRNA的降解影響癌癥的發(fā)生發(fā)展[7]。血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)屬于血小板衍生生長因子(PDGF)/血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)家族,以二硫鍵連接的同二聚體形式存在[8]。此外,VEGFA可誘導(dǎo)血管生成,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移,抑制細(xì)胞凋亡,并參與內(nèi)皮細(xì)胞的生理和病理生物學(xué)過程[7]。本研究旨在探討miR-205-5p通過靶向VEGFA對子宮內(nèi)膜異位癥患者異常表達(dá)的影響機(jī)制,為子宮內(nèi)膜異位癥的治療提供理論的依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 臨床樣本收集2019年8月-2020年12月因良性婦科疾病在南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院60例行子宮切除術(shù)患者的組織和血清樣本,將患者樣本分為子宮內(nèi)膜異位癥(EC)組(n=30)與正常子宮內(nèi)膜(EN)組(n=30),接受激素治療或同時(shí)患有惡性腫瘤的患者被排除在外。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號(hào):[2019]YLB016)。

    1.2 主要試劑與設(shè)備RIPA裂解液(KL131008250)和雙熒光素酶報(bào)告試劑盒(RG027)及Tunel試劑盒(C1098)均購自上海碧云天生物科技有限公司。Trizol試劑盒(15596-026)購自Invitroge。熒光定量PCR儀(7300)購自美國ABI公司,顯微鏡是上海光學(xué)儀器廠生產(chǎn)。

    1.3 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞獲取及處理收集子宮內(nèi)膜組織,用PBS沖洗3次,用無菌眼剪切破碎,加入5 mLI型膠原酶(1 mg/mL),在37 ℃培養(yǎng)箱中消化60 min,每20 min攪拌一次。然后將混合的細(xì)胞懸液通過200和400目不銹鋼細(xì)胞過濾器進(jìn)行過濾。然后在DMEM/F-12培養(yǎng)基和37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    使用免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色鑒定子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞純度。用0.3%Triton-X-100 37 ℃孵育30 min,4%甲醛固定30 min,用5%牛血清白蛋白室溫封閉20 min,然后用波形蛋白一抗(ab8978和Abcam)抗體4 ℃過夜。使用一抗孵育之后,分別采用0.3%Triton-X-100和PBS沖洗3~4次,加入一抗所對應(yīng)的二抗,37 ℃的環(huán)境下孵育40 min。最后,加入100 μL 4,6-生物胺-2-苯甲酰(DAPI)15 min,沖洗,甘油密封,熒光顯微鏡觀察。

    使用轉(zhuǎn)染技術(shù)在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-205-5p模擬,將細(xì)胞分為NC模擬組、miR-205-5p模擬組、NC模擬+質(zhì)粒組、miR-205-5p模擬+質(zhì)粒組和miR-205-5p模擬+VEGFA組。

    1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測mRNA的表達(dá)量利用RT-PCR技術(shù)檢測組織、細(xì)胞和血液樣本中miR-205-5p的表達(dá)。使用Trizol試劑提取組織、細(xì)胞和血液樣本中的總RNA。使用SYBRGreen定量PCR試劑盒完成PCR反應(yīng),反應(yīng)的體系及反應(yīng)的條件,均按照試劑盒的說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn),并放置實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,并采用2-ΔΔCt計(jì)算相關(guān)因子的表達(dá)量。

    1.5 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將不同方法處理的細(xì)胞接種于96孔的反應(yīng)板中,接種后,分別于24 h、48 h、72 h后加入CCK-8的溶液,并放置酶標(biāo)儀中進(jìn)行檢測。

    1.6 采用5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(Edu)法檢測細(xì)胞增殖情況將細(xì)胞濃度調(diào)整到1×106/mL,以每孔500 μL接種于,預(yù)覆蓋玻片的24孔板中,培養(yǎng)基每3 d更換一次。在每個(gè)設(shè)定時(shí)間點(diǎn)前2 h,加入50 μLEdU培養(yǎng)物,沖洗細(xì)胞,加入細(xì)胞固定液。按照EdU試劑盒的說明書進(jìn)行染色,并拍照并計(jì)數(shù)。

    1.7 蛋白印跡法檢測增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)采用蛋白印跡法檢測增殖[增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、Ki67]相關(guān)蛋白和凋亡(Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。加入含PMSF(Bio-Rad)的細(xì)胞裂解液,冰下裂解細(xì)胞20 min,4 ℃,離心5 min,收集上清液,使用BCA試劑盒測定蛋白濃度,進(jìn)行蛋白定量。10%SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜上,5%的脫脂奶粉封閉,加入一抗,4 ℃孵育過夜。加入一抗對應(yīng)的二抗孵育2 h,用TBST洗滌顯影。利用ImageJ軟件對其灰度值進(jìn)行分析。

    1.8 細(xì)胞凋亡根據(jù)凋亡試劑盒說明,在不同方法處理的細(xì)胞中加入緩沖液,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含有5 μL AnnexinV/FITC和10 μL碘化丙啶的流動(dòng)管中,室溫孵育0.5 h,流式細(xì)胞術(shù)分析。

    1.9 劃痕實(shí)驗(yàn)將不同方法處理的細(xì)胞接種于6個(gè)孔的反應(yīng)板中,培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞滿85%時(shí),使用微采樣器垂直交叉,PBS洗滌,加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基,在37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察并記錄了細(xì)胞的遷移情況。使用ImageJ軟件從6~8條水平線中計(jì)算細(xì)胞間距離的平均值。

    1.10 Transwell實(shí)驗(yàn)在Transwell上室中加入200 μL不同方法處理的細(xì)胞懸液,下室中加入600 μL10%胎牛血清培養(yǎng)基。孵育24 h后,固定中性甲醛,染色1%結(jié)晶紫,顯微鏡下計(jì)算NC模擬組、miR-205-5p模擬組、NC模擬+質(zhì)粒組、miR-205-5p模擬+質(zhì)粒組和miR-205-5p模擬+VEGFA組細(xì)胞數(shù)量。

    1.11 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)使用雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega)檢測細(xì)胞中熒光素酶的反應(yīng)強(qiáng)度,使用相對熒光素酶活性(%)表示絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)基因的表達(dá)水平。

    1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,使用配對t檢驗(yàn)比較miR-205-5p在正常和異位子宮內(nèi)膜組織和血清中的表達(dá)差異。使用非配對t檢驗(yàn)比較兩組獨(dú)立樣本之間的差異性。使用單因素方差分析兩組及以上的差異性。使用雙因素方差分析CCK-8實(shí)驗(yàn)不同組間的差異性。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 miR-205-5p在組織和血液中的表達(dá)與正常子宮內(nèi)膜(EN)組相比,子宮內(nèi)膜異位癥(EC)組患者的組織和血液中miR-205-5p的表達(dá)明顯降低(P<0.01),見圖1。

    a:組織樣本;b:血液樣本

    2.2 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞純度檢測培養(yǎng)24 h后,細(xì)胞大多數(shù)呈梭形,細(xì)胞生長達(dá)滿視野需要7 d,傳代后細(xì)胞生長達(dá)滿視野需要3 d。通過免疫熒光鑒定出兩種細(xì)胞的特性,波形蛋白(vimentin)陽性是基質(zhì)細(xì)胞,角蛋白(cytokeratin)陽性是上皮細(xì)胞,見圖2。

    圖2 Vimentin/Cytokeratin免疫熒光染色鑒定分離的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(×400)

    2.3 miR-205-5p對異位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響RT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-205-5p模擬后,miR-205-5p的表達(dá)顯著提高(P<0.01)。CCK8、EdU和Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與NC模擬組相比,miR-205-5p模擬組細(xì)胞活力和增殖下降(P<0.01),細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白(PCNA、Ki67)水平降低(P<0.01)。提示miR-205-5p顯著抑制子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖和活力。見圖3。

    a:RT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率;b:CCK-8檢測細(xì)胞活力;c:EdU檢測細(xì)胞增殖;d:Western blot檢測增殖相關(guān)蛋白

    流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,與NC模擬組相比,miR-205-5p模擬組細(xì)胞凋亡增加(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9)表達(dá)升高(P<0.01),Bcl-2表達(dá)降低(P<0.01)。提示miR-205-5p促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞凋亡。見圖4。

    a:流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡;b:Western blot檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白

    2.4 miR-205-5p對異位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞遷移侵襲的影響進(jìn)一步使用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell來檢測miRi-205-5p過表達(dá)對子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響。結(jié)果顯示,miR-205-5p模擬組子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降低(P<0.01)。與NC模擬組相比,miR-205-5p組的遷移和侵襲相關(guān)蛋白(Cox-2、MMP-2和MMP-9)的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。提示miR-205-5p可抑制子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的遷移和侵襲。見圖5。

    a:遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力;b:Transwell檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力;c:Western blot實(shí)驗(yàn)檢測遷移與侵襲相關(guān)蛋白

    2.5 miR-205-5p的下游靶基因篩選及鑒定結(jié)果使用生物信息學(xué)來預(yù)測miR-205-5p的結(jié)合位點(diǎn),見圖6。并使用雙熒光素酶報(bào)告基因分析來驗(yàn)證VEGFA是miR-205-5p的靶點(diǎn),見圖7。與健康個(gè)體相比,子宮內(nèi)膜異位癥組織中VEGFA的表達(dá)明顯增加(P<0.01),見圖8,提示miR-205-5p可能負(fù)調(diào)控VEGFA。RT-PCR和免疫印跡檢測顯示,過表達(dá)miR-205-5p后,子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中VEGF的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),見圖9、圖10。這表明VEGFA是miR-205-5p的一個(gè)靶點(diǎn),并受到負(fù)調(diào)控。

    圖6 生物信息學(xué)預(yù)測miR-205-5p 的靶標(biāo)

    *P<0.01

    *P<0.01

    *P<0.01

    *P<0.01

    2.6 拯救實(shí)驗(yàn)探索miR-205-5p和VEGFA對子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的影響的結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染過表達(dá)VEGFA質(zhì)粒后,VEGFA在細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高;CCK8和EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與miR-205-5p模擬+質(zhì)粒組相比,miR-205-5p模擬+VEGFA組的細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖顯著升高(P<0.01);見圖11。

    a:RT-PCR檢測VEGFA的表達(dá);b:CCK-8檢測細(xì)胞活力;c:EdU檢測細(xì)胞增殖

    流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,與miR-205-5p模擬+質(zhì)粒組相比,miR-205-5p模擬+VEGFA組的細(xì)胞的凋亡顯著降低(P<0.01),見圖12。提示VEGFA的過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)miR-205-5p過表達(dá)引起的細(xì)胞的凋亡升高。

    與NC模擬+質(zhì)粒組相比,*P<0.01;與miR-205-5p模擬+質(zhì)粒組相比,#P<0.01

    Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與miR-205-5p模擬+質(zhì)粒組相比,miR-205-5p模擬+VEGFA組的細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著降低,見圖13。提示VEGFA的過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)miR-205-5p過表達(dá)引起的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的降低,以及細(xì)胞凋亡的升高。即miR-205-5p通過負(fù)調(diào)控VEGFA抑制細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲,降低細(xì)胞的活力,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

    a:Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移和侵襲;b:劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移

    3 討 論

    子宮內(nèi)膜異位癥(EM)是一種與雌激素相關(guān)的慢性良性婦科疾病,主要癥狀為痛經(jīng)、盆腔疼痛,可引起不孕,育齡婦女較高,易復(fù)發(fā),并發(fā)癥較多[9]。EM具有生長迅速、侵襲性強(qiáng)、多器官轉(zhuǎn)移等類似惡性腫瘤的特點(diǎn)。關(guān)于其發(fā)病機(jī)制有多種理論,但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚[10-11]。

    微小RNA(miRNA)是一組由18~25個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈RNA,在轉(zhuǎn)錄調(diào)控后水平調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)中起關(guān)鍵作用[12]。有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA在多種細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,影響腫瘤細(xì)胞的分化、凋亡、遷移[13-14]。研究發(fā)現(xiàn),肺癌、肝癌、乳腺癌等常見的惡性腫瘤的發(fā)生可能與miRNA的異常表達(dá)有關(guān)[1]。有文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn),在子宮內(nèi)膜異位癥患者中,miR-34a-5p和AKT1基因的表達(dá)水平在子宮內(nèi)膜組織中呈負(fù)相關(guān),提示miR-34a-5p可能通過靶向AKT1基因影響子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖和自噬,并影響細(xì)胞的遷移及侵襲能力,進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病[15-16]。miR-205-5p在子宮內(nèi)膜異位癥患者的組織和血清中的表達(dá)與健康者相比顯著降低[6]。

    為了進(jìn)一步研究miR-205-5p對基質(zhì)細(xì)胞的增殖凋亡的影響。本研究采用轉(zhuǎn)染技術(shù),以子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞為研究對象,轉(zhuǎn)染miR-205-5p模擬,過表達(dá)miR-205-5p。結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-205-5p后,細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖降低,相反,細(xì)胞的凋亡增加。Ki67和PCNA屬于腫瘤細(xì)胞的增殖因子[17-18],可以作為指標(biāo)來評估細(xì)胞的增殖狀態(tài)[19-20]。Bcl-2、Bax、裂解半胱天冬3和裂解半胱天冬9蛋白是細(xì)胞凋亡的重要因素,Bcl-2表達(dá)升高提示抑制凋亡,而Bax、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表達(dá)升高可促進(jìn)凋亡[21-22]。過表達(dá)miR-205-5p后細(xì)胞的增殖相關(guān)蛋白(PCNA、Ki67)水平降低,凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9)的表達(dá)升高,Bcl-2的表達(dá)下降。提示miR-205-5p促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的凋亡,抑制其增殖和活力。

    細(xì)胞的遷移和侵襲是一個(gè)復(fù)雜過程,受黏附因子的調(diào)控,從而實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)的遷移和侵襲[23-24]。文獻(xiàn)報(bào)道表明,環(huán)氧化物酶Cox-2可上調(diào)MMPs的表達(dá),促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[25]。在子宮內(nèi)膜異位癥的研究中,MMP-9和 MMP-2可以作為子宮內(nèi)膜異位癥組織或者細(xì)胞侵襲能力檢測指標(biāo)之一[26]。本研究結(jié)果表明,miR-205-5p過表達(dá)抑制子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞遷移與侵襲相關(guān)蛋白(Cox-2、MMP-2、MMP-9)的表達(dá)。提示miR-205-5p降低子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

    先前研究發(fā)現(xiàn)VEGFA在子宮內(nèi)膜異位癥組織和細(xì)胞中顯著高表達(dá),miR-17-5p可以通過負(fù)調(diào)控VEGFA的表達(dá)來抑制子宮內(nèi)膜異位癥中的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[7]。本研究進(jìn)一步研究證實(shí)VEGFA的過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)miR-205-5p過表達(dá)引起的細(xì)胞增殖的降低,細(xì)胞遷移和侵襲能力的降低。

    綜述所述,miR-205-5p通過負(fù)調(diào)控VEGFA抑制細(xì)胞的增殖,降低細(xì)胞的活力,促進(jìn)其凋亡,同樣降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

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