Nrf2/HO-1信號(hào)通路在急性肺損傷中的研究進(jìn)展

孔凱文,孟 巖綜述，鄧小明審校

0 引 言

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS)是由于肺泡-毛細(xì)血管屏障通透性增加導(dǎo)致的雙側(cè)肺水腫和低氧血癥的急性發(fā)作，因高死亡率和缺乏有效的治療藥物一直備受關(guān)注[1]。ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制尚未完全了解，目前認(rèn)為氧化應(yīng)激和劇烈的炎癥反應(yīng)在ALI/ARDS進(jìn)展種扮演著重要角色[2]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2)是細(xì)胞內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，被激活后可促進(jìn)抗氧化酶和解毒酶的表達(dá)，在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)、代謝平衡和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用[3]。血紅素加氧酶1(heme oxygenase，HO-1)是Nrf2的其中一個(gè)下游，是血紅素代謝過程的限速酶，具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等多種作用[4]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2/HO-1信號(hào)通路在ALI/ARDS中能夠減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，抑制細(xì)胞焦亡和鐵死亡，進(jìn)而減輕肺損傷。本文就Nrf2/HO-1信號(hào)通路在ALI/ARDS的研究進(jìn)展作一綜述，以期為ALI/ARDS的治療和特效藥物的研發(fā)提供新的思路。

1 ALI/ARDS的定義

1967年，Ashbaugh等[5]通過一份病例報(bào)告對(duì)ARDS進(jìn)行了初步描述，這份病例報(bào)告描述了成人危重癥患者出現(xiàn)急性低氧血癥、非心源性肺水腫、肺順應(yīng)性降低、呼吸做功增加以及需要正壓通氣等臨床癥狀，這些癥狀的出現(xiàn)與一些臨床疾病相關(guān)，如胸部外傷、肺炎、膿毒癥和誤吸等。在這之后提出并使用了多種定義，直至1994年,美國-歐洲共識(shí)會(huì)議(the American-European Consensus Conference，AECC)的定義發(fā)表。AECC將ARDS定義為急性低氧血癥(PaO2/FIO2≤ 200 mmHg)，后前位胸片示雙側(cè)肺浸潤影，臨床無左心房高壓的證據(jù)；AECC還引入了急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的概念，采用的標(biāo)準(zhǔn)和ARDS類似，但低氧血癥相對(duì)較輕(PaO2/FIO2≤ 300 mmHg)[6]。2012年歐洲重癥醫(yī)學(xué)年會(huì)對(duì)這一定義進(jìn)行了更新，制定了柏林定義，根據(jù)氧合水平，將ARDS分為輕度(200 mmHg

2 ALI/ARDS的病因和發(fā)病機(jī)制

ALI/ARDS的常見病因和危險(xiǎn)因素分為兩種：①直接因素，肺炎(細(xì)菌和病毒，真菌較少見)、胃內(nèi)容物誤吸和外傷(如肺挫傷)、缺血-再灌注損傷(體外循環(huán)和肺切除術(shù)后)、呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷、溺水(誤吸海水或淡水)以及吸入煙霧或有毒氣體等；②間接因素，由其他系統(tǒng)性疾病所致的肺損傷，如非肺源性膿毒癥、急性胰腺炎、輸血相關(guān)急性肺損傷以及失血性休克等[2]。

目前ALI/ARDS的病理機(jī)制尚未完全了解，但已有研究證明氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在ALI/ARDS的病理過程中扮演著十分重要的角色。各種損傷性刺激，如細(xì)菌、病毒、高氧、胃內(nèi)容物誤吸以及呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷等均會(huì)直接破壞肺組織，同時(shí)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，從而對(duì)肺組織造成二次損傷。首先，損傷性刺激會(huì)激活Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages，AMs)表面的Toll樣受體，誘導(dǎo)趨化因子的分泌，從而將循環(huán)中的免疫細(xì)胞募集到肺泡內(nèi)[8]。中性粒細(xì)胞遷移穿過肺泡上皮后，釋放毒性介質(zhì)，包括蛋白酶、活性氧(reactive oxygen species，ROS)以及中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)(neutrophil extracellular traps，NETs)[9]。中性粒細(xì)胞在宿主免疫反應(yīng)中扮演著重要角色，但其釋放的毒性介質(zhì)同時(shí)損傷了肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮和肺泡上皮。肺泡上皮損傷還包括肺泡上皮細(xì)胞質(zhì)膜的損傷，這可能是細(xì)菌釋放的成孔毒素、高氧和機(jī)械拉伸等引起的[10]。此外，血管內(nèi)皮鈣粘蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)的穩(wěn)定性降低，肺泡毛細(xì)血管通透性增加[11]。這會(huì)導(dǎo)致大量紅細(xì)胞滲出并釋放出血紅蛋白，血紅蛋白分解后引起肺泡內(nèi)游離血紅素水平增加，加劇氧化應(yīng)激損傷[12]。總之，以上因素綜合作用增加了肺泡-毛細(xì)血管屏障的通透性，進(jìn)一步促進(jìn)了炎性細(xì)胞的遷移，同時(shí)更多富含蛋白質(zhì)的水腫液流入肺泡腔，顯著影響了氣體交換，最終導(dǎo)致患者低氧血癥，需要機(jī)械通氣。隨著病程進(jìn)展，肺泡毛細(xì)血管損傷和肺間質(zhì)水腫逐漸加重，CO2排出能力下降，從而引發(fā)高碳酸血癥，這也是ALI/ARDS患者肺死腔增加的原因[13]。此外，ALI/ARDS期間，許多內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制也受到了特異性抑制。例如低氧血癥、高碳酸血癥和流感病毒等其他因素會(huì)下調(diào)鈉離子通道和/或下調(diào)Na+/K+-ATP酶的活性，導(dǎo)致ALI/ARDS患者的肺泡液清除功能受損[14]。高碳酸血癥還會(huì)抑制肺泡上皮細(xì)胞的增殖，影響肺組織的自我修復(fù)[15]。

3 Nrf2/HO-1信號(hào)通路的活化

Nrf2/HO-1信號(hào)通路活化的關(guān)鍵是提高Nrf2的活性，這取決于其蛋白質(zhì)水平，因此通過調(diào)控Nrf2蛋白的合成和降解過程可改變其活性。在正常生理狀態(tài)下，Nrf2存在于細(xì)胞質(zhì)中，Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)分別與Nrf2的DLG模體和ETGE模體結(jié)合，其中與ETGE模體的親和性較高，而與DLG模體的親和性較低[16]。Cullin 3(CUL3)以支架蛋白的形式與Keap1的BTB結(jié)構(gòu)域結(jié)合共同形成E3泛素連接酶復(fù)合體，然后該復(fù)合體通過Keap1特異性識(shí)別Nrf2并介導(dǎo)其泛素化，泛素化后的Nrf2被26S蛋白酶體降解[17]。這種降解機(jī)制使得細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2蛋白維持在一個(gè)較低的水平，確保只有一小部分新合成的Nrf2可到達(dá)細(xì)胞核以調(diào)節(jié)靶基因的基礎(chǔ)表達(dá)。當(dāng)外界刺激存在時(shí)，如ROS、親電子試劑和來自三羧酸循環(huán)以及糖酵解過程的中間代謝產(chǎn)物等，可迅速對(duì)Keap1內(nèi)的半胱氨酸殘基進(jìn)行氧化修飾，以解除其對(duì)Nrf2的抑制作用[18]。先前認(rèn)為Keap1與DLG 模體結(jié)合的喪失是Nrf2蛋白穩(wěn)定性和氧化應(yīng)激期間水平增加的主要途徑，但最近一項(xiàng)關(guān)于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究表明，親電子試劑不影響Keap1與Nrf2的DLG模體或ETGE模體的結(jié)合[19]。Keap1內(nèi)半胱氨酸殘基的氧化使其無法招募E3連接酶進(jìn)行Nrf2的泛素化，Nrf2的半衰期隨之延長，在細(xì)胞質(zhì)種逐漸蓄積。此外，自噬蛋白p62是解除Keap1對(duì)Nrf2的抑制作用的另一個(gè)機(jī)制。p62通常會(huì)標(biāo)記受損的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器以供自噬體識(shí)別，然后在溶酶體中進(jìn)行降解。p62蛋白中的STGE模體與Nrf2的ETGE模體結(jié)構(gòu)相似，也可與Keap1結(jié)合[20]。PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路的激活會(huì)誘發(fā)STGE模體中Ser349的磷酸化，使p62與Keap1結(jié)合得更緊密，然后通過自噬增加Keap1的降解[21]。因此，自噬過程常常伴隨著Nrf2蛋白的積累。

Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中蓄積后進(jìn)入細(xì)胞核，與小Maf蛋白形成異二聚體，然后共同與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response elements，ARE)結(jié)合[22]。在許多抗氧化基因和解毒基因的啟動(dòng)子區(qū)域中都包含ARE，均可被Nrf2激活后，因此Nrf2在保護(hù)細(xì)胞免受外界刺激損傷的過程中扮演在重要角色。HO-1是Nrf2的其中一個(gè)下游，作為一種應(yīng)激蛋白和代謝酶，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、免疫防御以及炎癥反應(yīng)，在多種急性器官損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。近來的研究表明，ALI/ARDS患者的肺泡內(nèi)血紅蛋白和游離血紅素的水平顯著增高，加劇了氧化應(yīng)激損傷和Toll樣受體激活后引發(fā)的炎癥反應(yīng)[12]。HO-1是血紅素降解過程的限速酶，能夠催化血紅素降解為膽綠素(biliverdin，BV)、Fe2+和一氧化碳(carbon monoxide，CO)[4]。然后，BV在膽綠素還原酶的作用下轉(zhuǎn)化為膽紅素(bilirubin，BR)，BV和BR均有很強(qiáng)的抗氧化活性，新的研究還發(fā)現(xiàn)BR具有免疫調(diào)節(jié)作用以及對(duì)脂質(zhì)代謝過程的調(diào)控作用[23]。Fe2+具有促氧化作用，但當(dāng)它合成鐵蛋白后具有抗氧化活性，能夠發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[24]。CO可改善線粒體功能，從而調(diào)節(jié)下游信號(hào)通路，最終產(chǎn)生抗凋亡、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[25]。

在正常生理狀態(tài)下，肺組織內(nèi)存在一定水平的Nrf2和HO-1，這對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)十分重要。目前，已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2/HO-1信號(hào)通路通過清除過量的ROS、抑制細(xì)胞因子風(fēng)暴、鐵死亡和細(xì)胞焦亡，在多種因素誘發(fā)的ALI/ARDS中發(fā)揮保護(hù)作用。

4 Nrf2/HO-1信號(hào)通路在ALI/ARDS中的保護(hù)作用

革蘭陰性菌感染是誘發(fā)ALI/ARDS的重要原因之一，革蘭陰性菌外膜的主要成分脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，可引起劇烈的炎癥反應(yīng)。在經(jīng)氣管內(nèi)注射LPS誘發(fā)ALI/ARDS的小鼠模型中，炎癥反應(yīng)在2～4 h內(nèi)發(fā)生，并在24～48 h達(dá)到高峰，小鼠肺組織表現(xiàn)為彌漫性肺泡損傷、中性粒細(xì)胞浸潤和肺水腫[26]。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2/HO-1信號(hào)通路的激活可以減輕LPS誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，包括抑制AMs和肺泡上皮細(xì)胞釋放炎性因子(如IL-6、IL-1β和TNF-α等)，以及減少中性粒細(xì)胞的遷移等，從而減輕肺水腫[27]。LPS誘發(fā)ALI/ARDS的另一個(gè)重要機(jī)制是氧化應(yīng)激，而且ROS的病理性增加還會(huì)加劇炎癥反應(yīng)，因此抑制氧化應(yīng)激是減輕肺損傷的關(guān)鍵。在LPS誘發(fā)ALI/ARDS的小鼠模型中，Nrf2/HO-1信號(hào)通路被激活后可顯著逆轉(zhuǎn)LPS誘發(fā)的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的表達(dá)減少，同時(shí)清除過量生成的ROS，從而減輕氧化應(yīng)激損傷，減輕肺水腫，促進(jìn)肺泡-毛細(xì)血管屏障的修復(fù)[28]。目前，對(duì)于Nrf2/HO-1信號(hào)通路在ALI/ARDS中發(fā)揮抗炎和抗氧化作用的具體機(jī)制尚未完全了解，還需要更多的研究對(duì)這些機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)闡述。已有研究報(bào)道，Nrf2/HO-1信號(hào)通路被激活后，能夠抑制肺泡上皮細(xì)胞中炎性小體NLRP3的活化，進(jìn)而抑制了其下游caspase1的激活，一方面中斷了炎性因子IL-1β和IL-18的成熟和釋放，另一方面抑制了GSDMD的裂解，從而減少了細(xì)胞焦亡[29]。此外，最近研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡也是ALI/ARDS病程進(jìn)展的機(jī)制之一，而Nrf2/HO-1信號(hào)通路的激活可以明顯降低肺組織中的Fe2+濃度，提高GSH-Px和谷胱甘肽(glutathione，GSH)的水平和活性，抑制脂質(zhì)過氧化，從而減少了肺泡上皮細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生。

除LPS之外，Nrf2/HO-1信號(hào)通路在其它直接因素誘發(fā)的ALI/ARDS中也可通過抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激來減輕肺損傷。如在葡聚糖凝膠誘導(dǎo)的大鼠肺損傷模型中，Nrf2/HO-1信號(hào)通路能夠抑制肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，包括ICAM-1和VCAM-1，以減少炎性細(xì)胞黏附、游走和浸潤，以減輕炎癥反應(yīng)和肺水腫[31]。機(jī)械通氣(mechanical ventilation，MV)是危重患者發(fā)生呼吸衰竭常用的救治方法，但MV會(huì)在一定程度上加重肺損傷，即呼吸機(jī)誘發(fā)性肺損傷(ventilator induced lung injury，VILI)。Xu等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2/HO-1信號(hào)通路被激活后可減輕VILI中的炎癥反應(yīng)，通過抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而抑制其下游炎性因子的釋放，包括TNF-α、IL-1β 和IL-6等。肺缺血/再灌注損傷(lung ischemia/reperfusion injury，LIRI)多發(fā)生于肺栓塞、體外循環(huán)和肺移植術(shù)后，與患者的不良預(yù)后相關(guān)。研究表明，Nrf2/HO-1信號(hào)通路的激活可以有效抑制caspase-1/GSDMD通路引發(fā)的巨噬細(xì)胞焦亡[33]，同時(shí)還能夠提高SOD、GSH-PX 和過氧化氫酶等抗氧化酶的水平和活性，以消除反應(yīng)性自由基，恢復(fù)氧化和抗氧化反應(yīng)之間的平衡[33]。ALI/ARDS也是是海水淹溺最常見的并發(fā)癥，低溫、高滲的海水進(jìn)入肺內(nèi)后，破壞肺泡-毛細(xì)血管屏障，誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致低氧血癥和肺水腫。有文獻(xiàn)報(bào)道，在海水淹溺性肺損傷小鼠模型中，使用富馬酸二甲酯激活Nrf2后，HO-1的表達(dá)隨之增加，進(jìn)而清除了肺內(nèi)過量生成的ROS，同時(shí)抑制了脂質(zhì)過氧化，肺泡上皮細(xì)胞鐵死亡減少[34]。除發(fā)揮抗炎和抗氧化作用外，HO-1還可通過促進(jìn)細(xì)胞再生，在肺損傷的修復(fù)期也發(fā)揮著重要作用[35]。

此外，在由其他間接因素導(dǎo)致的ALI/ARDS中，Nrf2/HO-1信號(hào)通路也發(fā)揮著重要的保護(hù)作用。Yu等[36]的研究發(fā)現(xiàn)在經(jīng)盲腸結(jié)扎術(shù)誘發(fā)的膿毒癥肺損傷小鼠模型中，Nrf2被活化后進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)其下游HO-1的表達(dá)，HO-1蛋白水平的增加能夠抑制巨噬細(xì)胞釋放晚期促炎因子HMGB1，以減輕炎癥反應(yīng)。還有研究報(bào)道，在急性胰腺炎誘發(fā)的ALI/ARDS中，Nrf2/HO-1信號(hào)通路被激活后也可通過抑制肺泡上皮細(xì)胞種炎性小體NLRP3的活化來減輕炎癥反應(yīng)和肺組織損傷，而使用ML385抑制Nrf2的活性后發(fā)現(xiàn)，HO-1的表達(dá)減少，肺損傷隨之加重[37]。此外，腸缺血/再灌注損傷(intestinal ischemia/reperfusion，II/R)和腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury，CI/RI)常常會(huì)誘發(fā)遠(yuǎn)端器官損傷，肺損傷最為常見。Dong等[38]研究發(fā)現(xiàn)，在Ⅱ/R誘發(fā)的急性肺損傷中，與野生型小鼠相比，Nrf2-/-小鼠肺內(nèi)HO-1的mRNA和蛋白水平降低，膜脂過氧化增加，GSH水平降低，電鏡下觀察到Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞鐵死亡增多。由此可看出，在ⅡR誘發(fā)的肺損傷中，Nrf2/HO-1信號(hào)通路同樣可通過抑制鐵死亡發(fā)揮保護(hù)作用。在CI/RI誘發(fā)的ALI/ARDS中，Nrf2激活后誘導(dǎo)HO-1的基因轉(zhuǎn)錄，可減輕氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)氧化還原穩(wěn)態(tài)恢復(fù)，從而減輕肺損傷[39]。

5 Nrf2/HO-1信號(hào)通路的激活策略

既往研究證明，在ALI/ARDS中，Nrf2/HO-1信號(hào)通路被激活后能夠發(fā)揮抗炎和抗氧化作用，從而減輕肺損傷和肺水腫，改善肺的氣體交換功能。目前，已有多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明Nrf2/HO-1信號(hào)通路是中草藥治療ALI/ARDS的有效靶點(diǎn)。Huang等[27]的研究發(fā)現(xiàn)荔枝草提取物salviplenoid A可促進(jìn)Nrf2的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路。和厚樸酚、人參環(huán)氧炔醇和大黃素也可激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路，但其發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚未明確[29-30,37]。此外，促紅細(xì)胞生成素衍生物螺旋B表面肽、異補(bǔ)骨脂查爾酮和脂氧素受體激動(dòng)劑BML-111等化合物在ALI/ARDS中也可促進(jìn)Nrf2/HO-1信號(hào)通路的激活[28,31-32]。然而，這些治療方式目前還只用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其發(fā)揮作用的具體機(jī)制、使用方法以及安全性等問題，還需要大量的研究。

6 結(jié)語與展望

ALI/ARDS在危重患者中發(fā)病率和死亡率一直居高不下，臨床上仍缺乏有效的治療方法。ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制尚未完全了解，還需要更多的研究來進(jìn)行全面的闡述。目前認(rèn)為炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激及其誘發(fā)的細(xì)胞焦亡和鐵死亡是ALI/ARDS的主要特征。Nrf2/HO-1信號(hào)通路通過清除過量的ROS、抑制細(xì)胞因子風(fēng)暴、鐵死亡和細(xì)胞焦亡，在多種因素誘發(fā)的ALI/ARDS中發(fā)揮保護(hù)作用。因此，Nrf2/HO-1信號(hào)通路有望成為ALI/ARDS治療藥物研發(fā)的新靶點(diǎn)。目前，已有多種中草藥被證明可在ALI/ARDS發(fā)病過程中激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路，但仍處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，其能否用于臨床還有很多問題需要研究和討論。探究減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷的方法以恢復(fù)肺的氣體交換功能仍是未來的研究方向。